靶向MLL1-WDR5蛋白-蛋白相互作用抑制劑的研究進(jìn)展

陳 鑫，楊 倩，尤啟冬，郭小可*

（1中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省藥物分子設(shè)計(jì)與成藥性優(yōu)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211198；2中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198）

表觀遺傳學(xué)是近年來(lái)生命科學(xué)界最熱門(mén)的領(lǐng)域之一，其涉及的生物學(xué)活動(dòng)覆蓋了從胚胎發(fā)育到動(dòng)物毛發(fā)顏色調(diào)節(jié)等各個(gè)環(huán)節(jié)。表觀遺傳還參與眾多疾病的起始、發(fā)展和維持，如：糖尿病［1］、精神疾?。?］、腫瘤［3］等。通過(guò)干涉表觀遺傳調(diào)節(jié)過(guò)程來(lái)調(diào)控疾病的發(fā)展受到藥物化學(xué)家們的關(guān)注［4-5］。表觀遺傳指的是DNA 堿基序列不變的可遺傳性狀變化，包括DNA 修飾、組蛋白修飾、非編碼RNA 修飾、染色質(zhì)重組和核小體定位等［6-7］。其中，組蛋白修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄头核鼗?。在眾多組蛋白修飾中，組蛋白甲基化是研究最為深入的修飾之一［8］。由于組蛋白甲基化異常，導(dǎo)致腫瘤相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄異常，是誘發(fā)腫瘤的重要因素［9］。因此選擇性靶向組蛋白甲基化過(guò)程、逆轉(zhuǎn)基因的異常表達(dá)，成為治療腫瘤的新策略之一。

SET1 家族是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)組蛋白H3 的第4 位賴氨酸（H3K4）甲基化過(guò)程的蛋白家族，因其特有的SET 結(jié)構(gòu)域而得名。SET1 家族可以通過(guò)將甲基載體S-5'-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移至H3K4 而實(shí)現(xiàn)組蛋白的甲基化。SET1 家族成員有MLL1-4（mixed lineage leukemia 1-4）、SET1a 和SET1b，其中MLL1 是研究最為深入的一個(gè)成員。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1 與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，成為近年來(lái)治療腫瘤的熱門(mén)靶標(biāo)［10-13］。目前，已有多種靶向MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的抑制劑被研究和開(kāi)發(fā)，其中部分抑制劑已推進(jìn)至臨床研究階段，如DOT1L（disruptor of telomeric silencing 1-like）抑 制 劑EPZ-5676［14］和MENIN（multiple endocrine neoplasia type 1）抑制劑SNDX-5613［15］。MLL1 和WDR5（WD40 repeat 5）的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）是MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮正常生理功能的基礎(chǔ)，近些年來(lái)成為藥物分子研究的熱點(diǎn)。本文主要針對(duì)MLL1-WDR5 PPI在腫瘤中的重要作用以及其抑制劑的進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，期望能為該領(lǐng)域研究人員提供參考。

1 MLL1-WDR5的生理功能

1.1 野生型MLL1（WT-MLL1）

MLL1 又稱組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2（KMT2A），因其可誘發(fā)混合譜系白血病（mixed lineage leukemia）得名［16］。MLL1 在人體組織中廣泛存在，編碼MLL1 的基因位于11q23 染色體上。在MLL1基因被翻譯后，全長(zhǎng)MLL1蛋白在第2 666/2 667 殘基和第2 718/2 719 處被taspase1 切斷，產(chǎn)生兩個(gè)多肽（N 端多肽和C 端多肽，MLL-C 和MLLN），隨后N 端多肽和C 端多肽分別通過(guò)FYRN 和FYRC 連接形成一個(gè)完整的活性MLL1 蛋白（圖1）［17-22］。

MLL1 的主要生物學(xué)功能是在胚胎發(fā)育、造血和神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白H3K4 的甲基化狀態(tài)，維持下游Hox（homeobox）基因表達(dá)，而Hox基因在造血功能、干細(xì)胞自我更新等生理過(guò)程中起著重要作用［23-24］。MLL1還能識(shí)別二甲基化和三甲 基 化 的H3K4（H3K4me2 和H3K4me3），招 募MLL1 到靶基因，進(jìn)一步激活下游Hox基因的表達(dá)［25-26］。在嬰兒發(fā)育期間，MLL促進(jìn)造血干細(xì)胞的分化，在成人體內(nèi)，MLL 幫助維持血細(xì)胞更新［27］。此外，MLL1 還參與了血管的生成［28］、調(diào)控腫瘤抑制因子以及參與組織生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)節(jié)［29］。

1.2 MLL1融合蛋白

混合譜系白血病基因（MLLgene）是三胸腺果蠅基因（drosophila trithorax）的同源基因［30］。MLL基因可與其他基因重排，這種現(xiàn)象在白血病患者中廣泛存在，約10%的白血病患體內(nèi)存在MLL基因重排現(xiàn)象［31］。MLL基因重排與急性髓性白血?。ˋML）、淋巴性白血?。ˋLL）、雙表型或混合性白血病的發(fā)生密切相關(guān)。MLL基因重排主要發(fā)生在1 歲以下嬰兒（主要為ALL）和中青年患者（主要為AML）中［31］。MLL基因重排有兩種類型：MLL基因特異性突變，包括基因內(nèi)部缺失、部分序列重復(fù)串聯(lián)（partial tandem duplications，MLL-PTD）或MLL全基因重復(fù)［16，24，32］；第二種是由于染色體易位導(dǎo)致11q23 染色體（MLL基因）和其他染色體重組，產(chǎn)生MLL 融合基因（MLL-FP）［19］。MLL重排主要發(fā)生在MLL基因的RD 和PHD 結(jié)構(gòu)域之間。MLL基因可與80 多個(gè)不同的伴侶基因融合，融合的伴侶基因大多數(shù)都編碼轉(zhuǎn)錄因子，誘發(fā)白血病的MLL 融合蛋白主要來(lái)源于6 個(gè)融合基因：MLL-AF4、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-ELL和MLLENL［33］。MLL 融合蛋白缺乏C 端TAD、Win 和SET結(jié)構(gòu)域，因此失去了WT-MLL1-C端的相關(guān)功能，缺乏SET 結(jié)構(gòu)導(dǎo)致MLL-FPs 無(wú)法催化H3K4 甲基化；在WT-MLL1-N 結(jié)構(gòu)中保留AT-鉤（AT-hook）結(jié)構(gòu)域、CXXC 域、MBD 和SNL，使其依然保留了識(shí)別和結(jié)合相關(guān)組蛋白甲基化標(biāo)記的能力（圖1 和圖2）。然而，由于其他伴侶基因的融合，MLL-FPs 從伴侶基因中獲得新的功能［19］。雖然MLL-FPs 誘發(fā)腫瘤的機(jī)制尚未完全確定，但已有研究表明，部分MLLFPs可以通過(guò)調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ，誘導(dǎo)相關(guān)基因異常表達(dá)，繼而誘發(fā)白血?。?4］；MLL-FPs 還通過(guò)招募其他蛋白特異性激活下游基因表達(dá)，導(dǎo)致下游基因表達(dá)異常，進(jìn)而誘導(dǎo)或促進(jìn)白血病進(jìn)程［31，35-36］?？傊?，MLL-FPs可以通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致白血病的發(fā)生，維持白血病的發(fā)展。

圖1 MLL1蛋白翻譯后修飾和MLL1甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物

圖2 染色體重組導(dǎo)致MLL1融合蛋白的形成

1.3 MLL1-WDR5 PPI

WT-MLL1是MLL1-FPs相關(guān)白血病發(fā)生、發(fā)展和維持所不可或缺的。MLL基因重排僅發(fā)生在一個(gè)等位基因上，MLL1-FPs的靶基因是WT-MLL1靶基因的子集。若野生型MLL基因被敲除，僅MLL1-FPs 無(wú)法誘導(dǎo)和維持白血?。?7-39］。首先，MLL1-FPs缺少了WT-MLL1 的C 端部分，缺乏與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)結(jié)構(gòu)域，如PHD3結(jié)構(gòu)域（圖2）。PHD3可識(shí)別并結(jié) 合H3K4me2 和H3K4me3。WT-MLL1 的PHD3通過(guò)與CXXC-PAFc 協(xié)同工作，招募野生型MLL1復(fù)合物到Hox基因，激活Hox基因，并阻止調(diào)控基因表達(dá)的遏制劑“ESET”和Hox基因結(jié)合，創(chuàng)造一個(gè)更適合MLL1-FPs 結(jié)合的染色質(zhì)狀態(tài)。在WTMLL1 存在的情況下，MLL-AF9 等MLL1-FPs 被招募到Hox基因，持續(xù)激活Hox基因進(jìn)而誘導(dǎo)白血病發(fā) 生［25］。H3K4me2 和H3K4me3 標(biāo) 記 需 要WTMLL1 復(fù)合物維持完整的生理功能。H3K4me2 和H3K4me3 標(biāo)記是MLL1-FPs 的主要結(jié)合位點(diǎn)，降低染色質(zhì)H3K4me2 和H3K4me3 水平可以影響MLL1-FPs對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)作用［38-39］。

破壞MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物正常的生理功能，降低H3K4 的甲基化水平，減少M(fèi)LL1-FPs 的結(jié)合位點(diǎn)，從而降低MLL1-FPs 被招募到靶基因的概率是治療融合蛋白誘導(dǎo)的白血病的策略之一。WDR5 是MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心組件，是MLL1 復(fù)合物發(fā)揮正常生理功能的基石之一。WDR5 通過(guò)和MLL1 的Win 序列相互作用，招募MLL1 復(fù)合物的其他成員（RbBP5、Ash2L 和DPY-30）組成功能完整的MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（圖1-B），并穩(wěn)定其構(gòu)象［40-41］。單獨(dú)的MLL1 蛋白只能緩慢地催化H3K4 的單甲基化。在缺乏WDR5 的情況下，即使其他MLL1 復(fù)合物組成部分存在，MLL1 也無(wú)法發(fā)揮其完整的甲基轉(zhuǎn)移酶活性［40-41］。因此WDR5 是MLL1 發(fā)揮完整的甲基轉(zhuǎn)移酶活性以及進(jìn)一步二甲基化和三甲基化H3K4的必要條件。阻斷MLL1-WDR5 PPI，降低MLL1甲基轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)一步降低組蛋白H3K4 的甲基化是治療MLL1-FPs 誘導(dǎo)白血病的潛在方法。而近些年小分子抑制劑的研發(fā)也證明了該方法的可行性［42］。

2 靶向MLL1-WDR5 PPI的抑制劑

2.1 MLL1-WDR5 PPI抑制劑的作用位點(diǎn)

WDR5 是典型的WD40 重復(fù)域蛋白家族的成員。總體呈游泳圈狀，有7 個(gè)反式β 螺旋槳域，每個(gè)葉片由4 個(gè)反式平行的β 折疊組成，其中每個(gè)葉片以保守的絲氨酸-組氨酸（SH）開(kāi)始，以色氨酸-天冬氨酸（WD）結(jié)束，大小為34 kD。7個(gè)結(jié)構(gòu)域環(huán)繞在一起組成一個(gè)貫穿蛋白質(zhì)頂部和底部的中心腔（圖3）［43-44］。

圖3 WDR5的結(jié)構(gòu)和MLL1-WDR5 PPI抑制劑的主要作用位點(diǎn)

MLL1-WDR5相互作用界面位于WDR5蛋白的頂部，被7 個(gè)七葉β-螺旋槳域包圍［45-46］。WDR5 的該空腔和MLL1的Win序列（MLL1上一段包含精氨酸的保守序列）相互作用，故又被成為Win-Site，此位點(diǎn)是干擾MLL1-WDR5 蛋白-蛋白相互作用抑制劑的主要作用位點(diǎn)。本文中根據(jù)小分子與WDR5蛋白的結(jié)合方式將此位點(diǎn)的結(jié)合界面分為5個(gè)結(jié)合口袋——P1~P5，其中，P1是位于空腔深處的精氨酸結(jié)合口袋，又稱為氫鍵網(wǎng)絡(luò)區(qū)。該口袋是特征口袋，所有MLL1-WDR5 PPI 抑制劑結(jié)構(gòu)中都包含了能和P1口袋相互作用的堿性基團(tuán)或精氨酸模擬片段［47-48］。P2是一個(gè)疏水口袋，而P3與P2相鄰，P3中的極性氨基酸殘基Asp107對(duì)小分子與蛋白的結(jié)合有巨大的貢獻(xiàn)。P4 由Phe133、Phe149 和Asp107 組成，P5 由Tyr191、Cys261、Tyr260 和Lys259 組成的疏水口袋。P5是小分子與WDR5相互作用的熱區(qū)。整個(gè)相互作用界面是可塑的，小分子和蛋白的結(jié)合對(duì)口袋的形狀變化都有誘導(dǎo)作用［47，49］。

靶向MLL1-WDR5 PPI 抑制劑最早報(bào)道于2010 年，距今已有十多年的研發(fā)歷史。根據(jù)小分子的結(jié)構(gòu)和類型分類主要有擬肽類、多取代苯基哌嗪類、芳香五元雜環(huán)類（后兩者的分類主要依據(jù)氫鍵網(wǎng)絡(luò)區(qū)的結(jié)合基團(tuán)結(jié)構(gòu)而定）以及基于這些化合物衍生的工具分子（圖4）。

圖4 不同類型的代表MLL1-WDR5蛋白-蛋白相互作用(PPI)抑制劑

2.2 擬肽類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

肽類和擬肽類小分子抑制劑主要由美國(guó)密歇根大學(xué)的王少萌課題組開(kāi)發(fā)。其通過(guò)使用多肽的基序簡(jiǎn)化，將MLL1 中的WIN motif 簡(jiǎn)化為三肽Ac-ARA-NH2（Ki=120 nmol/L）［50-51］。為進(jìn)一步提高三肽活性，王少萌課題組替換并修飾了Ala1 和Ala3，然后在N-端和C-端引入合適的疏水基團(tuán)，得到擬肽MM-101、MM-102 和MM-103（圖5）。MM-101 和MM-102 的精氨酸胍基深入氫鍵結(jié)合口袋P1，疏水碳鏈和脂肪環(huán)占據(jù)了P2、P3兩個(gè)疏水口袋，其活性提高了200倍（IC50=2.4 nmol/L）。MM-102對(duì)MLL1 H3K4 甲基轉(zhuǎn)移酶（MLL1 HMT）的抑制活性并不高（IC50=141 μmol/L），但是它仍能降低MLL1介導(dǎo)的白血病發(fā)生過(guò)程中重要基因HoxA9和Meis-1的表達(dá)，并且可以選擇性抑制MLL1 融合型白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而對(duì)只含WT-MLL1 蛋白的白血病細(xì)胞作用較弱。MM-102 首次證實(shí)了靶向MLL1-WDR5 PPI的可行性和有效性［42］。

圖5 擬肽類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

王少萌課題組繼續(xù)對(duì)擬肽MM-101 進(jìn)行改造得到了環(huán)狀擬肽MM-401（IC50= 0.9 nmol/L，圖5）。將MM-401 連接成環(huán)的脂肪鏈代替了MM-102 疏水鏈的作用，和其他疏水側(cè)鏈共同占據(jù)了P4 口袋（圖6-A），MM-401 的甲基轉(zhuǎn)移酶活性（IC50= 0.32 μmol/L）相比于MM-101 和MM-102 提高近400倍。MM-401對(duì)含有MLL融合基因的人白血 病 細(xì) 胞 株（GI50MV4-11（MLL-AF4）=12.42 μmol/L，GI50Molm13（MLL-AF9）= 23.97 μmol/L，GI50Kopn8（MLL-enl）=29.73 μmol/L）的抑制能力有大幅度的提高，但是依然處于中等水平［52］。基于MM-401，他們進(jìn)一步在精氨酸胍基末端N 原子引入甲基，并縮短環(huán)肽連接鏈得到MM-589。甲基取代的胍基通過(guò)水介導(dǎo)的氫鍵和P1 相互作用。MM-589 以更小的環(huán)形成一個(gè)更緊湊的立體結(jié)構(gòu)，幾個(gè)分子內(nèi)氫鍵降低構(gòu)象的靈活性，使苯環(huán)以近乎平行的方式和Tyr260 的苯環(huán)相互作用（圖6-B）。MM-589 靶標(biāo)活性沒(méi)有顯著的提高，但是其MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶活性大幅提高，IC50為12.7 nmol/L，其代謝穩(wěn)定性適中（t1/2= 60 min）。MM-589 對(duì)具有MLL易位的人AML 細(xì)胞系Molm13 和MV4-11 細(xì)胞的抑制IC50分別達(dá)到0.21 和0.25 μmol/L，有良好的選擇性，是迄今為止報(bào)道的活性最高的靶向MLL1-WDR5 PPI的擬肽抑制劑［53］。

圖6 WDR5與多肽和擬態(tài)的結(jié)合模式對(duì)比

2.3 多取代苯基哌嗪類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

多取代苯基哌嗪類化合物來(lái)自于篩選得到的小分子化合物WDR5-0102，該化合物由Guillermo課題組［54］基于熒光偏振高通量篩選所得，經(jīng)過(guò)Al-Awar 課題組［55］進(jìn)一步修飾，得到了甲基哌嗪苯類的先導(dǎo)化合物WDR5-47（圖7）。多取代苯基哌嗪類化合物根據(jù)苯環(huán)上取代基的不同又可以細(xì)分為苯甲酰胺類、嘧啶氨基苯類和三氟甲基吡啶酮類。

圖7 苯甲酰胺類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

2.3.1 苯甲酰胺類化合物 WDR5-0102 結(jié)構(gòu)中包含了和精氨酸結(jié)合口袋結(jié)合的N-甲基哌嗪，哌嗪和中心苯環(huán)相連，鄰位則是苯甲酰氨基。因此WDR5-0102是第一個(gè)苯甲酰胺類化合物。WDR5-0102 靶標(biāo)結(jié)合活性適中、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是優(yōu)良的苗頭化合物（Kd= 3.0 ± 1 μmol/L）［54］。在WDR5-0102的基礎(chǔ)上，Al-Awar 課題組通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)指導(dǎo)結(jié)構(gòu)改造，他們保留了WDR5-0102 上的N-甲基哌嗪，進(jìn)一步修飾了苯甲酰胺部分的2-氯苯基，原苯環(huán)3 位和4 位分別引入甲基和F 原子，得到了WDR5-47。WDR5-47 的靶標(biāo)結(jié)合活性提高25 倍（IC50=0.27±0.1 μmol/L）。其甲基和F 原子占據(jù)了P2 和P3，增強(qiáng)了口袋中疏水相互作用。在生理pH 條件下，質(zhì)子化的N-甲基哌嗪基錨定在P1 底部，酰胺鍵與Ser91的側(cè)鏈和Cys261的主鏈氮原子分別形成直接和間接的氫鍵相互作用（圖8）［55］。

圖8 WDR5-47和WDR5的結(jié)合模式（PBD:4IA9）

基于WDR5-47，中國(guó)藥科大學(xué)的尤啟冬課題組在WDR5-47 的中心苯環(huán)的5 位使用吡啶替換硝基得到了化合物23，其靶標(biāo)活性進(jìn)一步提升（IC50=104 nmol/L）［56］。之后尤啟冬課題組又將吡啶替換為4-氨酰苯基，并在原苯酰胺苯環(huán)5′位上引入氨基得到DDO-2117（圖7）。DDO-2117 苯酰胺上的氨基通過(guò)氫鍵與Asp107相互作用。長(zhǎng)鏈的伯胺深入溶劑區(qū)，增強(qiáng)和溶劑區(qū)的作用。DDO-2117 具有較好的靶標(biāo)活性（Kd= 13.6 nmol/L，IC50= 7.6 nmol/L），可以顯著抑制MV4-11 細(xì)胞的生長(zhǎng)（GI50=7.6 μmol/L）［56］。

除DDO-2117 外，尤啟冬課題組還使用其他策略對(duì)WDR5-47 進(jìn)行優(yōu)化，獲得了2 個(gè)不同結(jié)構(gòu)的苯甲酰類化合物（圖7）：DDO-2093 和WL-15。DDO-2093 和WL-15 分別使用三氮唑和酚酯基取代DDO-2117 的中心苯環(huán)上的氨酰苯基，DDO-2093 有納摩爾范圍的靶標(biāo)活性（IC50＜10 nmol/L），并且有中等的細(xì)胞抗增殖活性。這兩類化合物都有較好的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制活性和體外抗增殖活性，都可以下調(diào)Hox和Meis-1基因，并誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。其中，DDO-2093 相比于DDO-2117，其水溶性和安全性均得到較大提高，其首次在小鼠體內(nèi)移植瘤模型中證明了有效性［57］。

2.3.2 嘧啶氨基苯類化合物 同樣基于化合物WDR5-47，尤啟冬課題組使用骨架躍遷策略得到了嘧啶氨基苯類化合物，通過(guò)將WDR5-47 的苯甲酰胺基團(tuán)替換為4-氯-5-氨基取代嘧啶，中心苯環(huán)硝基取代為4-（N，N-二甲氨酰）苯基，并在中心苯環(huán)5 號(hào)位引入F 原子得到了DDO-2213（圖9）。DDO-2213 有較好的靶標(biāo)活性，和DDO-2093 一樣，DDO-2213 具有中等的MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制活性以及體外抗增殖活性，可以下調(diào)Hox和Meis-1基因，并誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。同時(shí)，DDO-2213 的有效性也在小鼠體內(nèi)移植瘤模型中得到證明［58］。

圖9 嘧啶氨基苯類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

2.3.3 三氟甲基吡啶酮類化合物 在WDR5-47的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，Al-Awar 課題組根據(jù)片段篩選，將取代苯甲酰胺替換為4-（三氟甲基）吡啶酮，并將WDR5-47 的硝基替換為3-甲基嗎啉取代的苯環(huán)得到OICR-9429（圖10），這是第1 個(gè)三氟甲基吡啶酮類化合物。與WDR5-47 相比，OICR-9429 有更高的靶標(biāo)活性（Kd= 0.03 μmol/L）、更優(yōu)的溶解度和更佳的選擇性。此外，OICR-9429 不僅能夠抑制MLL1 融合蛋白型白血病的細(xì)胞株的生長(zhǎng)，還可抑制表達(dá)帶有N 末端C/EBPα 突變（IC50≈5 μmol/L）的p30的原代人AML細(xì)胞的增殖［48］。

圖10 三氟甲基吡啶酮類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

在OICR-9429 的基礎(chǔ)上，Al-Awar 課題組繼續(xù)優(yōu)化了靶標(biāo)活性和成藥性。在中心苯環(huán)C-4 處的引入F 原子，并使用4-（嘧啶-2-基）嗎啉取代中心苯環(huán)C-5 處的4-芐基嗎啉，同時(shí)在N-甲基哌嗪的2 號(hào)位引入甲基后得到化合物7?；衔? 是第一個(gè)皮摩爾級(jí)別的MLL1-WDR5 PPI 抑制劑（Kd=0.06 nmol/L），有小于百納摩爾的體外抗增殖活性（MV4-11）［59］。關(guān)于化合物7 后期結(jié)構(gòu)優(yōu)化已有專利［60］報(bào)道，但在結(jié)構(gòu)上改動(dòng)較小且活性增強(qiáng)有限。

2.4 芳香五元雜環(huán)類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

2018 年，F(xiàn)esik 課題組［47，62］基于碎片篩選和碎片生長(zhǎng)得到了新的芳香五元雜環(huán)類抑制劑。該類抑制劑的特征就是使用五元雜環(huán)替代以往抑制劑中的N-甲基哌嗪和精氨酸胍基與P1 口袋結(jié)合。相比于N-甲基哌嗪芳香五元雜環(huán)和P1 結(jié)合的更為深入，并誘導(dǎo)之前并未參與小分子相互作用的Phe263 和五元芳香雜環(huán)形成了π-π相互作用。相比于甲基哌嗪苯類化合物，芳香五元雜環(huán)類化合物分子整體柔性更強(qiáng)，且結(jié)合模式有較大的不同。

Fesik 課題組基于NMR 的片段篩選得到了抑制劑的基本片段——2-苯基-6，7-二氫-5H-吡咯并［1，2-a］咪唑。環(huán)狀咪唑基團(tuán)占據(jù)P1 并與Phe133和Phe263 形成π-π堆疊，咪唑3 號(hào)氮原子通過(guò)氫鍵和Cys261 的羰基相互作用。進(jìn)而在苯環(huán)3 號(hào)位引入芐基取代的苯甲酰胺將化合物的結(jié)合區(qū)擴(kuò)展P5，并通過(guò)構(gòu)象限制進(jìn)一步優(yōu)化獲得化合物6e（圖11）。與OIRC-9429，DDO-2117 相比，化合物6e 和WDR5 的（PDB ID：6DAS）結(jié)合模式不同?；衔?e 是一類新的MLL1-WDR5 PPI 抑制劑，有較好的靶標(biāo)活性（FPAKi＜1 nmol/L，TR-FRETKi= 0.902 nmol/L），和中等的體外抗增殖活性（GI50（MV-4-11）=7.25 μmol/L）［47］。

圖11 芳香五元雜環(huán)類MLL1-WDR5 PPI抑制劑

2019 年，F(xiàn)esik 課題組基于碎片篩選得到了另一種結(jié)構(gòu)的MLL1-WDR5 PPI 抑制劑。他們得到了初始精氨酸模擬片段——咪唑胺結(jié)構(gòu)，使用芐基酰胺將分子延伸至P5，通過(guò)修飾芐基以增強(qiáng)和P5 的相互作用，并在中心苯環(huán)上引入F 指向P2 得到化合物C3。同時(shí)篩選到的另一個(gè)片段——5-（1H-咪唑-3-甲基）糠醛酸，他們將酸和芐胺縮合以利用芐基占據(jù)P5 口袋，并用2-氟-6-甲基吡啶代替F 來(lái)占據(jù)P2，在原有咪唑的C-2位引入亞氨基增強(qiáng)和氫鍵網(wǎng)絡(luò)區(qū)的相互作用得到化合物C6，因此靶標(biāo)活性也更高［61］?；诨衔顲6，F(xiàn)esik 課題組繼續(xù)優(yōu)化了和P2 和P5 結(jié)合的基團(tuán)，替換原來(lái)的基團(tuán)為4-氟-2-甲基苯和3，5-二甲氧基苯。然后中心苯環(huán)替換為二氫異喹啉酮，通過(guò)構(gòu)象限制調(diào)整取代芐基和P5 的結(jié)合角和方向，并改善化合物的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性，最終得到化合物16。晶體結(jié)構(gòu)表明，咪唑亞胺深入P1口袋中，通過(guò)π-π堆疊相互作用被Phe133 和Phe263 夾在中間。亞胺氮原子通過(guò)與水分子和Cys261 形成雙齒氫鍵，4-氟-2-甲基苯基和3，5-二甲氧基苯基分別占據(jù)的P2 和P5 口袋?；衔?6和C6有相同水平的靶標(biāo)活性，可誘導(dǎo)P53 表達(dá)和P53 依賴性細(xì)胞凋亡（圖12）。相比化合物C6，化合物16 的細(xì)胞效價(jià)和成藥性大幅提升，體外抗增殖活性GI50均小于100 nmol/L。除MLL 細(xì)胞系外，化合物16 還可抑制其他類型的腫瘤細(xì)胞的增殖，如胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞［62］。

圖12 WDR5和芳香五元雜環(huán)類抑制劑的相互作用

2.5 基于抑制劑的工具分子

2017 年，Vázquez 課題組報(bào)道了基于多肽類光調(diào)控WIN site 抑制劑。抑制劑基于WIN motif，引入4-（4′-氨甲基苯基偶氮）苯甲酸（AMPB）作為光調(diào)控元件，獲得靶標(biāo)活性較好的光調(diào)控制劑（Ki=1.24 nmol/L）。用光處理后，抑制劑的順?lè)串悩?gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致靶標(biāo)活性變化，體外MLL1 的甲基轉(zhuǎn)移酶活性也隨之改變?；衔镆晕⒛朑I50抑制小鼠骨髓細(xì)胞的增殖，順式和反式異構(gòu)體之間有明顯的活性差異［63］。2018 年，基于DDO-2117，使用連接鏈在末端游離氨基上引入生物素標(biāo)簽獲得了小分子探針LC001。該探針靶標(biāo)活性和DDO-2117 相近，IC50為17 nmol/L，具有類似于小分子抑制劑DDO-2117 的生理作用，是一種新的工具分子（圖13）［64］。2019 年，有專利報(bào)道了靶向WDR5 的PROTAC分子，這項(xiàng)工作主要基于安大略省腫瘤研究所發(fā)現(xiàn)的一系列小分子。通過(guò)將分子（OICR-9429）與不同的泛素E3 連接酶底物通過(guò)各種類型的連接鏈連接而獲得了大量PROTAC 分子。PROTAC顯著地誘導(dǎo)了WDR5蛋白的降解，并表現(xiàn)出比對(duì)應(yīng)小分子更好的體外抗增殖活性［65］。

圖13 基于MLL1-WDR5 PPI抑制劑的工具分子

3 總結(jié)與展望

本文對(duì)靶向MLL1-WDR5 蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制劑的藥理學(xué)機(jī)制以及WDR5 蛋白Win-site 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行了總結(jié)，介紹了已公開(kāi)的各個(gè)結(jié)構(gòu)類型的MLL1-WDR5 蛋白-蛋白相互作用小分子抑制劑。經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，人們對(duì)MLL1 的生理功能日趨了解，靶向MLL1 的新途徑也不斷被發(fā)現(xiàn)。MLL1-WDR5 蛋白-蛋白相互作用作為腫瘤治療的新策略越來(lái)越受到研究者的關(guān)注，目前針對(duì)MLL1-WDR5 PPI 抑制劑的開(kāi)發(fā)依然處于前期研究階段，尚未有小分子抑制劑進(jìn)入臨床研究，但已有多個(gè)候選化合物涌現(xiàn)。

MLL1-WDR5 PPI抑制劑的研究雖已取得較好的進(jìn)展，亦具有較大的開(kāi)發(fā)潛力，但依然存在一些不足。首先，目前報(bào)道的分子雖然數(shù)量較多，但結(jié)構(gòu)類型較為單一，并且無(wú)論是多肽類抑制劑還是非肽類的小分子抑制劑都含有較強(qiáng)的堿性基團(tuán)（哌嗪、胍基和含氮芳香五元雜環(huán)等），這些結(jié)構(gòu)特征可能導(dǎo)致分子成藥性不佳（如多肽類分子體內(nèi)代謝穩(wěn)定性和透膜性較差、部分多取代苯基哌嗪類小分子的極性較強(qiáng)）。其次，部分MLL1-WDR5 PPI 抑制劑雖然具有較好的體外活性，但目前體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)較少，現(xiàn)有抑制劑的有效性還需要更多的實(shí)驗(yàn)支撐。因此，針對(duì)MLL1-WDR5 PPI 抑制劑的研究，不僅要在原有分子的基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化其成藥性，還需尋找更多結(jié)構(gòu)新穎的小分子抑制劑，同時(shí)抑制劑的體內(nèi)有效性也有待進(jìn)一步闡明。此外，利用新策略研發(fā)出更多的工具分子，可以為進(jìn)一步探究MLL1 相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制提供分子基礎(chǔ)。

除了靶向MLL1-WDR5 蛋白-蛋白相互作用，在WDR5 蛋白上發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)蛋白結(jié)合空腔［44，66］，該空腔可以介導(dǎo)WDR5 和RbBP5 的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制該相互作用也可以抑制MLL1 甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。但該抑制劑是否確切有效暫時(shí)還未見(jiàn)報(bào)道，但此項(xiàng)研究為后續(xù)兩者協(xié)同用藥提供可能，為靶向MLL1 提供了更多的途徑和策略。