殼寡糖納米硒的工藝優(yōu)化研究

葉大天 任祥雨 夏磊 林昌宇 肖云玉 聞?wù)?/p>

摘要 [目的]優(yōu)化殼寡糖納米硒的合成工藝。[方法]采用單因素探究殼寡糖與亞硒酸鈉的比例、乙酸質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)納米粒子粒徑、PDI和電位的影響，并以PDI為主要判斷依據(jù)，電位為次要判斷依據(jù)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化反應(yīng)的條件。[結(jié)果]最優(yōu)工藝條件為殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為16∶1，乙酸質(zhì)量濃度為3%，反應(yīng)時(shí)間為2.5 d，得到殼寡糖納米硒的PDI為0.238，電位為50.36 mV。通過(guò)方差分析可知，反應(yīng)條件對(duì)PDI影響由大到小依次為殼寡糖與亞硒酸鈉的比例>反應(yīng)時(shí)間>乙酸質(zhì)量濃度，反應(yīng)條件對(duì)電位影響由大到小依次為反應(yīng)時(shí)間>殼寡糖與亞硒酸鈉的比例>乙酸質(zhì)量濃度。[結(jié)論]該研究?jī)?yōu)化了殼寡糖納米硒的合成條件，為殼寡糖納米硒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了支持。

關(guān)鍵詞 殼寡糖;納米硒;合成工藝;優(yōu)化;正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào) TB 383.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）08-0156-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.043

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Process Optimization of Chitooligosaccharides-Selenium Nanoparticles

YE Da-tian 1， REN Xiang-yu 1， XIA Lei 2 et al

（1.School of Food Science and Pharmaceutics， Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022;2.Zhoushan Center of Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Management， Zhoushan， Zhejiang 316021）

Abstract [Objective]To optimize the synthesis process of chitooligosaccharides-selenium nanoparticles.[Method] The single factor was used to explore the influence of the ratio of chitooligosaccharide to sodium selenite， the mass concentration of acetic acid and the reaction time on the particle size， PDI and potential of nanoparticles. Using PDI as the main judgment basis and potential as the secondary judgment basis， an orthogonal experiment was carried out to optimize the reaction conditions.[Result]The best process conditions for synthesizing chitooligosaccharides-selenium nanoparticles were the ratio of chitooligosaccharides to sodium selenite 16∶1， 3% acetic acid mass concentration， and the reaction time 2.5 days. Under this condition， the PDI of the chitooligosaccharides-selenium nanoparticles was 0.238 and the potential was 50.36 mV.The variance analysis of the experimental factors showed that the effect of reaction conditions on PDI was in the order of the ratio of chitooligosaccharide to sodium selenite > reaction time > acetic acid mass concentration， and the effect of reaction conditions on potential is in the order of reaction time > the ratio of chitooligosaccharide to sodium selenite > acetic acid mass concentration.[Conclusion] The synthesis conditions of chitooligosaccharides-selenium nanoparticles are optimized， which provides support for the further development and utilization of chitooligosaccharides-selenium nanoparticles.

Key words Chitooligosaccharides;Nano-selenium;Synthesis process;Optimization;Orthogonal experiment

硒是人體和動(dòng)物體內(nèi)許多抗氧化酶如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和硒蛋白P的必需微量元素和組成部分。硒缺乏會(huì)導(dǎo)致各種臨床后果，包括癌癥、心血管疾病、2型糖尿病和肺部疾病 [1]。因此，補(bǔ)充硒非常重要，而膳食硒的有效劑量和毒性劑量之間的差距很小，其生物利用度和生物活性受到很大限制 [2]。研究表明，零氧化態(tài)的紅色硒納米粒子具有優(yōu)異的生物利用度和低毒性 [3]。由于紅色硒納米粒子容易轉(zhuǎn)化為熱力學(xué)穩(wěn)定的灰色類(lèi)似物，而這種類(lèi)似物生物學(xué)上是惰性的，因此為了穩(wěn)定紅色的納米硒，人們會(huì)用多糖、蛋白、多酚等作為穩(wěn)定劑 [4-6]。殼寡糖又叫殼聚寡糖、低聚殼聚糖，是將殼聚糖經(jīng)特殊的生物酶技術(shù)（或化學(xué)降解、微波降解技術(shù)）降解得到的一種聚合度在2～20的寡糖。殼寡糖是帶正電荷陽(yáng)離子堿性氨基低聚糖，其陽(yáng)離子性質(zhì)相當(dāng)特殊，因?yàn)榇蠖鄶?shù)多糖在酸性環(huán)境中通常呈中性或帶負(fù)電荷。這種特性使其能夠與其他帶負(fù)電荷的合成或天然聚合物形成靜電復(fù)合物或多層結(jié)構(gòu) [7]。有研究表明，使用殼聚糖可以作為還原劑和穩(wěn)定劑合成硒納米粒子（SeNPs），通過(guò)控制溫度，簡(jiǎn)單的一鍋反應(yīng)合成了83～208 nm的分散良好的CS-Se納米復(fù)合材料 [8]。該試驗(yàn)采用單因素研究殼寡糖與亞硒酸鈉的比例、乙酸質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)納米粒子粒徑、聚合物分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）和電位的影響，并以PDI為主要判斷依據(jù)，電位為次要判斷依據(jù)，進(jìn)行了正交試驗(yàn)，對(duì)殼寡糖納米硒的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為硒納米粒子的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

殼寡糖（浙江金殼藥業(yè)股份有限公司）;亞硒酸鈉（長(zhǎng)沙哈林化工有限公司）;乙酸（分析純AR，國(guó)藥）。

1.2 試驗(yàn)儀器

LG10-2.4Axx高速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）;AREC.T加熱磁力攪拌器（意大利VELP公司）;JM-B1003電子天平（上海數(shù)宜電子衡器有限公司）;Zetasizer_Nano_ZS_90激光粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 殼寡糖納米硒粒子的制備。

將一定量的殼寡糖放入錐形瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的乙酸溶液30 mL，室溫下攪拌1 h使殼寡糖充分溶解。另稱(chēng)量100 mg的亞硒酸鈉溶于10 mL 純水中，然后將亞硒酸鈉加入殼寡糖溶液中，并在47 ℃的水浴中以1 000 r/min避光反應(yīng)一定時(shí)間。將反應(yīng)完成的溶液在10 000 r/min下離心取沉淀，并水洗沉淀3次，將殘留的亞硒酸根除去，然后將沉淀溶于10 mL的水中備用。將0.1 g的殼寡糖放入錐形瓶中，加入3%的乙酸溶液10 mL，攪拌使殼寡糖溶解，加入先前的沉淀水溶液，室溫下避光攪拌1 h后，10 000 r/min離心取沉淀，再10 000 r/min離心水洗沉淀1次，生成的橙紅色溶液即為殼寡糖納米硒待測(cè)樣品。

1.3.2 粒子的粒徑和PDI分析。

取少量待測(cè)樣品于石英皿中，加純水稀釋到一定的濃度后，放進(jìn)Zetasizer_Nano_ZS_90激光粒度儀的槽中進(jìn)行粒徑和PDI分析。

1.3.3 粒子的電位分析。

將待測(cè)樣品吸入電解槽中，放進(jìn)Zetasizer_Nano_ZS_90激光粒度儀的槽中進(jìn)行電位分析。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

固定乙酸質(zhì)量濃度為3%，反應(yīng)時(shí)間為2.5 d，探究不同的殼寡糖與亞硒酸鈉的比例（8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1，g∶g）對(duì)粒徑、PDI和電位的影響。固定殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為10∶1，反應(yīng)時(shí)間為2.5 d，探究不同的乙酸質(zhì)量濃度（1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)粒徑、PDI和電位的影響。固定殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為10∶1，乙酸質(zhì)量濃度為3%，探究不同的反應(yīng)時(shí)間（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 d）對(duì)粒徑、PDI和電位的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

由單因素的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定各因素適宜的合成條件，通過(guò)試驗(yàn)的因素個(gè)數(shù)和水平數(shù)來(lái)選取正確的正交試驗(yàn)表，該試驗(yàn)選取正交表L9（3 4）進(jìn)行試驗(yàn)（表1），確定最佳的工藝條件。

1.3.6 正交試驗(yàn)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

選取PDI值和電位作為殼寡糖納米硒粒子的評(píng)判依據(jù)。PDI為主要的判斷依據(jù)，電位為次要的判斷依據(jù)。PDI值代表粒子的分散程度，其值越小代表粒子分布越均勻。電位的大小與粒子的穩(wěn)定性有關(guān)，電位越大粒子的穩(wěn)定性越好，一般粒子的電位需要大于30 mV說(shuō)明粒子有較好的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel 2007 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理，利用 GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 殼寡糖與亞硒酸鈉的比例對(duì)粒徑的影響。由圖1可知，粒子的粒徑隨殼寡糖與亞硒酸鈉的比例升高總體呈先平穩(wěn)后增大的趨勢(shì)，殼寡糖與亞硒酸鈉的比例在8∶1～16∶1時(shí)，粒徑在167.6～187.5 nm。而當(dāng)殼寡糖與亞硒酸鈉的比例從16∶1變化到18∶1時(shí)，粒徑由167.6 nm上升至205.7 nm，可能是因?yàn)闅す烟羌尤氲牧刻鄷r(shí)，生成的納米硒外層包裹著更多的殼寡糖。

2.1.2 乙酸質(zhì)量濃度對(duì)粒徑的影響。由圖2可知，粒子的粒徑隨乙酸質(zhì)量濃度的上升總體呈先減小后增大的趨勢(shì)，在3%的乙酸質(zhì)量濃度下粒子的粒徑最小，為172.7 nm。當(dāng)乙酸質(zhì)量濃度由2%上升至3%時(shí)，粒子的粒徑由430.0 nm下降至172.7 nm，而乙酸質(zhì)量濃度由3%上升至5%時(shí)，粒子的粒徑由172.7 nm增加到247.0 nm。這可能是因?yàn)殡S著乙酸質(zhì)量濃度的增大，改變了反應(yīng)體系的pH，從而導(dǎo)致了粒徑的變化。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)粒徑的影響。由圖3可知，粒子的粒徑隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈下降的趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間在1.5～3.5 d，粒徑的大小由218.0 nm下降至157.2 nm?？赡苁且?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間會(huì)影響納米粒子的產(chǎn)物的結(jié)晶程度，從而影響粒徑的大小。

2.1.4 殼寡糖與亞硒酸鈉的比例對(duì)PDI和電位的影響。由圖4可知，粒子的PDI隨殼寡糖與亞硒酸鈉的比例升高總體呈先減小后增大的趨勢(shì)，而當(dāng)殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為16∶1時(shí)PDI最小，為0.269;當(dāng)殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為8∶1～16∶1時(shí)，PDI緩慢減少，而殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為16∶1～18∶1時(shí)PDI增加明顯。粒子的電位隨殼寡糖與亞硒酸鈉的比例升高總體呈先增大后平穩(wěn)減小的趨勢(shì)，當(dāng)殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為10∶1時(shí)電位最大，為50.33 mV。綜上考慮PDI為主要判斷依據(jù)，兼顧電位，選擇殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為14∶1、16∶1和18∶1進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.5 乙酸質(zhì)量濃度對(duì)PDI和電位的影響。由圖5可知，粒子的PDI隨乙酸質(zhì)量濃度的升高總體呈先減小后趨向平穩(wěn)的趨勢(shì)，而在乙酸質(zhì)量濃度為3%時(shí)PDI最小，為0.286;當(dāng)乙酸質(zhì)量濃度在1%～3%時(shí)，PDI由0.628減少至0.286，而在3%～5%時(shí)，PDI變化不大。粒子的電位隨乙酸質(zhì)量濃度的升高總體呈先增大后平穩(wěn)減小的趨勢(shì)，當(dāng)乙酸質(zhì)量濃度為3%時(shí)電位最大，為50.33 mV。綜上考慮PDI為主要判斷依據(jù)，兼顧電位，選擇乙酸質(zhì)量濃度為2%、3%和4%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)PDI和電位的影響。由圖6可知，粒子的PDI隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈先減少后增大的趨勢(shì)，而在反應(yīng)時(shí)間為2.5 d時(shí)，PDI最小，為0.286;反應(yīng)時(shí)間在1.5～2.5 d時(shí)，PDI由0.403減少至0.286，反應(yīng)時(shí)間在2.5～3.5 d時(shí)，PDI由0.286增加至0.325。粒子的電位隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增大后平穩(wěn)減小的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.5 d時(shí)，電位最大。綜上考慮PDI為主要判斷依據(jù)，兼顧電位，選擇2.0、2.5和3.0 d 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）可知，反應(yīng)條件對(duì)PDI影響由大到小依次為殼寡糖與亞硒酸鈉的比例（A）>反應(yīng)時(shí)間（C）>乙酸質(zhì)量濃度（B），PDI的最佳反應(yīng)條件為A2B2C2;反應(yīng)條件對(duì)電位影響由大到小依次為反應(yīng)時(shí)間（C）>殼寡糖與亞硒酸鈉的比例（A）>乙酸質(zhì)量濃度（B），電位的最佳反應(yīng)條件為A1B1C3，采用綜合平衡法進(jìn)行分析得到最優(yōu)組合。對(duì)于因素A：由于PDI最佳反應(yīng)條件為A2，電位最佳反應(yīng)條件為A1，而A1與A2的電位相對(duì)相差不大，PDI兩者相差較大，所以選擇A2為最優(yōu)條件。對(duì)于因素B：PDI和電位兩者相差都不大，但是以PDI為主要的判斷依據(jù)，因此選擇B2。對(duì)于因素C：PDI最佳反應(yīng)條件為C2，電位最佳反應(yīng)條件為C3，兩者的相對(duì)差值差不多，但是以PDI為主要的判斷依據(jù)，因此選擇C2。綜上所述，最佳的反應(yīng)條件為A2B2C2，即殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為16∶1，乙酸質(zhì)量濃度為3%，反應(yīng)時(shí)間為2.5 d。

按照最佳反應(yīng)條件即殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為16∶1，乙酸質(zhì)量濃度為3%，反應(yīng)時(shí)間為2.5 d，得到殼寡糖納米硒的PDI為0.238，電位為50.36 mV，明顯優(yōu)于先前在正交試驗(yàn)中的結(jié)果，說(shuō)明該條件可行。

3 結(jié)論與討論

納米硒的合成方法有化學(xué)合成和生物合成 [9]，化學(xué)合成采用硒鹽與還原劑的還原，通常通過(guò)穩(wěn)定劑防止硒原子簇生長(zhǎng)并在膠體懸浮液中獲得穩(wěn)定的納米粒子。許多方法包括物理蒸發(fā)方法、水熱方法、γ-輻射還原和聲化學(xué)方法被用作納米硒合成的過(guò)程 [10-12]。水熱法是常用的合成納米硒的方法，有研究利用水熱法以枸杞多糖為修飾劑和穩(wěn)定劑制備枸杞多糖納米硒 [13]。對(duì)于合成納米硒的影響因素，pH是影響納米粒子形成的原因之一，其主要是通過(guò)改變納米粒子的表面化學(xué)特性而改變粒子的穩(wěn)定性，因此零電位點(diǎn)是關(guān)鍵。隨著pH偏離零電位點(diǎn)，納米粒子的穩(wěn)定性將會(huì)增大，而且pH的改變會(huì)導(dǎo)致納米粒子的化學(xué)鍵的斷裂或者合成，從而影響納米粒子的穩(wěn)定性 [14]。另外，反應(yīng)時(shí)間會(huì)影響納米粒子的結(jié)晶程度 [15]。因此，該研究采用單因素的方法研究了殼寡糖與亞硒酸鈉的比例、乙酸質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)納米粒子粒徑、PDI和電位的影響，并以PDI為主要判斷依據(jù)，進(jìn)行了正交試驗(yàn)，優(yōu)化了反應(yīng)的條件。結(jié)果表明，反應(yīng)條件對(duì)PDI影響由大到小依次為殼寡糖與亞硒酸鈉的比例>反應(yīng)時(shí)間>乙酸質(zhì)量濃度，反應(yīng)條件對(duì)電位影響由大到小依次為反應(yīng)時(shí)間>殼寡糖與亞硒酸鈉的比例>乙酸質(zhì)量濃度，而最優(yōu)工藝條件為殼寡糖與亞硒酸鈉的比例為16∶1，乙酸質(zhì)量濃度為3%，反應(yīng)時(shí)間為2.5 d，得到殼寡糖納米硒的PDI為0.238，電位為50.36 mV。綜上所述，該研究為殼寡糖納米硒的制備提供了科學(xué)參考。

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