刺角瓜提取物對南方根結(jié)線蟲的觸殺活性研究

高強 張浩 任海龍 阿布都克尤木?阿不都熱孜克 符小發(fā) 張龑 周勃 徐麟

摘要 采用觸殺法研究了刺角瓜無水乙醇提取物對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒殺活性。結(jié)果表明，不同濃度的刺角瓜無水乙醇根和莖葉提取物對南方根結(jié)線蟲有不同程度的毒殺活性，其中，用1.00 mg/mL的刺角瓜根、莖葉乙醇提取物分別處理，24 h后南方根結(jié)線蟲校正死亡率分別為98.95%、94.46%，48 h后南方根結(jié)線蟲校正死亡率分別為100%、98.12%，與1.00 mg/mL阿維菌素的活性無明顯差異。毒力測定結(jié)果表明，莖葉提取物處理24和48 h，對南方根結(jié)線蟲的半致死濃度LD50分別為0.703 2和0.450 3 mg/mL;根提取物處理24和48 h，對南方根結(jié)線蟲的半致死濃度LD50分別為0.493 5 和0.484 2 mg/mL。此外，根提取物和莖葉提取物的殺線蟲活性表現(xiàn)出明顯差異。

關(guān)鍵詞 刺角瓜;提取物;南方根結(jié)線蟲;觸殺活性

中圖分類號 S 476? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）08-0122-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.033

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

The Contact Activity of Extracts from Cucumis metuliferus against Meloidogyne incognita

GAO Qiang 1，2，ZHANG Hao 1，REN Hai-long 3 et al

（1.Hainan Sanya Crops Breeding Trial Center of Xinjiang Academy Agricultural Sciences， Urumqi，Xinjiang? 830091;2.Institute of Crop Germplasm Resources of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi，Xinjiang? 830091;3.Guangzhou Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510335）

Abstract The contact toxicity of ethanol extract from Cucumis metuliferus against the 2nd instar larvae（J2） of Meloidogyne incognita was studied. The results showed that different concentrations of ethanol extracts from roots and stems and leaves of Cucumis metuliferus had different degrees of toxic activity against Meloidogyne incognita. The corrected mortality rates of Meloidogyne incognita were 98.95% and 94.46% 24 h after treatment with 1.00 mg/mL ethanol extracts from roots and stems and leaves of Cucumis metuliferus， and 100% and 98.12% 48 h after treatment， respectively， which were not significantly different from the activity of 1.00 mg/mL abamectin. The results of toxicity test showed that the LD50 of stem and leaf extracts to Meloidogyne incognita were 0.703 2? and 0.450 3 mg/mL respectively after 24 and 48 h treatment. After 24? and 48 h of root extract treatment， the LD50 of root extract against Meloidogyne incognita was 0.493 5? and 0.484 2 mg/mL， respectively. Nematicidal activity of root extract and stem and leaf extract showed significant difference.

Key words Cucumis metuliferus;Extractive;Meloidogyne incongnita;Contact activity

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是一種高度?；偷闹参锊≡€蟲，主要危害植物的根部，造成植株產(chǎn)量降低，甚至死亡。南方根結(jié)線蟲（M.incognita）寄主范圍廣，在國內(nèi)分布最廣，危害最大，可加重土傳性真菌危害和大部分細菌病害的發(fā)生，嚴重威脅全世界西甜瓜、蔬菜、糧食作物等作物的生長 [1-5]。我國根結(jié)線蟲的防治目前仍以化學防治為主，但由于目前主要使用的化學農(nóng)藥如溴甲烷、克百威、噻唑磷、阿維菌素等具有高毒性、高土壤殘留，對生物安全和環(huán)境造成極大的威脅，一些化學殺線劑相繼被國家禁用 [6-7]。植物源農(nóng)藥由于易分解為無毒物質(zhì)、對環(huán)境友好等優(yōu)點成為研究開發(fā)的重點對象 [8]。由于長期的協(xié)同進化，植物通過物理阻斷、產(chǎn)生具有殺線蟲活性的次生代謝產(chǎn)物等形式使自身對根結(jié)線蟲產(chǎn)生抗性，這些次生代謝產(chǎn)物逐漸成為研制新型植物源殺線蟲劑的突破點和研究熱點 [9-12]。刺角瓜（Cucumis metuliferus Mey ex Naud）為原產(chǎn)于非洲的黃瓜屬野生近緣種，其優(yōu)異的根結(jié)線蟲抗性受到眾多遺傳學者的關(guān)注。Walters等 [13-16]研究證實刺角瓜對根結(jié)線蟲有顯著的抗性，可以有效抑制根結(jié)線蟲的生長發(fā)育，并具有較強的熱穩(wěn)定性。葉德友等 [17]對刺角瓜根系中參與調(diào)控的植物免疫反應WRKY基因進行了克隆和表達分析，發(fā)現(xiàn)CmWRKY20表達表現(xiàn)為抗病材料高于感病材料。但對于刺角瓜根和莖葉提取物對根結(jié)線蟲的活性研究未見報道，影響了刺角瓜根結(jié)線蟲抗性機制的進一步研究。筆者以南方根結(jié)線蟲為供試線蟲，獲得刺角瓜根和莖葉的乙醇提取物和乙酸乙酯萃取分離物，進行室內(nèi)線蟲抑殺活性評價，旨在為刺角瓜抗線蟲研究和植物源殺線劑研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗植物

供試材料刺角瓜于2020年7月采自新疆農(nóng)業(yè)科學院海南三亞農(nóng)作物育種試驗中心南繁基地，采集部位為刺角瓜的根和莖葉。

1.2 南方根結(jié)線蟲

供試南方根結(jié)線蟲為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所線蟲實驗室培養(yǎng)。具體分離培養(yǎng)方法：

①將采集到的感染根結(jié)線蟲的植物根系用清水清洗干凈，用剪刀剪成約1 cm長，放入豆?jié){機至500 mL量杯的1/3～2/3處，加入無菌水和適量次氯酸鈉（約5 mL），進行根組織破碎3～5 s。

②將破碎后的根組織通過35、200和500目的篩子，500目篩子中即得到分離出的根結(jié)線蟲的卵塊和寄生早期幼蟲。

③準備1個自制線蟲孵化器（從下至上依次為培養(yǎng)皿、20目網(wǎng)篩，網(wǎng)篩上鋪蓋2層手帕紙），將收集的根結(jié)線蟲卵塊轉(zhuǎn)入手帕紙上，加水至界面，于25～28 ℃孵化幼蟲，4 d后收集幼蟲（2齡幼蟲）。收集到的線蟲放置自然沉降，用膠頭滴管將表面清水吸出。

1.3 植物提取液的制備

將新鮮的刺角瓜根莖葉，用鍘刀軋成小段，按照樣品（M）∶溶液（V）=1∶30加入乙醇冷浸7 d，過濾得濾液1，樣品再加入等量乙醇超聲4 h再過濾得濾液2。將濾液1和濾液2合并50 ℃減壓濃縮得到浸膏（乙醇提取物19.440 8 g，得率17.2%），濃縮得到的浸膏無菌水溶解用作室內(nèi)殺蟲試驗 。

1.4 樣品懸液制備

將1.0 mg樣品分別用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μL無菌水溶解得到5個濃度梯度溶液。

1.5 殺線蟲活性測定

在96孔板，每孔加入線蟲懸液（200～300條線蟲），無菌水95 μL，樣品溶液5 μL，樣品終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL，空白對照為用等量的無菌水替代樣品溶液，陽性對照為用等量的1 mg/mL阿維菌素水溶液替代樣品溶液，3次重復，96孔板周圍的孔加200 μL無菌水保濕。混勻后于室溫下培養(yǎng)24 h，于熒光數(shù)碼生物顯微鏡下計數(shù)線蟲死亡數(shù)，統(tǒng)計的線蟲數(shù)量不少于100條。分別計算線蟲的死亡率和校正死亡率。

參照殺線蟲活性強弱分級標準進行分級。具體分級標準：“-”表示無活性，校正死亡率≤10%;“+”表示弱活性，校正死亡率為10%～30%;“++”表示中等活性，校正死亡率為30%～50%;“+++”表示較強活性，校正死亡率為50%～80%;“++++”表示強活性，校正死亡率>80%。

線蟲死亡率=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)×100%

線蟲校正死亡率=（處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率）/（1-對照組線蟲死亡率）×100%

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用藍宙工作室的LD50數(shù)據(jù)處理軟件1.01和SPSS 19.0分析，供試樣品濃度（μg/mL）取對數(shù)（X），抑制率（%）換算成生物統(tǒng)計概率值（Y），求得抑制活性回歸方程（Y=aX+b），從而可以求得半抑制濃度（LD50）值，并進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺角瓜提取物的殺線效果

刺角瓜無水乙醇提取物抑殺南方根結(jié)線蟲的毒力測定結(jié)果見表1，部分測定效果見圖1和圖2。結(jié)果表明，1.00～4.00 mg/mL植物莖葉及根的乙醇提取物對南方根結(jié)線蟲均表現(xiàn)出強毒殺活性，且校正死亡率隨著南方根結(jié)線蟲暴露時間的延長和提取物濃度上升而上升。用濃度為1.00 mg/mL莖葉或根的提取物分別處理24 h后南方根結(jié)線蟲校正死亡率均超過90%，處理48 h后，線蟲校正死亡率均超過98%。當濃度為1.00 mg/mL時，根提取物對南方根結(jié)線蟲24和48 h校正死亡率均大于莖葉提取物;當濃度大于1.00 mg/mL時，根提取物對南方根結(jié)線蟲24 h校正死亡率大于莖葉提取物。

差異顯著性分析結(jié)果表明，刺角瓜莖葉提取物及根提取物對南方根結(jié)線蟲的活性存在極顯著差異，1.00、2.00和4.00 mg/mL的南方根結(jié)線蟲校正死亡率均極顯著大于0.50、0.25 mg/mL和無菌水對照處理。莖葉提取物2.00 mg/mL時，南方根結(jié)線蟲校正死亡率48 h達100%;根提取物2.00 mg/mL 24 h和1.00 mg/mL 48 h的南方根結(jié)線蟲校正死亡率均達100%。當刺角瓜根和莖葉提取物的濃度≥1 mg/mL時，南方根結(jié)線蟲校正死亡率與1 mg/mL阿維菌素致死率相當。

2.2 刺角瓜提取物對南方根結(jié)線蟲的半致死濃度

刺角瓜提取物對南方根結(jié)線蟲的抑制活性見表2。由表2可知，莖葉提取物處理24和48 h，對南方根結(jié)線蟲的半致死濃度LD50分別為0.703 2和0.450 3 mg/mL。根提取物處理24和48 h，對南方根結(jié)線蟲的半致死濃度LD50分別為0.493 5和0.484 2 mg/mL。根提取物對南方根結(jié)線蟲的24 h半致死濃度LD50明顯小于莖葉提取物，48 h半致死濃度LD50與莖葉提取物接近。

3 結(jié)論與討論

采用觸殺法測定刺角瓜提取物對南方根結(jié)線蟲的毒殺活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同部位的提取物對南方根結(jié)線蟲有一定的差異，這與一些相關(guān)研究類似 [18]。用1.00 mg/mL的刺角瓜根與莖葉乙醇提取物分別處理，24 h后南方根結(jié)線蟲校正死亡率均超過94%，48 h后均超過98%，殺線蟲活性與陽性對照1 mg/mL阿維菌素相當。莖葉提取物處理24和48 h，對南方根結(jié)線蟲的半致死濃度LD50分別為0.703 2和0.450 3 mg/mL。根提取物處理24和48 h，對南方根結(jié)線蟲的半致死濃度LD50分別為0.493 5和0.484 2 mg/mL。根提取物的24 h殺線蟲活性明顯高于莖葉提取物，48 h殺線蟲活性接近，說明刺角瓜提取物均可以有效抑殺菌方根結(jié)線蟲，根提取物的活性成分濃度可能高于莖葉提取物，有待進一步研究。

刺角瓜，商品名火參果，由于其獨特的外觀、口感及營養(yǎng)價值和含有較多的優(yōu)異遺傳抗性（尤其是根結(jié)線蟲抗性），被引進到國內(nèi)推廣種植 [19-22]。研究表明，刺角瓜對南方根結(jié)線蟲有顯著的抗性，線蟲侵入后取食位點（巨大細胞）形成受阻，可抑制根結(jié)線蟲的生長發(fā)育，這種抗性在刺角瓜（PI202681）中表現(xiàn)為單顯性基因控制 [23]。該研究發(fā)現(xiàn)刺角瓜的根莖葉提取物均可以抑殺南方根結(jié)線蟲，認為刺角瓜是合成某種次生代謝產(chǎn)物對根結(jié)線蟲有一定的毒性，由于植物中含量較少，抑制了根結(jié)線蟲的生長發(fā)育。

研究表明，植物源分離出的化合物中對南方根結(jié)線蟲具有較好毒殺活性的化合物有對苯二酚、DL-薄荷醇、丁子香酚、丁子香酚、香茅醇、DL-薄荷醇、檸檬酸、馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ、馬兜鈴內(nèi)酰胺W、saropeptate、2-（1-oxononadecyl）aminobenzoic acid、草酸、巴豆酸、酒石酸、扁桃酸、蘋果酸和苦豆堿 [24-27]等。張志陽等 [28]對刺角瓜的化學成分進行了研究，結(jié)果表明，火參果中含有氨基酸、有機酸、生物堿、黃酮及苷類、鞣質(zhì)、植物甾醇、三萜、油脂、糖、氰苷成分。該研究為進一步研究刺角瓜根結(jié)線蟲抗性機制提供了依據(jù)，同時，從刺角瓜中分離、提純殺線蟲化合物并鑒定其化學結(jié)構(gòu)，并與高活性植物源殺線蟲化合物進行活性-結(jié)構(gòu)相關(guān)性研究，明確其作用機理，為開展仿生合成環(huán)境友好性、耐儲存、成本低的新型生物農(nóng)藥提供思路。

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