朝鮮淫羊藿內生真菌對宿主生理特性及內在品質的影響

白洋 姜大成 劉玉翠 吳媛 閆莉 肖井雷

摘要：為研究朝鮮淫羊藿內生真菌對朝鮮淫羊藿生理特性及內在品質的影響，探索促進朝鮮淫羊藿生長發(fā)育和內在成分積累的菌株，采用盆栽土培試驗，將從朝鮮淫羊藿植株中分離得到的3種內生真菌進行液體發(fā)酵后施加于其根部，考察分析內生真菌對宿主植物的生物量、葉綠素熒光參數(shù)、光合作用參數(shù)和POD、SOD、PAL、F3′H酶活性以及丙二醛、總黃酮醇苷含量等生長發(fā)育指標和內在品質的影響。結果表明，內生真菌能夠顯著增加朝鮮淫羊藿的生物量，加快其光合速率，提升植物酶活性，降低其丙二醛含量，提高朝鮮淫羊藿總黃酮醇苷及總黃酮含量。

關鍵詞：朝鮮淫羊藿;內生真菌;促生作用;生物菌肥;栽培

中圖分類號： S567.3+90.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0159-06

收稿日期：2021-07-14

基金項目：吉林省科技攻關項目（編號：20190304010YY，20200404001YY）;全國中藥特色技術傳承人才培訓項目（編號：T20194828003）。

作者簡介：白 洋（1996—），女，吉林四平人，碩士，主要從事中藥資源與鑒定研究。E-mail：2027236340@qq.com。

通信作者：肖井雷，博士，副教授，主要從事中藥資源與鑒定研究。E-mail：517932668@qq.com。

朝鮮淫羊藿（ Epimedium koreanum ?Nakai）為《中國藥典》收載的中藥淫羊藿藥用品種之一[1]，是我國很有價值的藥用植物，具有補腎壯陽、祛風除濕等功效[2-3]，是發(fā)展?jié)摿薮蟮牧窒陆洕贩N。近年來，常見報道朝鮮淫羊藿藥材質量較低，難于達到《中國藥典》標準要求，且由于生態(tài)環(huán)境破壞嚴重和人為過度采挖，加上其分布區(qū)域狹窄、有性繁殖能力弱等原因，致使其野生資源匱乏，而人工栽培技術又尚未成熟，這些因素均制約著朝鮮淫羊藿產業(yè)的發(fā)展。故亟待開展野生撫育或人工栽培資源研究，探尋栽培關鍵技術與促生因子也至關重要。

內生真菌是存在于健康的植物體內并能和宿主共生的一類真菌[4]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，某些內生真菌可以加快植物自身的發(fā)育，并能增強其在相同環(huán)境中抵抗外界病害的能力。如促生菌能夠改變干旱脅迫下水稻植株自身激素的積累，減弱因為缺水致使的光合作用中色素的分解和散失，從而加強水稻在極端環(huán)境中的抵抗力[5]。因為內生菌對宿主植物的諸多特殊作用，引起了越來越多的廣泛關注，通過接種內生菌來優(yōu)化宿主植物微生物生態(tài)區(qū)系能在很大程度上促進植物生長發(fā)育及抵御病蟲害等，這也為藥用植物生長發(fā)育的研究提供了新的思路。為了能夠獲取促進朝鮮淫羊藿生長發(fā)育的內生真菌菌株，本試驗對前期分離純化并已進行初步篩選過的3株內生真菌促進朝鮮淫羊藿生長發(fā)育的功能進行了研究，旨在篩選出明顯促進宿主植物生長發(fā)育的優(yōu)勢菌株，為植物生長促進菌劑的研究開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試種苗和供試菌株

供試種苗為野外采集朝鮮淫羊藿同齡級根莖，其原植物經長春中醫(yī)藥大學藥學院姜大成教授鑒定為小檗科植物朝鮮淫羊藿（ Epimedium koreanum ?Nakai）。

3株供試內生真菌分別為 Diaporthe cotoneastri （S 3）、 Trichoderma atroviride （S 6）和 Colletotrichum jasminigenum （S 8），均分離于朝鮮淫羊藿植株，保存于中國微生物菌種保藏中心。

1.2 菌液制備

在等體積的PDB液體培養(yǎng)基中接入供試菌株，放置在28? ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)振蕩器里培養(yǎng) 7 d。把菌液用滅過菌的蒸餾水按10倍稀釋法稀釋，采用血球計數(shù)器來計算菌液濃度，最后配制濃度為1.0×108個/mL。

1.3 試驗設計

試驗于2020年5—8月間在長春中醫(yī)藥大學藥用植物園田間實驗地進行，地理位置125.43°E、43.84°N，海拔約260 m，屬溫帶大陸性氣候，年均氣溫4.3 ℃，年均降水量683 mm，相對濕度69%，郁閉度0.6～0.8。采用盆栽土培方法，將朝鮮淫羊藿根莖定植于直徑23 cm、高16 cm的塑料盆中。所用土壤是嚴格經過熏蒸消毒的腐殖土，含有機質 11.04 g/kg、堿解氮32.36 mg/kg、速效磷 63.53 mg/kg、速效鉀98.46 mg/kg，經過混勻稱量，每盆放入等量的土壤。期間讓其恢復性生長，1個月后，將相同濃度的200 mL菌液施入朝鮮淫羊藿植株根際。每個菌株作為一個試驗組，以不接菌的PDB液體培養(yǎng)基為空白對照。每個處理3個重復，共60盆，每盆栽種3株。接種 60 d 后對各項指標進行測定。

1.4 生長指標測定

試驗組菌苗共生60 d后收獲朝鮮淫羊藿植株，每個處理隨機挑選15株，每個重復組挑選5株，除去泥土洗凈。稱量地上部分鮮質量，測量株高，測定葉面積。隨后將朝鮮淫羊藿植株放置陰涼處陰干至恒質量，測定地上部分干質量和葉片干質量。

1.5 葉綠素熒光特性和光合作用測定

參考文獻[6-7]的試驗方法測定葉綠素熒光特性和光合參數(shù)。每個處理隨機選15株朝鮮淫羊藿植株，每個重復5株，每株測定3次，取平均值。

1.6 葉片酶活性測定

每個處理隨機選15株朝鮮淫羊藿植株，每個重復5株，取各處理組新鮮朝鮮淫羊藿葉片，測定葉片酶活性，每個指標重復測定3次。采用POD、SOD、PAL、F3′H酶活性測定試劑盒按規(guī)定操作步驟測定葉片酶活性。

1.7 丙二醛含量測定

每個處理隨機選15株朝鮮淫羊藿植株，每個重復5株，丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[8]進行。

1.8 總黃酮含量測定

1.8.1 色譜條件 參照李靖等的色譜條件[9]。

1.8.2 溶液的制備 參照2020年版《中國藥典》淫羊藿項下對照品溶液和供試品溶液制備方法[1]進行制備。其中供試品溶液的制備每個處理隨機選15株朝鮮淫羊藿植株，每個重復5株，每株取6張葉，自然陰干。

1.8.3 總黃酮含量測定 參照2020年版《中國藥典》淫羊藿項下總黃酮含量測定方法[1]進行。

1.9 數(shù)據分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，通過單因素方差分析（One-way ANOVA）， LSD 多重比較分析數(shù)據差異顯著性，不同小寫字母表示差異顯著（ P <0.05），數(shù)據以平均值±標準差表示。采用Excel 2010繪圖。

2 結果與分析

2.1 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株生物量的影響

從表1試驗結果可知，施加S 3菌、S 6菌試驗組均能增加朝鮮淫羊藿地上干質量、地上鮮質量和葉片干質量，施加S 3菌比對照組分別增加了218.37%、208.22%、160.00%，施加S 6菌分別比對照增加了300.00%、277.22%、280.00%，且均具有顯著作用（ P <0.05），S 8菌對地上干質量、地上鮮質量、葉片干質量均無顯著作用。

施加S 3菌、S 6菌株試驗組均能增加朝鮮淫羊藿株高和葉面積（圖1），施加S 3菌比對照組分別增加了1.90%、22.07%，施加S 6菌分別比對照增加了13.63%、393.22%，其中S 6菌對促進葉面積增長具有顯著作用（ P <0.05）。而施加S 8菌雖能增加朝鮮淫羊藿株高，但對葉面積有降低作用。

2.2 ?內生真菌對朝鮮淫羊藿植株葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.2.1 初始熒光（ F? o） ?F? o值變化與PSⅡ反應中心狀況和可能的光保護機制有關[10]，該值還與葉片葉綠素含量有關， F? o越高表明葉片中葉綠素含量越高，光合作用越強。由表2可知，朝鮮淫羊藿葉片 F? o值隨感染內生真菌種類不同而變化。3株內生真菌中，除S 8菌株處理的 F? o值小于對照組外，其余菌株處理的 F? o值均大于對照組，且S 3、S 8菌與對照組間具有顯著差異（ P <0.05）。本研究表明，施加S 3菌可使PSⅡ反應中心失活或受破壞程度最高，同時葉綠素含量也最高。

2.2.2 最大熒光（ F? m） 從表2可知，施加S 8菌株 F? m值比對照組降低了25.14%（ P <0.05）;施加S 6菌株 F? m值與對照組無明顯差異;而施加S 3菌株 F? m值則比對照組提高了22.24%（ P <0.05）。本試驗研究表明，施加S 3菌可明顯提高葉片的光合速率，S 8菌則會顯著降低葉片的光合速率。

2.3 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株光合作用參數(shù)的影響

2.3.1 凈光合速率（ P? n） 由表2可知，除S 8菌外，施加S 3菌、S 6菌均能增加朝鮮淫羊藿植株凈光合速率，分別比對照組增加了101.93%、244.44%，其中S 6菌具有顯著作用（ P <0.05）。本研究表明，S 6菌對朝鮮淫羊藿植株的凈光合速率有顯著提高作用。

2.3.2 氣孔導度 氣孔因為能夠使植物與大氣進行水汽和CO 2交換，其張開大小具有一定的決定作用，能夠直接影響光合作用、呼吸作用和蒸騰作用，所以尤為重要。由表2可知，施加S 3、S 6、S 8菌均降低了朝鮮淫羊藿植株氣孔導度，分別比對照組降低了15.54%、60.4%、9.09%，但不顯著（ P >0.05）。

2.3.3 胞間CO 2濃度 胞間CO 2濃度能夠判斷氣孔因素是否與光合速率變化有關，是指植物進行光合作用時細胞內環(huán)境的CO 2濃度。由表2可知，施加S 3、S 6菌胞間CO 2濃度分別比對照組升高了14.79%、4.78%（ P >0.05）;而施加S 8菌株胞間CO 2濃度則比對照組降低了6.68%（ P >0.05）。

2.3.4 蒸騰速率（ T? r） 由表2可知，施加S 3、S 6、S 8菌均降低了朝鮮淫羊藿植株蒸騰速率，分別比對照組降低了21.62%、21.62%、3.23%，但均無顯著作用（ P >0.05）。

2.3.5 水分利用率（ W? e） 植物水分利用率用來綜合性評價植物生長發(fā)育程度，指植物每消耗1單位水所制造出的干物質量。由表2可知，施加S 3、S 6、S 8菌均能增加朝鮮淫羊藿植株水分利用率，分別比對照組增加了204.49%、409.52%、33.22%，其中S 6菌具有顯著性差異（ P <0.05）。

2.4 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株抗氧化酶系統(tǒng)的影響

2.4.1 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株POD活性的影響 從圖2-A可知，施加S 3、S 6、S 8菌的植株POD活性分別比對照組高出1 250%、1 166.67%、1 942.93%，且S 3、S 6、S 8菌試驗組均具有顯著意義（ P <0.05）。研究表明，施加內生菌劑能夠增強POD等抗氧化酶系統(tǒng)活性，進而增強植物對病蟲的抵抗力、減少氧化損傷，使宿主植物構建更穩(wěn)定和高效的活性氧消除系統(tǒng)。

2.4.2 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株SOD活性的影響 從圖2-B可知，施加S 3菌的植株SOD活性最強，顯著高于對照組（ P <0.05）。S 6、S 8菌的植株SOD活性略高于對照組，不具有顯著意義。SOD在增強植株對抗氧化傷害中承擔了不可或缺的角色，本研究表明，施加內生真菌能夠提升植物的保護酶活力，且S 3菌試驗組對SOD活力的促進作用具有顯著性。

2.4.3 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株丙二醛含量的影響 從圖2-C可知，對照組植株的MDA含量最高，S 8菌組次之但與對照組無顯著性差異，S 3、S 6菌組植株的MDA含量均顯著低于對照組（ P <0.05）。S 3、S 6、S 8菌試驗組丙二醛含量分別低于對照組63.15%、61.57%、25.91%。以上結果說明，內生真菌可以提高朝鮮淫羊藿植株的抗氧化能力，從而減輕植物細胞膜受到的傷害。

2.5 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株生長發(fā)育關鍵酶活性影響

2.5.1 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株PAL活性的影響 從圖3-A可知，施加S 3、S 6、S 8菌均能增強植株PAL活性，分別比對照組高出40.66%、58.3%、15.90%，其中S 6菌試驗組具有顯著意義（ P <0.05）。本研究表明，內生真菌的侵染可誘導提高宿主植物生長發(fā)育過程中關鍵酶的活性，從而對植物的生長發(fā)育、構成植物支撐系統(tǒng)等方面起到重要意義。

2.5.2 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株F3′H活性的影響 黃酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3′H）是類黃酮合成途徑中的關鍵酶，其活性的變化對調控類黃酮合成途徑起到至關重要的作用。從圖3-B可知，施加S 6、S 8菌能增強植株黃酮3-羥化酶活性，分別比對照組高出19.16%、25.70%，且均具有顯著意義（ P <0.05）。而施加S 3菌則降低了植株F3′H活性，比對照組降低0.93%，不具備顯著意義。

2.6 內生真菌對朝鮮淫羊藿植株有效成分含量的影響

從圖3-C可知，施加S 6菌能顯著增加朝藿定A和朝藿定B的含量（ P <0.05），分別比對照組增加0.04%和0.03%;施加S 8菌能顯著增加朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷的含量（ P <0.05），分別比對照組增加0.02%、0.12%和0.14%;施加S 3菌則對各成分含量均有降低作用。該結果與S 6、S 8菌顯著增強植株F3′H活性、S 3菌降低植株F3′H活性相一致，說明內生菌可以通過提高黃酮3-羥化酶的活性來增加朝鮮淫羊藿總黃酮醇苷含量。從圖3-D 可知，施加S 6菌能顯著增加總黃酮的含量（ P <0.05），比對照組增加1.13%。施加S 3、S 8菌總黃酮含量無顯著性差異。

3 討論與結論

不同內生真菌促進生長作用機制不盡相同[11-12]，本研究也證實施加不同菌株對朝鮮淫羊藿生長發(fā)育的促生作用體現(xiàn)在不同生理指標上。本研究表明，S 3、S 6菌株均能促進宿主植物生物量的增長，其中S 6菌株的促生效果最好，主要表現(xiàn)在S 6菌株試驗組可明顯增加宿主植物地上部分干鮮質量、葉面積和株高，這與明乾良等的研究結論[13]一致。推測導致促生效果的不同可能是由于內生真菌種類不同，并且內生真菌生理功能較為復雜，也可能是內生真菌導致朝鮮淫羊藿生長發(fā)育過程中對養(yǎng)分的吸收能力不同。有研究報道，內生真菌可以通過分泌或者促進植物自身合成IAA、GA 3等植物生長所需的調節(jié)類物質來增加宿主植物地上或地下部位的生物量[14-16]，或者使植物吸收N、P等營養(yǎng)元素的能力大大提高，從而影響宿主植物的生長[17]。

植物中含有的丙二醛含量與植物在極端環(huán)境脅迫下的抗逆能力有關，其含量隨著植物細胞膜遭到的傷害程度而變化[18-19]。在本研究中施加內生真菌后植株的丙二醛含量顯著降低，說明朝鮮淫羊藿細胞膜系統(tǒng)受到了內生真菌的有效保護。本研究還發(fā)現(xiàn)，內生真菌能夠以增強朝鮮淫羊藿植株體內SOD和POD活力的方式，進而使其自由基和活性氧的消除數(shù)量提高，使其抗氧化性增強。馬敏芝等的試驗結果也表明，在黑麥草受到銹病侵染后，將內生真菌寄生在體內會使其抗氧化酶活性增加、丙二醛含量降低，進而提高黑麥草對銹病的抵抗力[20]。

黃酮3-羥化酶是類黃酮合成過程中其中一個通路的關鍵酶，不僅能夠獨自調節(jié)代謝，而且能夠和類黃酮合成通路中其他酶一同促進黃酮類物質的合成[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，施加內生菌后會提升類黃酮生物合成通路中核心酶的活力，從而增加朝鮮淫羊藿中總黃酮醇苷的含量，為內生菌導致的類黃酮含量增加的機制探究奠定了基礎。

本研究發(fā)現(xiàn)，S 6菌對朝鮮淫羊藿生長發(fā)育促生效果最好，且制備方法簡單，適宜作為朝鮮淫羊藿菌肥組分，為生物菌肥開發(fā)利用及生產優(yōu)質高產藥材提供了科學依據。但S 6菌定量體系、高效富集工藝和菌肥基質配比有待探究。且本研究僅進行盆栽試驗證實了施加內生真菌能夠增加宿主植株的生物量、抗氧化酶活性、有效成分含量等指標，但依然需要進一步進行大田試驗來驗證，并對其具體機制進行深入研究，進而為生物菌肥的開發(fā)提供理論依據。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：2010年版[M]. 增補本.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2014.

[2]單 娜，路金才，王 晶. 朝鮮淫羊藿的研究狀況[J]. 中南藥學，2008，16（6）：722-726.

[3]侯麗麗. 朝鮮淫羊藿有效成分的提取、分離關鍵技術及應用研究[D]. 長春：吉林大學，2011.

[4]Guo L D，Huang G R，Wang Y.Seasonal and tissue age influences on endophytic fungi of ?Pinus tabulaeformis ?（Pinaceae） in the Dongling mountains，Beijing[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2008，50（8）：997-1003.

[5]Brem D，Leuchtmann A.Intraspecific competition of endophyte infected vs uninfected plants of two woodland grass species[J]. Oikos，2002，96（2）：281-290.

[6]禹勝男，孫 睿，宋 萍，等. 內生細菌接種對雷公藤光合生理特征的影響[J]. 江西農業(yè)大學學報，2019，41（5）：963-968.

[7]鮑根生. 禾草內生真菌共生體對根寄生植物光合特性影響的研究[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志，2020，50（3）：1-7.

[8]郝再彬，蒼 晶，徐 仲. 植物生理實驗[M]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學出版社，2004.

[9]李 婧，王英哲，劉玉翠，等. 地理環(huán)境因子對朝鮮淫羊藿黃酮類成分空間分布影響的探測分析[J]. 中國中藥雜志，2019，44（24）：5368-5374.

[10]王劍文，夏仲豪，譚仁祥. 內生真菌 Colletotrichum ?sp.B501的寡糖提取物對黃花蒿發(fā)根中青蒿素生物合成的誘導[J]. 植物學報，2002，44（10）：1233-1238.

[11]陳志為，周艷芬，樊月，等. 臺灣相思內生真菌的分離篩選及其對幼苗生長的影響[J]. 東北林業(yè)大學學報，2019，47（1）：61-64，75.

[12]謝海偉，馮嘉琪，付曉晴，等. 藥用植物內生真菌的研究進展[J]. 江蘇農業(yè)科學，2020，48（14）：1-6.

[13]Ming Q L，Su C Y，Zheng C J，et al. Elicitors from the endophytic fungus ?Trichoderma atroviride ?promote ?Salvia miltiorrhiza ?hairy root growth and tanshinone biosynthesis[J]. Journal of Experimental Botany，2013，64（18）：5687-5694.

[14]吳飛燕，伊力塔，李修鵬，等. 不同光照強度對石櫟幼苗葉綠素含量及葉綠素熒光參數(shù)的影響[J]. 東北農業(yè)大學學報，2012，43（4）：88-92.

[15]刁桂萍，李松陽，王志英.深綠木霉1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶基因的克隆及表達[J]. 東北林業(yè)大學學報，2016，44（8）：104-107.

[16]黃 蓋，高 焓，王 琛，等. ACC脫氨酶活性菌株ACC 30的分離、鑒定及其促生作用[J]. 微生物學通報，2013，40（5）：812-821.

[17]Malinowski D P，Belesky D P. Adaptations of endophyte-infected cool-season grasses to environmental stresses：mechanisms of drought and mineral stress tolerance[J]. Crop Science，2000，40（4）：923-940.

[18]Rodriguez R，Redman R.Balancing the generation and elimination of reactive oxygen species[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（9）：3175-3176.

[19]Jung W J，Jin Y L，Park R D，et al. Treatment of ?Paenibacillus illinoisensis ?suppresses the activities of antioxidative enzymes in pepper roots caused by ?Phytophthora capsici ?infection[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2006，22（9）：901-907.

[20]馬敏芝，南志標. 內生真菌對感染銹病黑麥草生長和生理的影響[J]. 草業(yè)學報，2011，20（6）：150-156.

[21]Himi E，Maekawa M，Noda K. Differential expression of three flavanone 3-hydroxylase genes in grains and coleoptiles of wheat[J]. International Journal of Plant Genomics，2011，2011：369460.