飼喂抗生素前后7齡思茅松毛蟲幼蟲腸道細菌的變化

李雕益 熊忠平 包書軍 李選文 熊智 羅曼

摘要：通過對飼喂抗生素前后7齡思茅松毛蟲幼蟲腸道細菌變化的研究，進一步探索腸道菌群變化對其生長發(fā)育的影響。采用傳統(tǒng)的平板稀釋涂布培養(yǎng)法從思茅松毛蟲7齡幼蟲腸道內分離純化獲得好氧細菌，對其進行多項生理生化測定，利用16S rDNA基因擴增技術對所得菌株進行多樣性分析。結果顯示，飼喂抗生素前獲得4種不同的單菌落A1、A2、A3、A4，飼喂抗生素后獲得5種不同單菌落B1（同A2）、B2（同A3）、B3、B4、B5，對獲得的9株細菌進行基因序列測定，結果得到以芽孢桿菌屬（ Bacillus ）、克雷伯菌屬（ Klebsiella ）、賴氨酸芽孢桿菌屬（ Lysinibacillus ）、微小桿菌屬（ Exiguobacterium ）等為主的腸道細菌。其中，飼喂抗生素前所得菌為芽孢桿菌屬（ Bacillus ）和克雷伯菌屬（ Klebsiella ），飼喂抗生素后細菌種類多了賴氨酸芽孢桿菌屬（ Lysinibacillus ）及微小桿菌屬（ Exiguobacterium ）。說明飼喂抗生素對松毛蟲腸道菌群有影響。

關鍵詞：7齡思茅松毛蟲;抗生素;腸道細菌;16SrDNA;生長發(fā)育

中圖分類號：S433.4;S763.42 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0112-06

收稿日期：2021-07-01

基金項目：國家自然科學基金（編號：3166010405）;云南省重大科技專項（編號：202002AA10007）。

作者簡介：李雕益（1996—），女，云南大理人，碩士研究生，主要從事腸道微生物研究。E-mail：2697642932@qq.com。

通信作者：熊 智，博士，教授，主要從事微生物學和分子生物學研究。E-mail：zhix-swfu@qq.com。

思茅松毛蟲（ Dendrolimu kikuchii ），又稱禇色松毛蟲，隸屬于鱗翅目（Lepidopera）枯葉蛾科（Lasiocampidae）松毛蟲屬（ Dendrolimus ），因最早是在云南思茅發(fā)現(xiàn)而命名[1]，主要分布于云南、四川、湖南、湖北、貴州等省[2]，在云南主要分布于安寧、臨滄、昌寧等地。思茅松毛蟲是我國危害最為嚴重的6種松毛蟲之一，是我國分布最廣、危害最重的針葉類植物食葉害蟲[3]，具有繁殖潛能大、數(shù)量波動明顯、遷移能力強、暴食性明顯等特征[4]。當其大面積暴發(fā)時，會使大量松科植物枯萎死亡，狀如火燒，嚴重影響相關地區(qū)的生態(tài)環(huán)境和旅游業(yè)，給當?shù)厝藗兊纳a生活帶來極大不便[5]。

目前，對于思茅松毛蟲的防治方法主要為營林防治[6]、物理防治[7]、化學防治[8-9]及生物防治[10]。近年來，抗生素的使用，在昆蟲體內產生了一定的抗藥性，成為新型的防治方式。有研究表明，500 μg/mL 利福霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、鏈霉素對家蠶的生長無顯著影響[11];喂食抗生素后，紅棕象甲的腸道菌群結構發(fā)生了明顯的改變[12];氯霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素對小菜蛾腸道的除菌能力較差[13];抗生素影響了斜紋夜蛾的消化能力[14];四環(huán)素處理后稻水象甲成蟲體內的沃爾巴克體屬顯著降低，而經四環(huán)素、慶大霉素處理對體內的細菌無顯著影響[15];殺蚜素對家白蟻具有致死作用，而井岡霉素和慶豐霉素對家白蟻無顯著作用[16]。可見不同種類的昆蟲，其腸道群落組成和腸道微環(huán)境不同，因此對抗生素的抵御能力有所不同。由以上結果，本研究得出采用抗生素來飼喂思茅松毛蟲，可能會改變其腸道中的優(yōu)勢菌，使其種類發(fā)生變化，因此研究飼喂抗生素前后思茅松毛蟲幼蟲腸道菌的變化具有重要意義。

腸道是昆蟲體內重要的消化系統(tǒng)，昆蟲腸道菌的種類會因宿主不同存在很大的差異[17]。昆蟲腸道菌的種類還會因取食食物不同而表現(xiàn)出不同腸道優(yōu)勢菌，不同昆蟲腸道中的優(yōu)勢菌差別很大，這些差別不僅體現(xiàn)在種類上，同時體現(xiàn)在數(shù)量上，這些差異的存在對不同種類昆蟲的生理、免疫等方面具有重要作用[18]。林曉麗以小菜蛾為研究對象，采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法和DGGE電泳法研究其腸道微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)幼蟲腸道中分離得到的細菌最多，且沙雷氏菌屬（ Serratia）和假單胞菌屬（Pseudomonas ）占優(yōu)勢地位[13]。思茅松毛蟲為全變態(tài)昆蟲，要經過蛻皮、化蛹、羽化，這些變化過程中腸道的外骨骼內膜要隨變態(tài)過程蛻出，因此在思茅松毛蟲發(fā)育的每個階段，其腸道需要重建。 重建過程中，腸道微生物也必然隨之重建，因此，思茅松毛蟲幼蟲腸道微生物的多樣性具有很大的研究意義。

本研究從腸道細菌出發(fā)，探討飼喂抗生素前后思茅松毛蟲腸道菌的變化，初步揭示抗生素對思茅松毛蟲腸道菌的改變和影響，為后續(xù)探討菌群變化抑制思茅松毛蟲宿主的生長發(fā)育，從而進一步利用抗生素開發(fā)新的殺蟲劑提供依據(jù)和參考，最終達到對思茅松毛蟲防治的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗時間為2018年7月至2019年3月。

試驗地點為西南林業(yè)大學生命科學學院實驗室。

思茅松毛蟲7齡幼蟲樣本（圖1）采自云南省安寧市草鋪鎮(zhèn)森林地區(qū)（24°31′～25°6′N、102°8′～102°37′E），平均海拔1 968 m。根據(jù)安寧市森林的情況在方圓1 km2范圍內隨機挑選10個樣品點，每個樣品點采集7頭健康7齡幼蟲，共計70頭，并連同7齡幼蟲所在的樹枝帶回實驗室飼養(yǎng)，為后續(xù)研究做準備。

1.2 分離培養(yǎng)基與試劑、容器

平板分離純化培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）[19]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

培養(yǎng)基及生理生化鑒定所用分析純、化學試劑，均購自西隴化工股份有限公司;Ezup 柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;PCR擴增體系試劑，購自碩擎生物科技有限公司。

1.3 腸道細菌的分離純化

選取50頭健康7齡幼蟲，在恒溫22～24 ℃、恒濕80%～85%條件下用無菌水喂養(yǎng)幼蟲，40 h后待其排空體內食物殘渣后進行試驗。將思茅松毛蟲幼蟲置于冰上3～5 min，待其昏迷;采用70%乙醇擦拭蟲體表面30 s，0.25%次氯酸鈉沖泡1 min，無菌水沖洗3次;將體表消毒好的蟲子固定于無菌蠟盤上，在無菌環(huán)境下操作，使用滅菌后的細尖鉗將昆蟲腹部剖開，取出整個腸道，并立即用0.9%無菌NaCl溶液沖洗表面2次，然后將腸道取出后置于無菌離心管中，向離心管中加入1 mL PBS緩沖液研磨成勻漿、備用。

將上述腸道勻漿吸取1 mL置于9 mL PBS緩沖液中，稀釋成10-1，按照10的倍數(shù)梯度稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液，吸取每個濃度稀釋液100 μL分別涂布于NA培養(yǎng)基中，每個梯度涂3個平板，作為試驗組。取最后1次清洗的無菌水100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，作為空白對照。涂板均勻后將培養(yǎng)平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后觀察空白對照是否有菌落形成，若無菌落長出，則選擇單菌落數(shù)在30～300培養(yǎng)皿，根據(jù)涂有腸道內容物懸液培養(yǎng)皿上的單菌落的不同特征，挑取單菌落至新的NA培養(yǎng)基平板上，采用分區(qū)劃線法進行純化，直至菌株形態(tài)基本一致，得到純菌株。將得到的菌種保藏于NA斜面培養(yǎng)基中，4 ℃保存?zhèn)溆?。取利福霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素各0.5 g溶解于1 000 mL無菌水中，配制成混合的抗生素溶液，置于4 ℃冰箱備用。將配制的抗生素溶液均勻噴灑于油杉葉片后放入培養(yǎng)皿中，待7齡松毛蟲食用1周后再提取其腸道細菌，方法同上，設置3個重復。

1.4 7齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的形態(tài)觀察

將經分離純化得到的純菌株用平板劃線法接種于新的NA平板上，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h，待菌落長成后，參考《微生物學實驗指導》[20]對菌落進行染色，并在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)（圖2、圖3），依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]對其特征進行描述鑒定。

1.5 7齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的生理生化鑒定

按照朱旭芬等的微生物生理生化鑒定方法[22-23]，對分離純化后所有菌進行淀粉水解、油脂水解、明膠液化的生理生化測定及抗生素抗性測定，包括氨芐青霉素、紅霉素、新霉素硫酸鹽和鏈霉素的抗性測定。4種抗生素分別取5、50、100、300 μg/mL 等4個濃度進行抗性測定。對7齡幼蟲腸道細菌進行生理生化鑒定。

1.6 7齡幼蟲腸道細菌16S rDNA分子鑒定

1.6.1 腸道細菌基因組DNA提取及PCR擴增

將1 mL過夜培養(yǎng)的細菌菌液按照Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取7齡幼蟲腸道細菌基因組DNA。提取出的細菌基因組DNA采用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，得到片段符合細菌基因組DNA大小后，將檢測合格的DNA產物作為16S rDNA序列擴增模板。擴增引物[23]選擇正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴增體系：25.0 μL 2× Taq ?PCR MasterMix;3.0 μL模板DNA;10.0 μmol/L 正向引物27F和反向引物1492R各1.0 μL;雙蒸水補充至50.0 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸3 min，30 個循環(huán);72 ℃終延伸 5 min，-20 ℃保存。取4.0 μL PCR擴增后的產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將檢測合格的PCR擴增產物送至碩擎生物科技有限公司測序。

1.6.2 7齡幼蟲腸道細菌系統(tǒng)發(fā)育樹構建

測得的序列通過DNAMAN 6.0軟件進行矯正及拼接，拼接完成后的16S rDNA序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/中與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST同源性比對，選出與菌株相似度最高的序列，運用軟件MEGA 7.0構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，自檢法檢測1 000次判定其分類學關系。

2 結果與分析

2.1 7齡松毛蟲腸道好氧細菌的分離

7齡松毛蟲中腸道勻漿懸液經倍比稀釋涂布培養(yǎng)后，松毛蟲腸道細菌經4次劃線純培養(yǎng)后，飼喂抗生素前獲得4種不同的單菌落A1、A2、A3、A4，飼喂抗生素后獲得5種不同的單菌落B1（同A2）、B2（同A3）、B3、B4、B5，表明抗生素飼喂能有效改變松毛蟲腸道菌群。

2.2 7齡幼蟲腸道細菌形態(tài)特征

由表1可知，9株菌株中多數(shù)菌株的革蘭氏染色結果呈陽性，僅有3株呈陰性。所有菌株均為桿狀;大部分菌株邊緣整齊，A1邊緣呈鋸齒狀;所有菌株在固體培養(yǎng)基上不透明。

2.3 松毛蟲腸道細菌生理生化鑒定及多樣性分析

經過聚類分析可知，在歐式距離3左右處，可將9個細菌類群劃分為2個遺傳聚類組，B4、B5自成一類，其他7個細菌類群為一類。其中，A2、B1屬于一類，A1、A3、A4、B2、B3屬于一類（圖4）。

結合生理生化指標（表2、圖4）、細菌的形態(tài)特征（圖2）、菌落（圖3）及顯微形態(tài)特征（表1），查詢細菌鑒定手冊后，將分離到的9種細菌初步鑒定為：A1、A3、A4、B2、B3均屬于芽孢桿菌屬（ Bacillus sp.），A2、B1為克雷伯菌屬（ Klebsiella ?sp.），B4為賴氨酸芽孢桿菌屬（ Lysinibacillus ?sp.），B5為微小桿菌屬（ Exiguobacterium ?sp.）。部分菌株因為菌種形態(tài)過于相似，需進行后續(xù)分子生物學鑒定。

2.4 7齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌16S rDNA PCR擴增結果

分離純化的思茅松毛蟲腸道細菌的基因組DNA檢測合格后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖5可知，在凝膠成像系統(tǒng)中從左到右10個條帶分別為marker、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、B5，PCR擴增條帶清晰，均在1 500 bp左右。將PCR產物送至碩擎生物科技有限公司進行測序。

2.5 7齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌16S rDNA分析結果

將所獲9種細菌形態(tài)7齡幼蟲腸道細菌16S rDNA序列在GenBank中注冊，獲得GenBank登錄號，由表3可知，分離到7齡幼蟲腸道細菌與相應菌株的16S rDNA序列相似度在97%～100%之間。隸屬于4個屬、7個類群，初步鑒定結果如下：A1為芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（ B. subtilis ）;A2（同B1）為克雷伯菌屬的催產克雷伯氏菌（ K. aoxytoca ）;A3（同B2）為芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌（ B. pumilus ）;A4為芽孢桿菌屬的空氣芽孢桿菌（ B. aerius ）;B3為芽孢桿菌屬的高地芽孢桿菌（ B. altitudinis ）;B4為賴氨酸芽孢桿菌屬的木聚賴氨酸桿菌（ L. xylanilyticus ）;B5為微小桿菌屬的金橙黃微小桿菌（ E. aurantiacum ），相似度均>97%。這些思茅松毛蟲7齡幼蟲腸道細菌均不能夠確定其真正的種屬地位，需要做進一步研究以鑒定其分類學地位。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹

將7齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖6可知，思茅松毛蟲7齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌歸屬于2個大類，第一大類為厚壁菌門，分別為芽孢桿菌屬（ Bacillus ?sp.）、賴氨酸芽孢桿菌屬（ Lysinibacillus ?sp.）、微小桿菌屬（ Exiguobacterium ?sp.）;第二大類為變形菌門，為克雷伯菌屬（ Klebsiella ?sp.）。從系統(tǒng)發(fā)育樹狀觀察，這7株菌屬于4個屬，其中芽孢桿菌屬可能是7齡思茅松毛蟲腸道細菌中的優(yōu)勢菌株。

4 結論與討論

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對松毛蟲腸道菌進行分離培養(yǎng)，飼喂抗生素前后共得到7株細菌，經過測序后結果屬于芽孢桿菌屬、克雷伯菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和微小桿菌屬。其中，6株細菌（A1、A3、A4、B3、B4、B5）歸類于厚壁菌門，另外1株（A2）歸類于變形菌門，這與其他鱗翅目昆蟲舞毒蛾、棉鈴蟲、家蠶等基本一致，說明厚壁菌門和變形菌門細菌在麟翅目昆蟲中普遍存在。

課題組前期已對采自普洱市寧洱縣磨黑鎮(zhèn)健康的思茅松毛蟲7齡幼蟲做了關于腸道細菌的研究[24]，研究表明，采自寧洱縣的7齡幼蟲腸道細菌共分離得到14種細菌，隸屬于3個屬，而采自安寧地區(qū)的7齡幼蟲分離到4株腸道細菌，隸屬于2個屬、4個類群。從寧洱縣采集的7齡幼蟲的優(yōu)勢菌屬為腸桿菌屬（ Enterobacteer ?sp.），而從安寧地區(qū)采集的7齡幼蟲的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬（ Bacillus sp.），說明不同地區(qū)的思茅松毛蟲具有不同的優(yōu)勢菌屬，也有不同的菌種。

在飼喂抗生素后，7齡思茅松毛蟲幼蟲腸道細菌的菌種發(fā)生變化，從生態(tài)學方面分析其原因可能是抗生素影響了松毛蟲腸道菌中生態(tài)位的優(yōu)勢菌種，使腸道菌中生態(tài)位的優(yōu)勢菌種發(fā)生了變化，而原來的優(yōu)勢菌種不再占據(jù)生態(tài)位，從而導致菌種的變化;或者是抗生素破壞了腸道中的一些競爭性菌，使腸道中產生了另外一些菌，從而使腸道菌的菌群結構發(fā)生了變化，進而導致菌種種類變多。

對7齡思茅松毛蟲飼喂利福霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、鏈霉素所配制成的混合抗生素溶液，其腸道群落細菌組成主要為變形菌門、厚壁菌門，而其他菌門未檢出，說明7齡思茅松毛蟲腸道中的其他菌門在其腸道環(huán)境中對抗生素較敏感。腸道中的部分優(yōu)勢菌群被抑制后，其他不受抗生素作用的菌群成為優(yōu)勢物種。而飼喂抗生素后芽孢桿菌屬仍為優(yōu)勢物種，說明芽孢桿菌屬在7齡思茅松毛蟲幼蟲腸道環(huán)境中對 500 μg/mL利福霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、鏈霉素的共同作用有很強抗性。

近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，可不依賴純培養(yǎng)通過宏基因學技術[25-26]直接對腸道細菌的總DNA進行提取，進而分析出整個腸道的細菌種類，為研究昆蟲的腸道資源庫提供全面的研究基礎。因此，通過純培養(yǎng)技術分離得到的7齡幼蟲腸道細菌只是其中很少的一部分，需要結合宏基因組技術，才能得到較為全面的細菌類群。

思茅松毛蟲是林業(yè)重要的害蟲，對其腸道微生物的研究，不僅可以補充昆蟲腸道微生物資源庫，還可以據(jù)此進一步分析腸道細菌對昆蟲生長發(fā)育的影響，最終得到防治思茅松毛蟲的生物制劑，從而減少林業(yè)害蟲的危害。

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