繡球葉斑病病原鑒定及其生物學特性

陳慧杰 鄧衍明 齊香玉 陳雙雙 馮景 韓勇 王華娣 秦紫藝

摘要：繡球葉片對植物病原體的入侵非常敏感，極易發(fā)生病害，尤其是葉斑病，其發(fā)生會引起葉片呈現(xiàn)大小不一的病斑，嚴重時會導致葉片病死、脫落，甚至整株死亡，嚴重影響繡球的生長及開花質(zhì)量。為明確引起繡球葉斑病的病原菌種類，在對繡球葉斑病田間發(fā)病癥狀進行觀察的基礎上，采用組織分離培養(yǎng)法從繡球Bailer的病葉上獲得5種病原真菌分離物;通過致病力檢測試驗，從5種病原真菌分離物中篩選到強致病力菌株H-3-1;采用形態(tài)學觀察結(jié)合rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析法對病原菌H-3-1進行鑒定，表明其為棒孢屬多主棒孢菌;進一步通過菌落生長法測定H-3-1的生物學特性，發(fā)現(xiàn)病原菌H-3-1菌絲生長的最適溫度為28 ℃，最適pH值為8，最適碳源為乳糖，最適氮源為蛋白胨。結(jié)果為繡球棒孢葉斑病的病原學研究提供依據(jù)，也可為該病害的科學防治提供參考。

關(guān)鍵詞：繡球;葉斑病;病原菌鑒定;生物學特性

中圖分類號： S436.8+1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0106-06

收稿日期：2021-09-07

基金項目：國家自然科學基金（編號：31901359）;江蘇省蘇州市科技計劃（編號：SNG201923）;江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項目（編號：SYF2021C0029）。

作者簡介：陳慧杰（1989—），女，河南周口人，博士，助理研究員，從事觀賞植物栽培與植物病理學研究。E-mail：chenhuijie2020@163.com。

通信作者：鄧衍明，博士，研究員，從事花卉遺傳育種與栽培技術(shù)研究。E-mail：nksdym@163.com。

繡球品種繁多、株型優(yōu)美、花期較長，極具應用價值和經(jīng)濟價值，不僅能用于園林綠化和家庭美化，還可作為盆花、鮮切花、插花、干花及藥用植物，被譽為世界三大花園植物之一，在花卉產(chǎn)業(yè)中占有重要地位[1-2]。但關(guān)于繡球的研究主要集中于栽培技術(shù)、雜交育種和分子生物學特性等方面，較少涉及病害[3-5]。事實上，繡球葉片對植物病原體的侵染非常敏感，極易發(fā)生各種病害，尤其是葉斑病[6]。繡球葉斑病發(fā)生時，葉片呈現(xiàn)圓形或近圓形的葉斑，嚴重時會出現(xiàn)葉片病死、脫落，甚至整株死亡的現(xiàn)象，很大程度上影響繡球的生長及開花質(zhì)量[1，7]。

葉斑病是一類世界范圍內(nèi)常見的植物真菌病害[8]，主要由真菌門（Eumycota）半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）暗色孢科（Dematiaceae）棒孢屬（ Corynespora ）致病真菌引起[9]。葉斑病于1906年在歐洲種植的黃瓜上被首次發(fā)現(xiàn)并報道[10]，1936年在非洲發(fā)現(xiàn)它能夠引起橡膠落葉[11]。此后，該病害在包括我國在內(nèi)的70多個國家中均有發(fā)生，給300多個屬的500多種植物帶來了危害[12-13]。雖然葉斑病在繡球?qū)僦参锷习l(fā)現(xiàn)的相對較晚，但在我國多地均有發(fā)生，尤其在長江中下游地區(qū)夏季高溫高濕的環(huán)境下極易暴發(fā)，成為危害最嚴重的病害，極大地降低了繡球產(chǎn)品的觀賞價值和經(jīng)濟價值[6，14]。

迄今為止，與黃瓜[15-17]等蔬菜植物相比，觀賞植物上有關(guān)葉斑病病原鑒定及病原生物學特性的研究均較少，關(guān)于繡球葉斑病的研究更少且不夠深入系統(tǒng)，多集中在病害調(diào)查及自然條件下繡球品種的葉斑病抗性比較等方面[1]。因此，本研究通過對江蘇省南京地區(qū)繡球葉斑病的病原菌進行分離、鑒定，以及對病原菌rDNA的ITS區(qū)序列進行分析，從而明確了南京地區(qū)繡球葉斑病的病原菌為棒孢菌，并進一步研究了該病原菌菌絲生長的相關(guān)生物學特性，旨在為繡球棒孢葉斑病的病原學研究提供依據(jù)，也為該病害的科學防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 繡球葉斑病癥狀觀察與病樣采集

2020年9月于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院繡球種質(zhì)資源圃中進行繡球葉斑病的癥狀觀察、記錄和拍照，重點觀察病害部位、病斑大小、形狀和顏色，并采集具有葉斑病典型特征的病葉樣品，供下一步進行病原菌的分離使用。

1.2 病原菌分離、純化與保存

用自來水沖洗采集的葉片，在超凈工作臺上剪取病健交界處的小塊組織（約2 mm×2 mm），浸入70%乙醇中消毒10 s，再轉(zhuǎn)入15%過氧化氫（H 2O 2）中消毒15 min，隨后在無菌水中沖洗，并重復此消毒過程2次。將葉片置于滅過菌的濾紙上，吸干水分，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上。將接種后的培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 2～3 d，當培養(yǎng)基上植物材料周圍出現(xiàn)小菌落時，在菌落邊緣切取小圓餅（直徑約5 mm），接種于新的PDA培養(yǎng)基上，進一步挑單孢培養(yǎng)直至純化。純化后，將菌株再次接種到新的PDA平板培養(yǎng)基上備用。保存時，沿菌落邊緣切取直徑約為5 mm的菌餅3個，置入裝有30%甘油（500 μL）和馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基（500 μL）的2 mL離心管中[18]。

1.3 病原菌致病力檢測

采集繡球Bailer（ Hydrangea macrophylla ?‘Bailer’，商品名為Endless Summer，中文譯為無盡夏）相同葉位（從上往下數(shù)第3葉位）、大小相似、新鮮健康的葉片，置于自來水下流水沖洗30 min進行表面消毒。然后將葉片置入鋪有2層濕潤濾紙（無菌水潤濕）的培養(yǎng)皿中，再在葉面的相同位置接種直徑 5 mm 的菌餅，每個菌株5次重復。取相同大小的PDA培養(yǎng)基圓餅置于健康葉片相同部位作為對照。將接種后的培養(yǎng)皿放入25 ℃培養(yǎng)箱中先進行暗培養(yǎng)，48 h后置于溫度周期為25 ℃/18 ℃、光周期為16 h/8 h的條件下培養(yǎng)。在接種后0、5、10、15 d分別觀察并記錄葉片的發(fā)病情況，根據(jù)葉片的發(fā)病程度和病斑直徑篩選出致病力最強的菌株[18]。

1.4 病原菌形態(tài)觀察與分子鑒定

觀察強致病力菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)和子實體的有無、大小等。將篩選出的強致病力菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d;在無菌操作臺上用滅過菌的牙簽刮取少量表面菌絲，采用真菌DNA提取試劑盒（廣州歐米伽生物科技公司）提取其基因組DNA。將提取后的DNA用引物ITS1F/ITS4進行PCR擴增，產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠、純化后進行測序。采用NCBI-Blast進行序列比對，并用Mega 5.05軟件構(gòu)建Neighbor Joining系統(tǒng)進化樹[19]。

1.5 病原菌生物學特性研究

1.5.1 碳源對病原菌菌絲生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎，將其中的蔗糖分別等量替換成葡萄糖、果糖、淀粉和乳糖等不同碳源;取直徑約5 mm的菌餅置于不同碳源的培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng) 7 d 后，用十字交叉法[20]測定菌落直徑，每個處理重復3次。

1.5.2 氮源對病原菌菌絲生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎，將其中的硝酸鈉分別等量替換成蛋白胨、酵母浸粉、磷酸氫二胺和甘氨酸等不同氮源;取直徑約為5 mm的菌餅置于不同氮源的培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測定菌落直徑，每個處理重復3次。

1.5.3 溫度對病原菌菌絲生長的影響

取直徑約為5 mm的菌餅置于PDA培養(yǎng)基上，分別置于25、28、37、42 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測定菌落直徑，每個處理重復3次。

1.5.4 pH值對病原菌菌絲生長的影響

用 0.1 mol/L 鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8、9、10的PDA培養(yǎng)基，取直徑約5 mm的菌餅置于各培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測定菌落直徑，每個處理重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007對試驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與整理，并采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和差異顯著分析（SSR法， P <0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球葉斑病癥狀

繡球葉斑病主要危害繡球的葉片，在繡球的全生育期均可發(fā)病，且老葉發(fā)病更為嚴重。發(fā)病葉片初始時呈褪綠色小點;中期時逐漸形成直徑一般為 2～3 mm 的圓形或近圓形病斑，病斑邊緣呈灰紫色;發(fā)病后期，病斑連成一片，葉片變黃、脫落，甚至整株枯死（圖1）。

2.2 繡球葉斑病主要病原菌

將繡球Bailer葉斑病發(fā)病葉片組織中分離到的菌株進行科赫法則驗證，得到5種繡球葉斑病的病原菌：H-3-1、H-4、H-6-1、H-7、H-8-1。將這些菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，由圖2可知，各菌落突起絮狀，由大量孢子生成而呈粉質(zhì)。其中，H-3-1和H-4菌落正面顏色呈灰色，H-6-1、H-7、H-8-1菌落正面顏色呈白色。

2.3 強致病力菌株的篩選

由圖3可知，分別用菌株H-3-1、H-4、H-6-1、H-7、H-8-1侵染繡球Bailer健康離體葉片10 d時，病斑直徑開始呈現(xiàn)明顯差異;侵染 15 d 時，菌株H-3-1侵染離體葉片的病斑平均直徑最大，為4.60 cm，而其他4個菌株的葉片病斑平均直徑分別只有2.75、3.07、1.23、1.38 cm，故H-3-1 的致病力最強。

2.4 強致病力菌株H-3-1的形態(tài)特征

繡球葉斑病強致病力菌株H-3-1的菌落在PDA平板培養(yǎng)基正面呈灰褐色，突起絮狀，由大量孢子生成而呈粉質(zhì)（圖4-a）;菌落背面呈淺黃至黃褐色（圖1-b）。在顯微鏡下觀察，可見菌絲致密、有分枝（圖4-c）;分生孢子形態(tài)呈圓柱形或倒棍棒形，半透明至淺褐色，具有假隔膜（圖4-d）。故從形態(tài)學特征的角度，繡球葉斑病強致病力菌株H-3-1 符合棒孢屬（ Corynespora ?spp.）菌株特征。

菌株H-3-1的ITS基因測序結(jié)果與NCBI核酸序列比對后結(jié)果表明，該菌株與多主棒孢菌（ Corynespora cassiicola ）（KF928286.1）菌株的相似性為100%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支（圖5）。結(jié)合菌株形態(tài)特征，確定該菌株為多主棒孢菌（ C. cassiicola ），命名為H-3-1。

2.5 強致病力菌株H-3-1的生物學特性

繡球葉斑病強致病力菌株H-3-1在不同碳源、氮源、溫度和pH值條件下的菌絲生長情況如圖6所示。H-3-1在不同碳源條件下的菌絲生長速度依次表現(xiàn)為乳糖 > 果糖 > 葡萄糖 > 蔗糖> 淀粉，但在前4種碳源中菌絲的生長速度無顯著差異，只有淀粉中菌絲生長速度顯著低于果糖和乳糖處理處理;H-3-1在不同氮源條件下的生長速度表現(xiàn)為蛋白胨>磷酸氫二銨>硝酸鈉>甘氨酸>酵母浸粉，但5種處理間差異并不顯著;H-3-1在不同溫度條件下的生長速度依次表現(xiàn)為28 ℃>25 ℃>37 ℃>42 ℃，其中28 ℃培養(yǎng)下的生長速度顯著快于其他溫度，故28 ℃是最適生長溫度;H-3-1的最快生長pH值為8，在該pH值下的生長速度顯著快于pH值為5的生長條件，但與其他處理間無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于植物病原真菌的鑒定，傳統(tǒng)形態(tài)學方法常通過菌株和孢子形態(tài)特征的觀察進行[21]。由于寄主、培養(yǎng)條件等因素的變化，病原真菌的形態(tài)特征也會發(fā)生一定程度的改變，這給傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法帶來了一定困難[22]。然而，病原真菌rDNA的ITS區(qū)段序列既具保守性，又在科、屬、種水平上具有特異性[23]。因此，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，通過rDNA-ITS序列分析技術(shù)進行植物病原真菌的診斷、檢測及系統(tǒng)進化分析，使得病原真菌的分類與鑒定更加準確[24]。如崔曉霞等在對甜葉菊葉斑病病原菌分離、鑒定的研究中，采用了形態(tài)學觀察和系統(tǒng)進化分析相結(jié)合的方法，確定了甜葉菊葉斑病的致病菌株為炭疽菌（ Colletotrichum ?spp.）和鏈格孢菌（ Alternaria ?spp.）[25];鐘文文等通過形態(tài)學特征觀察和rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合科赫法則和葉部解剖特征觀察，明確劍蘭葉斑病的病原真菌為葡萄殼小圓孢菌（ Coniothyrium vitivorum ?Miura）[26]。本研究在形態(tài)觀察的基礎上，結(jié)合rDNA-ITS序列分析及致病力檢測，從繡球‘Bailer’的發(fā)病葉片中成功分離并鑒定了繡球葉斑病強致病力菌株多主棒孢菌H-3-1。

關(guān)于葉斑病主要病原菌的研究表明，多主棒孢菌、 Cercosospora ?spp.、 Myrothecium roridum、Glomerella cingulata、Phoma exigua、Botrytis cinerea 均能引起葉斑病的發(fā)生，其中，多主棒孢菌占葉斑病分離菌株的一半以上，是葉斑病最主要的病原菌之一[27]。本研究中，通過致病力檢測、形態(tài)學觀察和分子鑒定，表明分離出的繡球葉斑病強致病力菌株H-3-1為多主棒孢菌。這是首次分離鑒定出繡球葉斑病強致病力病原菌株并明確其分類學地位。已有研究表明，病原菌多主棒孢菌入侵葉片不需要傷口，可通過葉片氣孔自然侵入，還可通過空氣或雨水傳播，且寄主范圍廣，對不良環(huán)境的抵抗力強，能夠以菌絲、厚垣孢子、分生孢子等形態(tài)在土壤、種子、保護地的越冬植物上過冬[12，28]。因此，應根據(jù)病原物的這些特點，有針對性地采取繡球葉斑病科學的防治措施。

本研究發(fā)現(xiàn)，繡球葉斑病強致病力菌株H-3-1菌絲生長的最適溫度是28 ℃，最適pH值為8，這些研究結(jié)果與張笛等在甜瓜、黃瓜上分離出的棒孢葉斑病菌的研究結(jié)果[20，29]一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)以乳糖為碳源、蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基更有利于病原菌H-3-1菌絲的生長，這一點與已有報道不同。王爽等在甜瓜棒孢葉斑病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲生長的最適碳源為乳糖，最適氮源為硝酸鈉[29];張笛等在黃瓜棒孢葉斑病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲生長的最適碳源為甘露醇，最適氮源為甘氨酸[20]。這部分研究結(jié)果與已有報道的差異可能與病原菌對不同地理環(huán)境和不同來源寄主的適應性不同有關(guān)[30]。通過對病原菌生物學特性及該病害的流行、蔓延時間可以推測出，該病菌具有喜溫好濕的特點。因此，本研究中分離與鑒定出的繡球棒孢葉斑病病菌強致病力菌株H-3-1及其生物學特性的研究，不僅為該病的診斷與防治提供了科學的理論依據(jù)，也為今后開展繡球棒孢葉斑病病菌致病物質(zhì)和致病機制研究提供了重要的參考。

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