微生物菌群培養(yǎng)組學(xué)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

楊玉潔

【摘要】近年來(lái)，培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展使得可培養(yǎng)的人體細(xì)菌庫(kù)劇增，人們對(duì)宿主-細(xì)菌之間相互作用關(guān)系的認(rèn)知進(jìn)一步加深。培養(yǎng)組學(xué)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用使可培養(yǎng)的細(xì)菌大量增加，在臨床致病菌分離鑒定中發(fā)現(xiàn)了新的分類(lèi)群，且減少了在宏基因組學(xué)研究中的尚未明確分配的操作分類(lèi)單元。本篇綜述在介紹培養(yǎng)組學(xué)研究方法的同時(shí)，重點(diǎn)介紹培養(yǎng)組學(xué)新技術(shù)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，并展望其未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

【關(guān)鍵詞】培養(yǎng)組學(xué);微生物菌群;動(dòng)物醫(yī)學(xué)

1培養(yǎng)組學(xué)在反芻動(dòng)物瘤胃微生物研究中的應(yīng)用

1.1瘤胃微生物純培養(yǎng)技術(shù)

Hungate滾管技術(shù)以及手套厭氧培養(yǎng)箱已廣泛應(yīng)用于厭氧微生物的分離培養(yǎng)。由于不同的微生物對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境和特殊偏好營(yíng)養(yǎng)物的需求各異，研究者可據(jù)此設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)方案對(duì)其進(jìn)行篩選、分離、鑒定、純培養(yǎng)。培養(yǎng)和篩選過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)整生長(zhǎng)環(huán)境參數(shù)（如培養(yǎng)基酸堿度、營(yíng)養(yǎng)因子等）抑制雜菌生長(zhǎng)，從而減少雜菌對(duì)目標(biāo)微生物增殖的影響。主要的操作方法為在厭氧室內(nèi)取部分瘤胃內(nèi)容物樣品，厭氧環(huán)境：50mL·L-1H、200mL·L-1HCO2、750L·L-1H采用0.22μm濾膜過(guò)濾后的1×厭氧磷酸鹽緩沖液，以10倍稀釋法將樣品從原液稀釋至10-6濃度。每塊培養(yǎng)基分別接種100μL不同濃度的樣品混合液，在厭氧室內(nèi)39℃培養(yǎng)3d。作為空白對(duì)照，每種培養(yǎng)基類(lèi)型取2個(gè)培養(yǎng)基，不進(jìn)行接種，與其他培養(yǎng)基一起孵育。此外，取適量用于稀釋瘤胃樣品的緩沖液，接種至培養(yǎng)基作參照。上述培養(yǎng)結(jié)束后，取1mL無(wú)菌無(wú)氧的8.5g·L-1NaCL溶液均勻刮洗平板，用吸管收集該平板上所有的微生物，以備后續(xù)鑒定。以現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，不斷地改進(jìn)培養(yǎng)設(shè)備，綜合并優(yōu)化各項(xiàng)培養(yǎng)條件/方式，可以更好地對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行體外純培養(yǎng)。

1.2培養(yǎng)基類(lèi)型、樣品稀釋度和系統(tǒng)發(fā)育與瘤胃微生物可培性的關(guān)系

反芻動(dòng)物瘤胃微生物群的培養(yǎng)是瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。隨著瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)研究技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)微生物功能得以深入研究。計(jì)算機(jī)科學(xué)與自然生命科學(xué)的交叉融合，使得組學(xué)技術(shù)在詮釋瘤胃微生物的組成功能及代謝特征中作用凸顯，尤其是在瘤胃微生物資源研究中，培養(yǎng)組學(xué)的重要性不言而喻。在瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)研究中找出該系統(tǒng)生境中可被培養(yǎng)的部分以及各種影響其可培性的因素十分重要。采集樣品的稀釋度與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的各種類(lèi)型的培養(yǎng)基都會(huì)影響瘤胃微生物的可培性，說(shuō)明在體外重建瘤胃微生物系統(tǒng)仍需要大量細(xì)致的培養(yǎng)條件試驗(yàn)和探索。研究人員通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物的復(fù)雜性及其功能譜系遠(yuǎn)超預(yù)期。因此，通過(guò)對(duì)瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)行體外重建，以深入了解其生態(tài)/生物功能，對(duì)開(kāi)發(fā)應(yīng)用瘤胃微生物資源具有重要意義。

2培養(yǎng)組學(xué)在人體腸道微生物研究中的應(yīng)用

2.1可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)的增加

近10年，隨著宏基因組學(xué)在微生物研究中的應(yīng)用，人類(lèi)對(duì)腸道微生物區(qū)系的認(rèn)識(shí)似乎已經(jīng)到了平臺(tái)期，隨著培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展，腸道中的一些“暗物質(zhì)”逐漸被揭開(kāi)。一些通過(guò)分子手段鑒定不到的“Unclassified”逐漸被培養(yǎng)鑒定，不斷有新培養(yǎng)得到的細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)被收入人類(lèi)腸道細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2018年，通過(guò)培養(yǎng)方式首次分離得到的菌種已經(jīng)由2015年統(tǒng)計(jì)的2172種增加到2776種，所增加的604種細(xì)菌中，有372種分離自腸道。研究人員在2012年首次采用培養(yǎng)組學(xué)分離鑒定到174個(gè)以前在人類(lèi)腸道中從未培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌，并對(duì)其中31個(gè)新細(xì)菌的基因組測(cè)序，產(chǎn)生了約1萬(wàn)個(gè)新的未知基因，這不僅擴(kuò)充了細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)有助于細(xì)菌基因功能的深入發(fā)掘。該團(tuán)隊(duì)從2012年到2015年共發(fā)現(xiàn)新種121種，其中有91種是通過(guò)培養(yǎng)得到，占比達(dá)75%。假設(shè)細(xì)菌與最接近它的標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性小于98.65%則被定義為疑似新種，那么使用培養(yǎng)方法每周就能確定1～25個(gè)疑似新種。到2017年，該團(tuán)隊(duì)共從人體中分離培養(yǎng)出329個(gè)新細(xì)菌，使已知的人類(lèi)細(xì)菌庫(kù)增加了29%，且首次從人體內(nèi)分離到4種古生菌，其中包括2個(gè)新菌種。通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)增加人類(lèi)微生物資源庫(kù)，有助于研究人員從發(fā)現(xiàn)的新細(xì)菌中開(kāi)發(fā)安全有效的適用于人體的益生菌?？膳囵B(yǎng)參考基因組數(shù)量的增加很大程度依賴(lài)于高通量的微生物培養(yǎng)，增加的數(shù)量越多使測(cè)序獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的速度越快，同時(shí)也提高了對(duì)人體腸道微生物基因組的分辨率，進(jìn)而能更加準(zhǔn)確剖析單個(gè)菌株的基因功能?？膳囵B(yǎng)基因組參考集的建立，極大的推動(dòng)了基因組學(xué)在腸道微生物中的應(yīng)用。

2.2與人體腸道細(xì)菌療法

相關(guān)菌群的培養(yǎng)結(jié)合宏基因組分析結(jié)果，目前發(fā)現(xiàn)的一些可能涉及到定植、急性或慢性感染的微生物被培養(yǎng)的比例很低。雖然測(cè)序能認(rèn)識(shí)到復(fù)雜的腸道微生態(tài)，卻不能明確微生物在宿主中發(fā)揮作用的機(jī)制，也無(wú)法拿到單菌株做驗(yàn)證試驗(yàn)。培養(yǎng)組學(xué)通過(guò)培養(yǎng)健康與患病個(gè)體腸道中的差異生物標(biāo)志物，獲得細(xì)菌活體樣本，進(jìn)而深入剖析細(xì)菌與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系機(jī)制。腸道微生物區(qū)系的一個(gè)主要功能是提供抗定殖能力，其中病原體細(xì)菌被抑制或控制在感染水平以下。糞菌移植（FMT）已被廣泛用于治療由于致病或條件致病微生物過(guò)多而引起的胃腸道疾病，如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等。這得益于腦腸軸的發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT還被證實(shí)可以有效緩解自閉癥[38]。而目前此方法仍存在很多問(wèn)題，糞便捐獻(xiàn)者在捐贈(zèng)糞便過(guò)程中可能將自身一些潛在致病菌傳染給被移植者，這是治療中很難避免的問(wèn)題。一些腸道細(xì)菌與結(jié)直腸癌或肥胖相關(guān)，據(jù)報(bào)道，F(xiàn)MT治療后患者體重指數(shù)無(wú)故增加了8.5個(gè)點(diǎn)。人們希望確切地知道在治療過(guò)程中具體有哪些細(xì)菌被轉(zhuǎn)移給了患者。通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)可以獲得健康人與患者腸道的關(guān)鍵差異細(xì)菌群，服用混合菌的方式有效避免了患者受捐贈(zèng)者帶來(lái)的潛在致病菌的影響。

結(jié)束語(yǔ)：

總的來(lái)說(shuō)，除了培養(yǎng)組學(xué)此前的貢獻(xiàn)外，培養(yǎng)組學(xué)以及其他微生物體外純化培養(yǎng)的方法都將促進(jìn)獸醫(yī)微生物研究領(lǐng)域的擴(kuò)展進(jìn)程，這些研究帶來(lái)的應(yīng)用價(jià)值十分深遠(yuǎn)。

參考文獻(xiàn)：

劉鋼，強(qiáng)直性脊柱炎腸道微生物菌群分析及干預(yù)研究.天津市，天津市天津醫(yī)院，2020-12-30.

彭娜，彭先啟，樂(lè)敏.微生物菌群培養(yǎng)組學(xué)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，51（12）：2942-2953.