腎康丸對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能、胰島素抵抗的影響

黃喬木,何 艷

1.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科,咸寧 437000;2.咸寧市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 咸寧 437000

研究表明,影響腎功能的因素主要有糖尿病、高血壓、家族遺傳等,其中對(duì)腎功能影響較大的是糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）[1-2]。早期糖尿病主要影響腎臟入球小動(dòng)脈及鄰近的血管,隨著病程進(jìn)展,血流動(dòng)力學(xué)特征逐漸轉(zhuǎn)化為高阻、低流速和低灌注[3]。足細(xì)胞是一種腎小囊臟層上皮細(xì)胞,該類(lèi)細(xì)胞是經(jīng)過(guò)高度分化的特異性細(xì)胞,可參與維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能、調(diào)節(jié)超濾系數(shù)和穩(wěn)定腎小球毛細(xì)血管等[4-5]。腎康丸是一種純中藥制劑,可用于治療慢性腎炎和慢性腎功能衰竭等,可以消除尿蛋白和潛血,同時(shí)能穩(wěn)定降低血肌酐和尿素氮等毒素物質(zhì)的水平,保護(hù)腎功能,延緩慢性腎功能衰竭的進(jìn)展[6]。本文旨在研究腎康丸對(duì)DN 大鼠腎功能、胰島素抵抗和足細(xì)胞的影響,以期了解腎康丸保護(hù)DN 大鼠的作用機(jī)制,從而為DN 的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（美國(guó)Sigma 公司）;透射電鏡（日本JEOL公司）;ONETOUCHⅡ血糖儀及血糖試紙均購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司。

1.2 試藥

腎康丸（批號(hào)為20181210,主要由黃芪、金櫻子、蟬蛻、益母草、水蛭和玉米須等制成,咸寧市中心醫(yī)院藥劑科;鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）、Trizol柱純化總RNA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;一抗及二抗、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD 大鼠30 只,6～8 周齡,體 質(zhì)量（200±30）g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2017-0022,分6個(gè)籠子飼養(yǎng),每個(gè)籠子5只。飼養(yǎng)于醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 建立DN 大鼠模型

參照文獻(xiàn)[7]構(gòu)建DN大鼠模型。給予高糖和高脂肪飼料喂養(yǎng)1個(gè)月,禁食12 h后腹腔注射25 mg·kg-1STZ。1周后,若STZ注射后連續(xù)3d血糖≥16.7 mmol·L-1,尿量＞原尿量150%,尿糖為（+++～++++）,即可判斷糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。繼續(xù)以高糖和高脂肪飼料喂養(yǎng)3個(gè)月,當(dāng)尿蛋白排泄量＞30 mg·d-1,則可認(rèn)為DN 模型建立成功。

2.2 分組及藥物干預(yù)

將30只大鼠分成3組,每組10只。第1組為正常大鼠;第2組為建模組,即DN 模型組;第3組為腎康丸治療組,按大鼠（200 g）與成人（70 kg）的體質(zhì)量比,計(jì)算大鼠的等效劑量。將腎康丸成藥經(jīng)研磨后用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為350 mg·mL-1的溶液,每日灌液1 mL,模型組灌注等量的生理鹽水。若有死亡的小鼠及時(shí)補(bǔ)上。

2.3 檢測(cè)項(xiàng)目

2.3.1 大鼠左腎質(zhì)量、血清肌酐、尿素氮和微量尿蛋白的檢測(cè) 處理結(jié)束后,稱定大鼠體質(zhì)量,并收集24 h尿液,檢測(cè)微量尿蛋白,腹主動(dòng)脈取血分離上清檢測(cè)血清肌酐和尿素氮含量,處死大鼠后迅速解剖腎臟組織,并稱取左腎質(zhì)量,計(jì)算左腎質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。

2.3.2 血清胰島素和血糖的測(cè)定及胰島素抵抗指數(shù)的計(jì)算 取大鼠腹主動(dòng)脈血,使用125I-胰島素放射免疫法檢測(cè)胰島素含量,使用ONETOUCHⅡ血糖儀檢測(cè)大鼠靜脈血糖。胰島素抵抗指數(shù)=（空腹血糖水平×空腹胰島素水平）/22.5。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每組做3次平行實(shí)驗(yàn),最后將結(jié)果取平均值。

2.3.3 大鼠血清總膽固醇和三酰甘油水平的檢測(cè)取大鼠血清,按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)血清總膽固醇（total cholesterol,TC）和三酰甘油（triglyceride,TG）的含量。

2.3.4 熒光定量PCR 檢測(cè)腎組織足細(xì)胞裂隙跨膜基因nephrin和肌間線蛋白m RNA 水平 取適量腎組織,用Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板鏈,再進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,以三磷酸-甘油醛脫氫酶為內(nèi)參,計(jì)算肌間線蛋白（desmin）和nephrin mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

2.3.5 蛋白印跡檢測(cè)腎組織desmin和nephrin蛋白的表達(dá)水平 取適量腎組織,添加蛋白裂解液提取總蛋白,檢測(cè)濃度后取50μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳,待蛋白完全分離后,電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜,將PVDF 膜置于脫脂牛奶中,室溫下孵育2 h,封閉非特異性位點(diǎn),再于4℃下分別孵育desmin、nephrin和β肌動(dòng)蛋白（β-actin）蛋白一抗過(guò)夜,清洗后在室溫下孵育蛋白二抗1 h,最后添加電化學(xué)發(fā)光法（electro-chemi-luminescence,ECL）發(fā)光試劑進(jìn)行蛋白顯影。以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算desmin和nephrin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.3.6 透射電鏡觀察足細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 將腎組織固定于戊二醇溶液中,制成石蠟切片,置于醋酸鈾染液中染色20 min,再置于檸檬酸鋁染液中染色15 min,用透射電鏡觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腎康丸對(duì)大鼠腎臟質(zhì)量和腎功能的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠左腎質(zhì)量/體質(zhì)量、血肌酐和尿素氮水平有顯著的提高（P＜0.05）;與DN 模型組相比,腎康丸治療組血肌酐和尿素氮水平顯著降低（P＜0.05）,但腎康丸治療組與DN 模型組左腎質(zhì)量/體質(zhì)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 腎康丸對(duì)大鼠腎臟質(zhì)量和腎功能的影響 （,n=10）Tab.1 Effects of Shenkang Pills on renal weight and function in rats（,n=10）

表1 腎康丸對(duì)大鼠腎臟質(zhì)量和腎功能的影響 （,n=10）Tab.1 Effects of Shenkang Pills on renal weight and function in rats（,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.2 腎康丸對(duì)大鼠血糖及胰島素的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠血糖和胰島素抵抗指數(shù)顯著升高,胰島素含量顯著降低（P＜0.05）;與DN模型組比較,腎康丸治療組大鼠的血糖和胰島素抵抗指數(shù)顯著降低,胰島素含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 腎康丸對(duì)大鼠血糖及胰島素的影響 （,n=10）Tab.2 Effects of Shenkang Pills on blood glucose and insulin in rats （,n=10）

表2 腎康丸對(duì)大鼠血糖及胰島素的影響 （,n=10）Tab.2 Effects of Shenkang Pills on blood glucose and insulin in rats （,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.3 腎康丸對(duì)大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠TG、TC 和微量尿蛋白水平顯著升高（P＜0.05）;與DN 模型組相比,腎康丸治療組大鼠TG、TC和微量尿蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 腎康丸對(duì)大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影響（,n=10）Tab.3 Effects of Shenkang Pills on levels of serum TG,TC and microalbuminuria in rats （,n=10）

表3 腎康丸對(duì)大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影響（,n=10）Tab.3 Effects of Shenkang Pills on levels of serum TG,TC and microalbuminuria in rats （,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.4 腎康丸對(duì)大鼠desmin、nephrin蛋白及m RNA表達(dá)水平的影響

與正常組相比,DN 模型組大鼠腎組織desmin蛋白及m RNA 的表達(dá)上調(diào),nephrin蛋白及mRNA的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）;與DN模型組相比,腎康丸治療組desmin蛋白及mRNA 的表達(dá)下調(diào),nephrin蛋白及mRNA的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表4。

圖1 蛋白印跡檢測(cè)desmin、nephrin蛋白的表達(dá)水平Fig.1 Expressions of desmin and nephrin proteins detected by Western blot

表4 腎康丸對(duì)大鼠desmin、nephrin蛋白及mRNA表達(dá)的影響 （,n=10）Tab.4 Effects of Shenkang Pills on desmin,protein and m RNA of nephrin in rats（,n=10）

表4 腎康丸對(duì)大鼠desmin、nephrin蛋白及mRNA表達(dá)的影響 （,n=10）Tab.4 Effects of Shenkang Pills on desmin,protein and m RNA of nephrin in rats（,n=10）

注:與正常組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.5 腎康丸對(duì)大鼠足細(xì)胞的影響

腎康丸對(duì)大鼠足細(xì)胞的影響見(jiàn)圖2。由圖2 可見(jiàn),正常組大鼠腎小球基底膜清晰,厚度均勻,足突清晰且排列整齊,無(wú)融合現(xiàn)象;DN 模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚,厚度不一,足突排列不整齊,且融合現(xiàn)象明顯,足突數(shù)量減少;與DN 模型組比較,腎康丸治療組上述腎小球基底膜增厚、足突排列不整齊和融合及數(shù)量減少等現(xiàn)象明顯減輕。

圖2 透射電鏡觀察大鼠足細(xì)胞Fig.2 Observation of rat podocytes by transmission electron microscope

4 討論

糖尿病患者由于血糖升高,糖基化的終末期產(chǎn)物明顯增多,自由基也明顯增多,使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激,造成腎臟損傷。同時(shí),這些自由基還可促進(jìn)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng),使糖尿病患者血清中的肌酐和尿素氮增多,血壓升高,進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮,形成惡性循環(huán),這也是導(dǎo)致糖尿病患者病情不斷加重的原因之一[8-9]。因此,抗氧化對(duì)于預(yù)防和延緩糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生有重要作用。據(jù)報(bào)道,用STZ 處理糖尿病大鼠可使其血糖濃度升高,血清中的胰島素含量下降,同時(shí)會(huì)引起血壓升高、體質(zhì)量減小、尿蛋白中肌酐和血肌酐含量均上升等癥狀[10]。本實(shí)驗(yàn)中腎康丸處理顯著降低了糖尿病腎病大鼠TG、TC、血肌酐和尿素氮含量,有效緩解了腎臟壓力,起到改善腎功能的作用。

足細(xì)胞存在多種細(xì)胞體、主突和足突,其功能和結(jié)構(gòu)也不相同,足細(xì)胞的足突之間由極薄的裂孔隔膜相連,這種相連的裂孔隔膜和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成腎小球選擇性的分子篩[11]。desmin于1977年被發(fā)現(xiàn),是成熟腎小管上皮細(xì)胞的主要標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白之一[12]。研究表明,正常情況下,desmin 在腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)量較低,在足細(xì)胞中無(wú)明顯表達(dá);足細(xì)胞受到損傷后,desmin可大量表達(dá),主要原因是足細(xì)胞的細(xì)胞骨架重新排列[13-14]。因此,desmin可作為評(píng)估足細(xì)胞是否受損的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)腎康丸處理的大鼠desmin蛋白及mRNA 的表達(dá)量顯著降低,表明腎康丸可明顯改善DN 大鼠足細(xì)胞損傷。nephrin是于腎小球裂孔膜上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)跨膜蛋白,其表達(dá)水平下降會(huì)使足細(xì)胞及裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生損傷[15-16]。于梅等[17]報(bào)道,對(duì)DN 患者進(jìn)行腎活檢發(fā)現(xiàn)nephrin m RNA 的表達(dá)水平下降,且其表達(dá)水平與蛋白尿程度呈負(fù)相關(guān)。大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞損傷后進(jìn)行藥物干預(yù)后,可通過(guò)增高腎組織氧化應(yīng)激和上調(diào)nephrin的表達(dá)水平而延緩腎小球足細(xì)胞損害,且干預(yù)后足細(xì)胞數(shù)量顯著增多[18-20]。本研究中,經(jīng)過(guò)腎康丸處理的大鼠nephrin蛋白及m RNA 的表達(dá)水平顯著上升,說(shuō)明腎康丸對(duì)腎組織中nephrin的表達(dá)有一定調(diào)節(jié)作用,能夠起到減輕足細(xì)胞損傷、發(fā)揮改善DN 的作用。

綜上所述,腎康丸可緩解DN 大鼠胰島素抵抗,改善腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),減輕足細(xì)胞的減少與融合,發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用。但因腎康丸是一種中藥制劑,其中的成分并不是單一的,且僅研究藥物劑量相對(duì)單一,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以提取腎康丸中的不同成分,進(jìn)一步探討各種成分對(duì)腎功能及足細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。