利用Seahorse XF-96探討不同細(xì)胞濃度和血清對(duì)線粒體功能的影響

李曉栩，崔 宇，陽(yáng)一棟，周曉英，矯 力，王辰元，楊誠(chéng)忠，史 詩(shī)，黃 緘 (.陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系/高原生理學(xué)與病理學(xué)教研室/極端環(huán)境醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/全軍高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038；.重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校生理教研室，重慶 4033)

線粒體是一種存在于真核細(xì)胞內(nèi)、具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行有氧氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所[1]，細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量的80%來(lái)自線粒體，因而線粒體也被喻為細(xì)胞的動(dòng)力工廠。線粒體的功能研究對(duì)于了解細(xì)胞的能量代謝尤為重要，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的氧消耗量和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)生成量可以反映線粒體的呼吸功能[2-4]。以往通常采用Clark電極來(lái)檢測(cè)線粒體的呼吸功能，但該方法需從完整的細(xì)胞中分離線粒體，無(wú)法保證線粒體的質(zhì)量和數(shù)量，且需要使用大量的電池、電極、染料、放射性物質(zhì)，并需要進(jìn)行細(xì)胞裂解，具有很大的局限性。

細(xì)胞外流量檢測(cè)儀Seahorse XF-96是一款通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外流量分析線粒體有氧代謝、細(xì)胞代謝和糖酵解等的新型儀器，可以精準(zhǔn)、實(shí)時(shí)測(cè)量活細(xì)胞和組織的能量代謝[5]。該儀器可利用光學(xué)傳感器和特殊的微孔板設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)和pH值的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)。細(xì)胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)和OCR可分別反映糖酵解和線粒體呼吸功能，從而快速評(píng)估細(xì)胞內(nèi)線粒體的有氧代謝和糖酵解的能量代謝狀態(tài)[6]。以往關(guān)于細(xì)胞濃度對(duì)線粒體功能影響的研究較少，研究者往往通過(guò)查閱文獻(xiàn)，選擇相應(yīng)的細(xì)胞濃度或藥物濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但在實(shí)際工作中，很多原代培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)可參考的細(xì)胞濃度，而是否進(jìn)行細(xì)胞濃度的優(yōu)化對(duì)研究至關(guān)重要；此外，在檢測(cè)線粒體功能時(shí)，為了保持細(xì)胞活性，往往會(huì)在培養(yǎng)基中加入少量血清，但是血清是否會(huì)影響線粒體功能目前尚不清楚。因此，本研究擬利用Seahorse XF-96探討不同細(xì)胞濃度和血清對(duì)線粒體功能的影響，以期為后續(xù)建立穩(wěn)定的細(xì)胞模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

20 μL、200 μL多道移液器(德國(guó)Eppendorf公司)，電動(dòng)吸液器(美國(guó)Axgen公司)，細(xì)胞外流量檢測(cè)儀Seahorse XF-96(美國(guó)Seahorse Bioscience公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)NUAIRE公司)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Becman公司)，純水儀(美國(guó)Millipore公司)，臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

U87細(xì)胞由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院國(guó)家癌癥研究所提供，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為高原生理學(xué)與病理學(xué)教研室保種，細(xì)胞線粒體應(yīng)激試劑盒、XF-96 V3聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)微孔板、XF校準(zhǔn)液、XF檢測(cè)液等購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技公司，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，丙酮酸鈉、葡萄糖購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，氫氧化鈉購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鹽酸購(gòu)自濟(jì)南大暉化工科技有限公司。

1.2 方法

檢測(cè)原理：在實(shí)驗(yàn)中使用96孔檢測(cè)板，檢測(cè)板分為上下兩部分，上部分帶有傳感器探針，探針上帶有粉紅色的熒光物質(zhì)，可附著氫離子和氧氣，探針中間是帶有光纖的鋼針，檢測(cè)板下面放置鋪有單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板。當(dāng)程序啟動(dòng)后，儀器會(huì)推動(dòng)探針形成一個(gè)暫時(shí)的密閉微環(huán)境，可在這個(gè)微環(huán)境中測(cè)量氧氣和pH值的變化；當(dāng)探針進(jìn)入培養(yǎng)基液面后，會(huì)在每個(gè)孔中形成2.28 μL的小室，從而實(shí)時(shí)檢測(cè)氧分壓和pH值的變化；當(dāng)探針離開(kāi)培養(yǎng)基液面，微環(huán)境又回到基線水平，可通過(guò)斜率計(jì)算OCR和ECAR。

細(xì)胞制備(實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，取1 mL細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，在XF-96 V3聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中加入80 μL細(xì)胞懸液，濃度為2×103～8×103/孔，預(yù)留背景校正孔(A1、A12、H1、H12角落的4個(gè)孔)不接種細(xì)胞，依據(jù)細(xì)胞濃度分為2 000組、4 000組、6 000組和8 000組。細(xì)胞接種完后，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜[6-7]。

測(cè)試板水化：在實(shí)驗(yàn)前1 d每孔加入200 μL XF校準(zhǔn)液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中水化過(guò)夜，以激活熒光探針。實(shí)驗(yàn)前調(diào)節(jié)XF檢測(cè)液pH值至7.4，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱。

細(xì)胞換液：移除細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔用200 μL XF檢測(cè)液清洗1次，去除XF檢測(cè)液后再加入175 μL新鮮檢測(cè)液，37 ℃孵育20 min。

藥物稀釋?zhuān)哼x擇細(xì)胞線粒體應(yīng)激試劑盒，試劑盒中有寡霉素、解偶聯(lián)劑、抗霉素A和魚(yú)藤酮4種藥物，藥物濃度參考文獻(xiàn)[8-10]，實(shí)驗(yàn)前每孔加入25 μL XF檢測(cè)液稀釋藥物[11]。檢測(cè)線粒體的基礎(chǔ)氧耗，然后在加藥孔A中加入寡霉素抑制有氧氧化的H+傳遞，測(cè)定OCR與基礎(chǔ)氧耗的差值，間接反映線粒體的ATP生成能力；在加藥孔B中加入解偶聯(lián)劑，測(cè)定線粒體最大呼吸能力和儲(chǔ)備的呼吸能力(最大呼吸能力與基礎(chǔ)氧耗的差值)；在加藥孔C中加入魚(yú)藤酮和抗霉素A抑制線粒體的氧化呼吸鏈，測(cè)定質(zhì)子漏(圖1)。加入寡霉素后的OCR與加入魚(yú)藤酮后的OCR差值即為非線粒體的氧耗，ATP生成能力與基礎(chǔ)氧耗的比值即為偶聯(lián)效率，最大呼吸能力與基礎(chǔ)氧耗的比值即為線粒體呼吸潛力。

圖1 線粒體OCR測(cè)定圖

血清實(shí)驗(yàn)：HUVEC細(xì)胞懸液制備同上，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，在XF-96 V3聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中加入80 μL細(xì)胞懸液，進(jìn)行測(cè)試板水化、細(xì)胞換液等，分別使用含0.25%胎牛血清和無(wú)血清的培養(yǎng)基進(jìn)行藥物稀釋?zhuān)俜謩e加入濃度為2 μmol/L和5 μmol/L的解偶聯(lián)劑，分為血清+低解偶聯(lián)劑組、血清+高解偶聯(lián)劑組、無(wú)血清+低解偶聯(lián)劑組和無(wú)血清+高解偶聯(lián)劑組。

儀器設(shè)置：打開(kāi)Seahorse XF-96和軟件，加載檢測(cè)模板或使用新的模板，設(shè)置循環(huán)數(shù)、檢測(cè)時(shí)間和藥物混合時(shí)間，修改保存路徑。

校正及檢測(cè)：點(diǎn)擊“Start”按鈕后，將測(cè)試版放入檢測(cè)儀中，儀器開(kāi)始進(jìn)行校正，10～15 min后儀器會(huì)自動(dòng)彈出測(cè)試板，放入細(xì)胞板后儀器會(huì)按照預(yù)先設(shè)定的程序進(jìn)行加藥、混合和檢測(cè)[8]。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察不同濃度U87細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞對(duì)線粒體OCR和ECAR的影響；比較不同濃度U87細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞對(duì)基礎(chǔ)氧耗、儲(chǔ)備的呼吸能力、最大呼吸能力、非線粒體的氧耗、質(zhì)子漏、ATP生成能力、偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力的影響以及兩種細(xì)胞上述指標(biāo)的差異；觀察血清對(duì)HUVEC細(xì)胞基礎(chǔ)氧耗、儲(chǔ)備的呼吸能力、最大呼吸能力、非線粒體的氧耗、質(zhì)子漏、ATP生成能力、偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞濃度對(duì)線粒體OCR和ECAR的影響

HUVEC細(xì)胞和U87細(xì)胞2 000組OCR顯著低于4 000組、6 000組和8 000組(P<0.01)；HUVEC細(xì)胞4 000組OCR與6 000組、6 000組與8 000組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，4 000組OCR顯著低于8 000組(P<0.01)；U87細(xì)胞4 000組OCR顯著低于6 000組和8 000組(P<0.01)，6 000組OCR與8 000組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。HUVEC細(xì)胞和U87細(xì)胞2 000組的ECAR顯著低于4 000組、6 000組和8 000組(P<0.01)，4 000組顯著低于6 000組和8 000組(P<0.01)；HUVEC細(xì)胞6 000組和8 000組ECAR比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；U87細(xì)胞6 000組ECAR顯著低于8 000組(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

a:HUVEC細(xì)胞；b:U87細(xì)胞

a:HUVEC細(xì)胞；b:U87細(xì)胞

2.2 細(xì)胞濃度對(duì)線粒體功能的影響

在HUVEC細(xì)胞中，與2 000組比較，6 000組和8 000組的基礎(chǔ)氧耗、儲(chǔ)備的呼吸能力、ATP生成能力和最大呼吸能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，2 000組與4 000組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與2 000組比較，8 000組非線粒體的氧耗和質(zhì)子漏顯著增強(qiáng)(P<0.05)，4 000組及6 000組與2 000組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；線粒體的偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。在U87細(xì)胞中，與2 000組比較，6 000組和8 000組的基礎(chǔ)氧耗、非線粒體的氧耗和最大呼吸能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，2 000組與4 000組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與2 000組比較，8 000組ATP生成能力、儲(chǔ)備的呼吸能力和質(zhì)子漏顯著增強(qiáng)(P<0.05)，4 000組及6 000組與2 000組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；線粒體的偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

*：與2 000組比較，P<0.05

*：與2 000組比較，P<0.05

2.3 不同濃度下兩種細(xì)胞線粒體功能的比較

HUVEC細(xì)胞和U87細(xì)胞2 000組、4 000組、6 000組的質(zhì)子漏比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，U87細(xì)胞8 000組的質(zhì)子漏顯著高于HUVEC細(xì)胞(P<0.05)；HUVEC細(xì)胞2 000組、6 000組和8 000組的偶聯(lián)效率顯著高于U87細(xì)胞(P<0.05)；HUVEC細(xì)胞6 000組的ATP生成能力和儲(chǔ)備的呼吸能力顯著高于U87細(xì)胞(P<0.05)；兩種細(xì)胞各組間基礎(chǔ)氧耗、最大呼吸能力、非線粒體的氧耗、線粒體呼吸潛力比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖6。

a：基礎(chǔ)氧耗；b：最大呼吸能力；c：質(zhì)子漏；d：非線粒體的氧耗；e：ATP生成能力；f：儲(chǔ)備的呼吸能力；g：偶聯(lián)效率；h：線粒體呼吸潛力1：HUVEC細(xì)胞；2：U87細(xì)胞；*：與HUVEC細(xì)胞比較，P<0.05圖6 不同細(xì)胞濃度下兩種細(xì)胞線粒體功能比較

2.4 血清對(duì)線粒體功能的影響

血清+低解偶聯(lián)劑組儲(chǔ)備的呼吸能力和線粒體呼吸潛力顯著高于無(wú)血清+低解偶聯(lián)劑組(P<0.05)，非線粒體的氧耗、基礎(chǔ)氧耗、最大呼吸能力、質(zhì)子漏、ATP生成能力、偶聯(lián)效率組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血清+高解偶聯(lián)劑組和無(wú)血清+高解偶聯(lián)劑組的線粒體功能各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

1：無(wú)血清+低解偶聯(lián)劑組；2：血清+低解偶聯(lián)劑組；3：無(wú)血清+高解偶聯(lián)劑組；4：血清+高解偶聯(lián)劑組 *：與無(wú)血清+低解偶聯(lián)劑組比較，P<0.05圖7 血清對(duì)HUVEC細(xì)胞線粒體功能的影響

3 討論

以往研究?jī)H單獨(dú)對(duì)U87細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的線粒體OCR和ECAR進(jìn)行分析，未對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行比較。HUVEC細(xì)胞濃度有10 000/孔[12]、15 000/孔[13]、30 000/孔[14]，U87細(xì)胞濃度有12 000/孔[15]或(20 000～30 000)/孔[16]，不同研究結(jié)果差異較大。本研究對(duì)U87細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行濃度優(yōu)化，結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞濃度的升高，線粒體的呼吸功能增強(qiáng)；當(dāng)細(xì)胞濃度為2 000/孔時(shí)，HUVEC細(xì)胞、U87細(xì)胞的線粒體OCR和ECAR之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而當(dāng)細(xì)胞濃度為4 000/孔時(shí)，兩種細(xì)胞的OCR和ECAR之間存在顯著差異。這可能是由于細(xì)胞濃度過(guò)低容易使本身存在差異的數(shù)據(jù)被掩蓋，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本研究的OCR和ECAR都不高，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，可以適當(dāng)提高細(xì)胞濃度，選擇8 000/孔或更高的細(xì)胞濃度，以期獲得更高的OCR和ECAR，更準(zhǔn)確地反映其對(duì)線粒體功能的影響。

細(xì)胞的線粒體OCR和ECAR分別反映了細(xì)胞的氧化磷酸化水平和糖酵解水平，不同細(xì)胞類(lèi)型之間OCR差異較大，其代表著粒線體處于基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)的耗氧效率。有文獻(xiàn)報(bào)道，U87細(xì)胞的ECAR較高，OCR相對(duì)較低，僅為20～80 pmol·min-1[15]；而HUVEC細(xì)胞的OCR一般在50～200 pmol·min-1[13,17]。本研究結(jié)果顯示，各組基礎(chǔ)氧耗無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且兩種細(xì)胞的OCR都低于文獻(xiàn)報(bào)道，這可能是由不同實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞濃度不同所致。U87細(xì)胞的OCR較低可能是由腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)導(dǎo)致，健康細(xì)胞依靠線粒體氧化糖類(lèi)分子釋放能量，而腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生能量的方式比較特別，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞是通過(guò)產(chǎn)能率相對(duì)較低的糖酵解作用為自身供能，不需要氧氣及線粒體參與。因此，有學(xué)者推測(cè)這種變化的代謝是癌癥發(fā)生的根本原因[15]，對(duì)有氧代謝和糖酵解的調(diào)控也一直是癌癥研究的重點(diǎn)。癌細(xì)胞一般具有高耗氧能力，但其在低氧環(huán)境中仍然能夠生存，如高級(jí)別膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其特征是具有高速增殖的能力，U87細(xì)胞就是一種增殖速度相對(duì)較快的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。較高的ECAR提示糖酵解的增加，U87細(xì)胞的主要能量代謝途徑是糖酵解，而內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體含量較低，也主要通過(guò)糖酵解氧化葡萄糖，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證[18]。

本研究比較了HUVEC細(xì)胞和U87細(xì)胞在不同濃度時(shí)線粒體功能的變化，結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞濃度為2 000/孔、4 000/孔和6 000/孔時(shí)，兩種細(xì)胞的質(zhì)子漏無(wú)顯著差異，而當(dāng)細(xì)胞濃度升高到8 000/孔時(shí)，U87細(xì)胞的質(zhì)子漏顯著高于HUVEC細(xì)胞。解偶聯(lián)劑可破壞三磷酸腺苷合酶的合成，將其加入到細(xì)胞的線粒體中可產(chǎn)生典型的質(zhì)子漏。在生理情況下，線粒體質(zhì)子漏的發(fā)生使得氧化磷酸化得到最優(yōu)的偶聯(lián)系數(shù)，從而使產(chǎn)熱和氧化磷酸化這兩個(gè)對(duì)機(jī)體十分重要的過(guò)程達(dá)到精確的平衡[19]。質(zhì)子漏的耗氧對(duì)細(xì)胞呼吸具有很強(qiáng)的控制作用，同時(shí)質(zhì)子漏也是重要的產(chǎn)熱過(guò)程，且能引起線粒體內(nèi)膜通透性改變的物質(zhì)都可以影響質(zhì)子漏。因此，HUVEC細(xì)胞和U87細(xì)胞質(zhì)子漏的差異不僅與其本身的基礎(chǔ)代謝有關(guān)，也反映了線粒體內(nèi)膜通透性的差異。在實(shí)驗(yàn)中，我們加入解偶聯(lián)劑用來(lái)測(cè)定細(xì)胞儲(chǔ)備的呼吸能力，其為評(píng)估線粒體儲(chǔ)備能力的一個(gè)極其穩(wěn)定的功能參數(shù)，可反映線粒體滿足超出基礎(chǔ)水平的額外能量需求的能力，以應(yīng)對(duì)急性細(xì)胞應(yīng)激或沉重的工作負(fù)荷，靈敏度高[20]。本研究結(jié)果顯示，U87細(xì)胞6 000組儲(chǔ)備的呼吸能力顯著低于HUVEC細(xì)胞，說(shuō)明在應(yīng)激情況下，U87細(xì)胞額外能量需求的能力不如HUVEC細(xì)胞，這可能是由于糖酵解并不是腫瘤細(xì)胞所特有的代謝表型，想要探尋這種差異的原因還需要更深入的研究。

在以往的實(shí)驗(yàn)中，為了防止細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，往往會(huì)添加低濃度的血清為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，保持細(xì)胞活性，但血清的添加是否會(huì)對(duì)線粒體功能造成影響目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在配制的藥物中加入低濃度(0.25%)的血清，觀察其是否會(huì)影響線粒體的呼吸功能，結(jié)果顯示，血清僅對(duì)線粒體儲(chǔ)備的呼吸能力和線粒體呼吸潛力產(chǎn)生影響，其余的線粒體功能指標(biāo)未受影響，提示在測(cè)定線粒體呼吸功能時(shí)，血清對(duì)HUVEC細(xì)胞線粒體功能的影響較小，但在其他細(xì)胞中是否也有相似的結(jié)果還需進(jìn)一步研究。此外，本研究中血清組和無(wú)血清組的線粒體功能在解偶聯(lián)劑為5 μmol/L時(shí)均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明當(dāng)達(dá)到一定濃度后，持續(xù)增加解偶聯(lián)劑的濃度不會(huì)增強(qiáng)線粒體的呼吸功能。

在熒光技術(shù)之前，線粒體呼吸功能測(cè)定主要利用Clark電極[21-23]，這種氧分壓測(cè)量的方法最為經(jīng)典。但Clark電極主要適用于非黏附的細(xì)胞，如循環(huán)造血細(xì)胞或一些懸浮的腫瘤細(xì)胞等，其分析成本較低，但存在以下缺點(diǎn)：所需的樣本量較大，在測(cè)定原代培養(yǎng)物、臨床樣品或干細(xì)胞時(shí)具有較大的限制；通量較低，一般只能檢測(cè)1～2個(gè)樣本；需要分離線粒體，不能直接進(jìn)行檢測(cè)，且樣本檢測(cè)后不能用于其他實(shí)驗(yàn)。而通過(guò)Seahorse XF-96，研究者能更快、更簡(jiǎn)易地了解細(xì)胞以及線粒體如何運(yùn)用不同的物質(zhì)作為能量來(lái)源，評(píng)估疾病與氧代謝和線粒體狀態(tài)之間的相互作用，分析代謝調(diào)節(jié)藥物的生理效應(yīng)，快速篩選出具有開(kāi)發(fā)潛力的藥物及進(jìn)行藥物毒性評(píng)估等。目前，Seahorse XF-96已被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、藥物轉(zhuǎn)化、病理毒理、細(xì)胞生理、細(xì)胞代謝等熱門(mén)研究領(lǐng)域，是進(jìn)行細(xì)胞活力評(píng)價(jià)、藥物藥效評(píng)估、線粒體功能和代謝疾病分析等的有效手段[5]。

本研究總結(jié)實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)如下：①為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，建議每組設(shè)置3～4個(gè)復(fù)孔；以第1列和第12列作為空白和對(duì)照，防止邊緣效應(yīng)。②根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，細(xì)胞培養(yǎng)板需要在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前提前準(zhǔn)備，細(xì)胞需加入細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過(guò)夜，如需額外加入藥物，需提前種植細(xì)胞。③檢測(cè)板上部帶有傳感器探針，熒光探針若失效會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)在有效期內(nèi)使用，使用后可置于-20 ℃保存6個(gè)月。為了建立穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)方法，得到真實(shí)、可靠、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在進(jìn)行線粒體功能測(cè)定之前一定要查閱文獻(xiàn)，若文獻(xiàn)中沒(méi)有所研究的細(xì)胞系，需要在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，選擇合適的細(xì)胞濃度及解偶聯(lián)劑、寡霉素、魚(yú)藤酮和抗霉素A濃度，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，細(xì)胞濃度會(huì)影響線粒體OCR和ECAR，HUVEC細(xì)胞和U87細(xì)胞的質(zhì)子漏和偶聯(lián)效率存在顯著差異，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，HUVEC細(xì)胞和U87細(xì)胞可選擇8 000/孔或更高的細(xì)胞濃度，解偶聯(lián)劑濃度使用2 μmol/L，在使用血清進(jìn)行藥物稀釋時(shí)，充分考慮血清對(duì)線粒體功能的影響，以建立穩(wěn)定的檢測(cè)線粒體功能的方法。本研究對(duì)于藥物濃度的摸索、實(shí)驗(yàn)條件的進(jìn)一步優(yōu)化沒(méi)有過(guò)多涉及，有待在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。