金盞菊原生質(zhì)體對土壤鉛/鎘響應(yīng)機制的FTIR, 2D-IR和XPS證據(jù)

范春輝, 鄭金煥, 劉宏鑫

1. 沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 遼寧 沈陽 110034

2. Department of Soil and Crop Sciences, Colorado State University, Fort Collins, CO, 80523-1170, USA

3. 陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021

引 言

土壤污染是環(huán)境領(lǐng)域的“三大戰(zhàn)役”之一， 已發(fā)展成全球普遍存在的生態(tài)環(huán)境問題。 土壤污染能夠擾亂生態(tài)系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)， 嚴重威脅人類生存和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[1]。 作為一個處于快速工業(yè)化進程中的發(fā)展中國家， 我國的土壤污染總體形勢相當嚴峻。 2016年， 《中華人民共和國土壤污染防治行動計劃》(簡稱“土十條”)正式印發(fā)實施， 這為我國土壤污染防治工作提供了技術(shù)標準和行動綱領(lǐng)。 隨著國家“十四五”規(guī)劃的實施和“二○三五”遠景目標建議的提出， 土壤污染修復(fù)將迎來新的歷史機遇和挑戰(zhàn)。

植物修復(fù)法(phytoremediation)通過植物自身吸收、 揮發(fā)、 根濾、 降解、 穩(wěn)定化等行為完成土壤污染物的去除凈化， 是現(xiàn)階段及未來土壤修復(fù)主流技術(shù)之一[2]。 自1983年Chaney提出植物修復(fù)技術(shù)至今， 國內(nèi)外學(xué)者對其進行了大量探索性研究， 奠定了植物修復(fù)技術(shù)理論體系的堅實基礎(chǔ)。 金盞菊是最常見的城市草本花卉之一， 兼具藥用、 食用和裝飾等多維價值。 近年研究初步表明： 金盞菊對土壤重金屬也有一定去除效果， 可能會成為土壤修復(fù)的潛在植物源[3]。 目前， 相關(guān)研究尚處于前期探索階段， 無法系統(tǒng)提供有說服力的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考證據(jù)， 對于金盞菊吸收土壤重金屬的譜學(xué)機制研究亟待加強。

前期筆者建立并優(yōu)化了金盞菊體內(nèi)Pb/Cd的檢測方法， 明確了金盞菊細胞壁與Pb/Cd的體外接觸特性[4]。 原生質(zhì)體是植物細胞的功能性組分， 其對土壤Pb/Cd的體內(nèi)響應(yīng)和結(jié)合貢獻同等重要。 通過Pb/Cd脅迫土壤盆栽體系獲取金盞菊植株樣本， 引入差速冷凍離心法提取金盞菊原生質(zhì)體， 借助XRD， FTIR， 2D-IR和XPS剖析Pb/Cd與金盞菊原生質(zhì)體結(jié)合的反饋信號， 力圖從光譜學(xué)層面為后續(xù)相關(guān)研究提供理論支持。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

偏振塞曼原子吸收光譜儀(Z-2000, Hitachi)， X射線衍射儀(D/max2200PC, Rigaku)， 傅里葉變換紅外光譜儀(VECTOR-22, Bruker)， X射線光電子能譜儀(ESCALAB 250 Xi, Thermo Scientific)。 實驗用水為桶裝純凈水， KBr為光譜純， 其余化學(xué)試劑為優(yōu)級純。

1.2 盆栽實驗

向土壤中均勻噴灑250 mL Pb/Cd混合溶液， 充分攪拌使土壤潤濕并混合均勻， 即得Pb/Cd復(fù)合污染土壤。 土壤染毒過程包含A(CK)， B， C和D四個處理， Pb/Cd濃度分別為0/0， 200/10， 400/20和600/30 mg·kg-1。 盆栽周期為2016年4月6日至5月20日； 盆栽容器為圓形塑料盆(盆底直徑12 cm， 盆頂直徑16 cm， 盆高14 cm)， 每盆裝有染毒土壤(1.0±0.01) kg； 依次向其中施加尿素(0.4 g·盆-1)、 磷酸二氫鈉(0.2 g·盆-1)和氯化鉀(0.3 g·盆-1)三種底肥， 每盆播入20粒金盞菊種子， 維持土壤含水量為田間持水量的70%， 于室外天然光照下培養(yǎng)， 之后收獲金盞菊植株用于后續(xù)使用。

1.3 樣品處理

采用差速冷凍離心法分離金盞菊細胞組分， 所有操作均在4 ℃低溫下進行。 稱取(1.0±0.01) g金盞菊鮮樣于預(yù)冷研缽中， 加入經(jīng)4 ℃預(yù)冷的10 mL提取劑 [0.25 mol·L-1蔗糖， 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)] 研磨。 將處理后的勻漿分兩次倒入6 mL離心管中離心(10 000 r·min-1， 10 min)， 下層沉淀即為細胞壁及其破碎殘渣組分， 其余產(chǎn)品為金盞菊原生質(zhì)體。 另取一份金盞菊樣品裝入消煮管中， 向其中依次加入20 mL HNO3和4 mL HClO4， 常溫靜置12 h后消解樣品， 直至白煙基本散盡。 將冷卻后的消解液轉(zhuǎn)移至容量瓶， 定容后搖勻檢測Pb/Cd賦存形態(tài)。 上述所有實驗重復(fù)三次。

1.4 分析方法

采用Tessier連續(xù)提取-AAS法識別實驗樣品Pb/Cd賦存形態(tài)， 其中AAS為空氣-乙炔火焰， 乙炔氣體壓力160 kPa， Pb/Cd測定波長分別為283.3和228.8 nm。 XRD分析為CuKα輻射源， 掃描角度10°～70°， 步寬0.02°。 FTIR檢測采用KBr壓片法， KBr與樣品質(zhì)量比200∶1， 掃描范圍4 000～400 cm-1。 XPS使用帶單色器的鎂靶(MgKα， 光子能量1 253.6 eV)， 分析室真空度5×10-9Pa， 測試所得的XPS峰以C(1s)(284.8 eV)為基準校正。 利用2D-Shige軟件繪制2D-IR譜圖， Origin軟件處理其他數(shù)據(jù)并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pb/Cd賦存形態(tài)

不同脅迫強度下金盞菊原生質(zhì)體Pb/Cd賦存形態(tài)分布見表1。 原生質(zhì)體可交換態(tài)Pb/Cd所占比重一直不高， 比如在Pb/Cd脅迫強度為600/30 mg·kg-1時(處理D)， 可交換態(tài)Pb/Cd分別占其全量的13.54%/29.59%。 隨著Pb/Cd濃度的增大， 原生質(zhì)體有機結(jié)合態(tài)Pb比重迅速升高， 而各形態(tài)Cd含量變化均不明顯， 這可能與原生質(zhì)體內(nèi)轉(zhuǎn)運體蛋白、 有機酸等組分對Pb/Cd的存貯和解毒機制有關(guān)。 此外， Dai[5]之前證實細胞壁對Cd的優(yōu)先截留效應(yīng)， 可能也在一定程度上調(diào)控了Cd/原生質(zhì)體的結(jié)合。

表1 不同脅迫強度下金盞菊原生質(zhì)體Pb/Cd賦存形態(tài)

2.2 XRD

不同脅迫強度對原生質(zhì)體XRD圖譜的影響如圖1所示。 總體上看， 圖1(a)中四組圖譜差異不大， 具有某些共性特征。 其中， 最強信號均出現(xiàn)在31.7°左右， 代表原生質(zhì)體系NaCl晶體特征峰[6]； 26.7°和45.5°附近發(fā)現(xiàn)若干次峰， 分別鑒定為Pb鹽 [Pb5(PO4)3Cl]和Cd鹽晶體(CdS)特征峰[7]。 通常認為， 植物體內(nèi)的鹽分(NaCl等)具有維持自身生理代謝、 調(diào)控體系水勢和滲透勢平衡的作用； 植物可能通過攝取較多鹽基離子存于體內(nèi)， 以便緩解重金屬毒害和脅迫效應(yīng)[8]； 而進入原生質(zhì)體的重金屬則常以螯合固定、 胞內(nèi)沉淀等方式降低活性和毒性。 將XRD圖譜局部放大[見圖1(b)]， 發(fā)現(xiàn)脅迫后譜中29.4°衍射峰幾近消失； 這個特征峰代表了含Mg組分的存在， 推測金盞菊在吸收Pb/Cd的同時， 可能發(fā)生了離子交換或元素外排等生理響應(yīng)。

圖1 不同脅迫強度下金盞菊原生質(zhì)體X-衍射光譜

2.3 FTIR

圖2 不同脅迫強度下金盞菊原生質(zhì)體紅外光譜

2.4 2D-IR

圖3 不同脅迫強度下金盞菊原生質(zhì)體二維相關(guān)紅外光譜

2.5 XPS

不同脅迫強度對金盞菊原生質(zhì)體XPS圖譜的影響見圖4。 對于A(CK)處理樣品， XPS全譜的主要光電子峰分別代表C(1s)和O(1s)， 結(jié)合能分別為284.77和532.41 eV。 結(jié)合相關(guān)文獻[13]， 認定C(1s)和O(1s)對應(yīng)的官能團分別為C—OH和—COOH。 C(1s)和O(1s)都僅出現(xiàn)1個峰， 說明C原子和O原子基本處于同一化學(xué)環(huán)境。 脅迫反應(yīng)后， 圖譜光電子峰分別為C(1s)， O(1s)， Pb(4f)和Cd(3d)能級的四種元素。 為了深入揭示各元素結(jié)合能的變化， 對XPS分譜進行繪制。

圖4 不同脅迫強度下金盞菊原生質(zhì)體X射線光電子能譜

在不同脅迫強度下， C(1s)結(jié)合能分別為284.79 eV(處理B)、 284.79 eV(處理C)和284.78 eV(處理D)。 Pb/Cd脅迫導(dǎo)致C(1s)結(jié)合能略有增加， 說明脅迫前后原生質(zhì)體C原子的化學(xué)環(huán)境變化很小， C原子一定程度上參與了配位反應(yīng)[14]。 O(1s)結(jié)合能分別為532.36 eV(處理B)、 532.70 eV(處理C)和532.68 eV(處理D)， 峰位發(fā)生不同程度偏轉(zhuǎn)。 對于處理B， O(1s)峰降低了0.05 eV， 源于O原子在反應(yīng)過程獲得電子， 使自身結(jié)合能降低， 這說明酚羥基、 羧基、 內(nèi)酯基等含O基團參與了反應(yīng)過程。 對于處理C和處理D， O(1s)的光電子峰分別向高場偏移了0.29和0.27 eV； 邊界軌道理論和Pearon軟硬酸堿理論認為： 光電子峰由低結(jié)合能向高結(jié)合能移動， 表明系統(tǒng)勢能增大， 系統(tǒng)間發(fā)生了軟-軟作用和電子軌道交疊過程[15]。 據(jù)此可知， 本研究中含O官能團對Pb/Cd的結(jié)合過程可能涉及多種作用途徑。

脅迫反應(yīng)導(dǎo)致XPS圖譜出現(xiàn)Pb(4f)和Cd(3d)光電子峰。 其中Pb(4f)峰定位于133.58 eV(處理B)、 137.78 eV(處理C)和141.38 eV(處理D)附近， 這是π電子-Pb離子相互作用的結(jié)果[16]。 Cd(3d)峰分布于402.58 eV(處理B)、 410.68 eV(處理C)和417.68 eV(處理D)附近； 隨著脅迫濃度的增加， Cd(3d)結(jié)合能逐漸增加， 暗示了反應(yīng)過程中Cd離子具有明顯失電子傾向， 是失電子一方。 圖譜中Pb(4f)和Cd(3d)光電子峰識別效果不明顯， 可能源于響應(yīng)信號較弱； 經(jīng)調(diào)整測試條件重復(fù)實驗后， 基本排除了元素分布不均的情況， 但圖譜改進效果仍然很小。 據(jù)此認為， 導(dǎo)致信號較差的原因在于原生質(zhì)體Pb/Cd含量較低。

3 結(jié) 論