超聲波輔助法提取野菊花中總黃酮的研究

豆佳媛，田巍，唐琴，逯莉，周艷紅

（陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 西安 712046）

1 前言

野菊花為菊科野菊（Chrysanthemum indicum L.）干燥的頭狀花序，可以入藥和泡茶飲用[1]。具有散風(fēng)熱、抗消炎和消腫解毒等藥效，主治風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛等[2]，對(duì)治療心血管、腫瘤、抗病毒等也有良好的作用[3]。野菊花自然資源豐富且在我國(guó)大量分布，其藥用價(jià)值早為民間廣泛流傳，具有良好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值。野菊花主要含有黃酮類、揮發(fā)油和萜類、多糖類化學(xué)成分，其中對(duì)于黃酮類化合物越來(lái)越多學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究[4]。目前，我國(guó)對(duì)黃酮類化合物的開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為熱點(diǎn)，但野菊花中的黃酮含量提取方法單一，結(jié)果不太理想。近年來(lái)，超聲波輔助法提取效果較好，且適宜藥品的大量生產(chǎn)從而被廣泛運(yùn)用[5]。本文通過(guò)閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)出超聲波輔助法提取野菊花藥材中總黃酮的提取工藝，并以黃酮含量為研究指標(biāo)，利用響應(yīng)面分析進(jìn)一步優(yōu)化其提取工藝，為中藥野菊花的資源開(kāi)發(fā)和利用提供可靠的理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 材料及試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京恒元啟天化工技術(shù)研究所；野菊花，北京同仁堂咸陽(yáng)店；乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；九水硝酸鋁，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；所用到的水均為超純水。

2.1.2 儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī)，JZL，四川巨子超微科技有限公司；紫外分光光度儀，UV-6000PC，上海元析儀器有限公司；超聲波清洗器，KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，SK-3005A，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；電子天平，AG135，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；超純水器，YS-10A型，上海摩科科技集團(tuán)；移液槍，SW2-45，上海元析儀器有限公司；旋蒸儀，JSE-679，上海摩科科技集團(tuán)；真空泵，GF-987，上海摩科科技集團(tuán)；離心機(jī)，TD5A-WS，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；震蕩儀，SHZ-82，江蘇丹陽(yáng)門科教儀器廠。

2.2 試驗(yàn)步驟

2.2.1 野菊花提取總黃酮的工藝流程

野菊花→篩選→烘干→粉碎→稱量→超聲提取→真空濃縮→離心→得黃酮粗提液

2.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液的配制

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，在60℃下干燥至恒重，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中并用30%乙醇溶液定容，震蕩混勻即配制成為1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液槍分別移取2.2.2項(xiàng)下配置好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液0到10 mL于25 mL已經(jīng)加入2.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液的棕色容量瓶中，利用震蕩儀器充分震蕩搖勻，再分別加入2.5 mL 10%的Al（NO3）3·9H2O水溶液，利用震蕩儀器充分震蕩搖勻，最后分別加入10 mL 4%的NaOH溶液，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液定容，充分混合，靜置，備用。

將加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液0 ml的溶液放至比色杯中作為參比溶液，利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度并建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 野菊花中總黃酮量的計(jì)算

利用萬(wàn)分之一天平精密稱取2.00 g野菊花藥材粉末，按2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行野菊花藥材中總黃酮的提取，用5 mL移液管精確吸取4 mL粗提液，采用2.2.3項(xiàng)下方法顯色測(cè)定野菊花中總黃酮粗提溶液的吸光度，根據(jù)下式計(jì)算野菊花藥材中總黃酮的含量：

式中：A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的供試品溶液的濃度（mg·mL-1），F(xiàn)1為提取時(shí)定容體積(mL)，F(xiàn)2為顯色反應(yīng)時(shí)定容體積(mL)，M為野菊花藥材質(zhì)量(g)，F(xiàn)3為顯色反應(yīng)時(shí)取樣體積(mL)。

2.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)提取液濃度對(duì)野菊花總黃酮得率影響

用取樣匙取野菊花藥材粉末，用萬(wàn)分之一天平精密稱定，2 g/份，共18份，置于錐形瓶中，隨機(jī)分為6組，每組三個(gè)平行，分別加入20%～100%濃度的乙醇溶液，各組按提取溶劑與野菊花藥材液料比50∶1（mL/g）混和后，用超聲儀超聲提取45 min，設(shè)置提取功率為480 W，提取溫度為25℃，再按2.2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品含量測(cè)定，選出生產(chǎn)工藝中最適宜的乙醇濃度。

(2)超聲提取時(shí)間對(duì)野菊花總黃酮得率影響

用取樣匙取野菊花藥材粉末，用萬(wàn)分之一天平精密稱定，2 g/份，共18份，置于錐形瓶中，隨機(jī)分為6組，每組三個(gè)平行，加入60%的乙醇溶液，再按照提取溶劑與野菊花藥材液料比50∶1（mL/g）混和后，在超聲儀上分別設(shè)置提取時(shí)間為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，提取功率為480 W，提取溫度為25℃，再按2.2.4樣品含量測(cè)定方法操作，計(jì)算不同提取時(shí)間下野菊花總黃酮提取的含量，分析提取時(shí)間對(duì)野菊花藥材總黃酮的提取效果，選出生產(chǎn)工藝中最適宜的提取時(shí)間。

(3)液料比對(duì)野菊花總黃酮得率影響

用取樣匙取野菊花藥材粉末，用萬(wàn)分之一天平精密稱定，2 g/份，共18份，置于錐形瓶中，隨機(jī)分為6組，每組三個(gè)平行，再分別按提取溶劑與野菊花藥材粉末的液料比10∶1(v∶v)、20∶1(v∶v)、30∶1(v∶v)、40∶1(v∶v)、50∶1(v∶v)、60∶1(v∶v)混和后，加入濃度為60%的乙醇，用超聲儀超聲提取45 min，提取功率設(shè)置為480 W，提取溫度設(shè)置為25℃，再按2.2.4樣品含量測(cè)定方法操作，計(jì)算不同料液比下野菊花總黃酮提取的含量，分析料液比對(duì)野菊花藥材總黃酮的提取效果，選出生產(chǎn)工藝中最適宜的液料比。

(4)提取功率對(duì)野菊花總黃酮得率影響

用取樣匙取野菊花藥材粉末，用萬(wàn)分之一天平精密稱定，2 g/份，共18份，置于錐形瓶中，隨機(jī)分為6組，每組三個(gè)平行，加入60%的乙醇溶液，再按照提取溶劑與野菊花藥材液料比50∶1（mL/g）混和后，在超聲儀上分別設(shè)置提取功率為80 W、180 W、280 W、380 W、480 W、580 W，提取時(shí)間45 min，提取溫度25℃，再按2.2.4樣品含量測(cè)定方法操作，計(jì)算不同提取功率下野菊花總黃酮提取的含量，分析提取功率對(duì)野菊花藥材總黃酮的提取效果，選出生產(chǎn)工藝中最適宜的提取功率。

(5)提取溫度對(duì)野菊花總黃酮得率影響

用取樣匙取野菊花藥材粉末，用萬(wàn)分之一天平精密稱定，2 g/份，共18份，置于錐形瓶中，隨機(jī)分為6組，每組三個(gè)平行，加入60%的乙醇溶液，再按照提取溶劑與野菊花藥材液料比50∶1（mL/g）混合后，在超聲儀上分別設(shè)置提取溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，提取時(shí)間為45 min，提取功率為480 W，再按2.2.4樣品含量測(cè)定方法操作，計(jì)算不同提取溫度下野菊花總黃酮提取的含量，分析提取溫度對(duì)野菊花藥材總黃酮的提取效果，選出最適提取溫度。

2.2.6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)2.2.5項(xiàng)下的試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以野菊花藥材中的總黃酮含量為響應(yīng)值，乙醇溶液濃度、液料比、時(shí)間、溫度以及功率這五項(xiàng)因素為響應(yīng)變量進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化超聲波輔助法提取野菊花藥材中總黃酮工藝的參數(shù)。

2.2.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先采用Excle2013進(jìn)行預(yù)處理，再用Design Expert 8.06進(jìn)行相關(guān)分析。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

下圖的橫坐標(biāo)為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度C(mg·mL-1)，縱坐標(biāo)為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各質(zhì)量濃度下的吸光度A，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.467x+0.0181，其R2=0.9991。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.2 單因素分析結(jié)果

(1)野菊花提取液中總黃酮含量對(duì)乙醇濃度的響應(yīng)

如圖2所示，當(dāng)乙醇溶液濃度從20%增加到40%時(shí)，野菊花藥材提取液中總黃酮的含量與乙醇溶液濃度呈顯著正相關(guān)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，野菊花藥材提取液中總黃酮的樣品含量達(dá)最大值為44.31 mg/g；但隨著乙醇濃度的繼續(xù)上升，野菊花藥材總黃酮的含量逐漸呈下降趨勢(shì)，這可能與提取液濃度太高，部分極性略小的黃酮無(wú)法提取出有關(guān)。因此提取野菊花中總黃酮時(shí)選擇最佳乙醇提取液濃度為40%。

圖2 野菊花總黃酮含量對(duì)乙醇濃度的響應(yīng)

(2)野菊花提取液中總黃酮含量對(duì)液料比的響應(yīng)

如圖3所示，當(dāng)提取溶劑與原藥材的液料比從10∶1（mL/g）到60∶1（mL/g）時(shí)，野菊花藥材總黃酮的含量逐漸升高，這可能是乙醇提取液濃度越高，溶劑中相應(yīng)的野菊花總黃酮含量濃度越低，超聲頻率推動(dòng)力越大，使提取速率增加，使野菊花藥材總黃酮提取率增大，在提取溶劑與原藥材的液料比為50∶1（mL/g）時(shí)提取溶液中總黃酮含量42.69 mg/g，達(dá)到最高；當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，野菊花藥材總黃酮的含量逐漸呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能是野菊花藥材中其他物質(zhì)的溶出率增加，影響了樣品中總黃酮的溶出率。因此提取野菊花中總黃酮時(shí)選擇最佳液料比為50∶1（mL/g）。

圖3 野菊花總黃酮含量對(duì)提取液料比的響應(yīng)

(3)野菊花提取液中總黃酮含量對(duì)時(shí)間的響應(yīng)

如圖4所示，超聲儀超聲提取時(shí)間從15 min到60 min時(shí)，野菊花提取液中總黃酮含量與提取時(shí)間呈正相關(guān)，在提取時(shí)間為60 min時(shí)樣品中總黃酮的含量達(dá)最高點(diǎn)41.62 mg/g；隨提取時(shí)間的繼續(xù)推移，野菊花藥材總黃酮含量反而下降，這可能與提取時(shí)間太長(zhǎng)，部分黃酮結(jié)構(gòu)與空氣中某些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致部分結(jié)構(gòu)破壞或者降解。

圖4 野菊花總黃酮含量對(duì)時(shí)間的響應(yīng)

(4)野菊花提取液中總黃酮含量對(duì)溫度的響應(yīng)

由圖5可知，超聲溫度從20℃加熱上升到35℃時(shí)，野菊花提取液中總黃酮含量與提取溫度呈正相關(guān)，當(dāng)提取溫度達(dá)到35℃時(shí)樣品中總黃酮的含量能達(dá)到最高點(diǎn)，為43.71 mg/g，因此提取野菊花中總黃酮時(shí)選擇最佳提取溫度為35℃。

圖5 野菊花總黃酮含量對(duì)溫度的響應(yīng)

(5)野菊花提取液中總黃酮含量對(duì)超聲提取功率的響應(yīng)

由圖6可知，隨著超聲提取功率的上升，野菊花藥材中總黃酮的含量呈先逐漸上升后下降的趨勢(shì)，在提取功率為480 W時(shí)總黃酮的含量達(dá)到最高，為46.54 mg/g?？赡苁屈S酮在野菊花藥材中與其他成分已達(dá)成某種平衡狀態(tài)，當(dāng)超聲功率增強(qiáng)時(shí)，藥材中總黃酮快速溶出，使得提取率加大，當(dāng)超聲波功率大于580 W時(shí)大部分存在于待測(cè)樣品的微小含量成分與其他雜質(zhì)隨著超聲頻率的增強(qiáng)一起析出，使得某種平衡被打破，樣品中黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致野菊花藥材中總黃酮提取量下降。因此提取野菊花中總黃酮時(shí)選擇最佳提取功率為480 W。

圖6 野菊花總黃酮含量對(duì)超聲功率的響應(yīng)

2.3.3 野菊花總黃酮提取工藝優(yōu)化

在前期2.3.2項(xiàng)下單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)分析軟件Design-Expert 8.0.6中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，分別以提取溶液的濃度、提取溶液與原藥材的液料比、所用時(shí)間、溫度以及所用功率為響應(yīng)變量，野菊花藥材提取液中總黃酮含量為響應(yīng)值，進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化超聲波輔助法提取野菊花藥材中總黃酮工藝的參數(shù)，設(shè)計(jì)因素水平表見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表1 野菊花總黃酮提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

續(xù)表2

由圖7a可知，料液比的坡面相比于提取濃度的坡面更為陡峭，變化幅度更大，可以看出，料液比對(duì)提取率的影響更大；由圖7b可知，提取濃度和提取時(shí)間坡面非常接近，二者對(duì)提取率的影響相差不大；由圖7c可知，提取溫度的坡面相比于提取濃度的坡面略微陡峭，提取溫度對(duì)提取率的影響略大一些；由圖7d可知，提取功率的坡面相比于提取濃度的坡面更為陡峭，變化幅度更大，可以看出，提取功率對(duì)提取率的影響更大；由圖7e可知，料液比的坡面相比于提取時(shí)間的坡面更為陡峭，變化幅度更大，可以看出，料液比對(duì)提取率的影響更大；由圖7f可知，溫度和料液比的響應(yīng)面曲線斜率相近，二者影響相差不大，但可看出料液比比溫度影響相對(duì)顯著一些；由圖7g可知，從3D響應(yīng)面曲線的峰值及坡度可以看出，提取功率與料液比的影響程度相差不大，但功率對(duì)黃酮提取率的影響比料液比相對(duì)更顯著一些；由圖7h可知，提取溫度與提取時(shí)間的影響程度相差不大，但溫度對(duì)黃酮提取率的影響相對(duì)更顯著一些；由圖7i可知，提取功率與提取時(shí)間之間的相互作用不太明顯，輪廓線更集中在提取功率一側(cè)，而功率方向響應(yīng)面曲線在3D響應(yīng)中的斜率略大于提取時(shí)間方向，因此，超聲功率對(duì)提取率的影響略大于提取時(shí)間；由圖7j可知，提取功率和提取溫度坡面非常接近，二者對(duì)提取率的影響相差不大。結(jié)合表3和圖7，可以看出，野菊花總黃酮提取率的影響因素大小依次為：提取功率>液料比>提取溫度>提取時(shí)間>提取濃度。

圖7 各因素及其交互作用對(duì)提取率的影響

以前期試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面分析軟件，采用Box-Behnken原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的擬合與分析發(fā)現(xiàn)，超聲輔助法提野菊花藥材中總黃酮得率的模型：

由響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 8.0.6分析得出最佳生產(chǎn)條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為39.89%，乙醇溶液與野菊花藥材的液料比為50.61∶1（mL/g），提取時(shí)間59.83 min、提取溫度35.17℃、提取功率478.06 W（見(jiàn)圖7）。結(jié)合現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中的可行性，調(diào)整最佳適宜工藝為：乙醇濃度40%、乙醇溶液與野菊花藥材的液料比51∶1（mL/g）、超聲提取功率478 W、超聲提取時(shí)間60 min、超聲提取溫度35℃。在該優(yōu)化后的條件下進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，所得野菊花藥材提取液中總黃酮含量平均值為45.13 mg/g，與預(yù)測(cè)值45.397 mg/g極為接近，說(shuō)明對(duì)野菊花藥材總黃酮提取工藝條件參數(shù)的優(yōu)化可靠，與實(shí)際情況符合度高，具有較好的實(shí)操以及商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

（1）在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)下，對(duì)比分析乙醇提取液濃度、液料比、溫度、時(shí)間和功率對(duì)野菊花藥材中總黃酮提取含量的效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：時(shí)間為60 min、溫度為35℃、功率為480 W、乙醇濃度40%、液料比在50∶1（mL/g）時(shí)野菊花藥材中總黃酮提取效果最好。

（2）以前期試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面分析軟件，采用Box-Behnken原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的擬合與分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)合超聲輔助法提野菊花藥材中總黃酮得率的模型經(jīng)回歸計(jì)算，提取時(shí)間在59.83 min、提取溫度為35.17℃、提取功率為478.06 W、乙醇濃度39.89%、液料比在50.61∶1（mL/g）時(shí)提取野菊花藥材中總黃酮量可達(dá)最高。