刺山柑總生物堿抑制系統(tǒng)性硬皮病小鼠皮膚纖維化的作用機(jī)制探討

康小龍，趙宇涵，何承輝

1 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥研室，烏魯木齊830000；2 新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實驗室；3 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥劑室

系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）的主要特征為纖維化，是一種復(fù)雜的、動態(tài)的病理生理過程，可導(dǎo)致組織損傷［1］，其臨床癥狀首先出現(xiàn)雷諾現(xiàn)象，然后是手指和手背腫脹，皮膚變厚，急性腎危象，肺纖維化和肺動脈高壓等［2］。SSc 多發(fā)于女性，女性患病為男性的5倍，其病死率極高，平均五年生存率約為85%，肺部受累（間質(zhì)性肺病和肺動脈高壓）是引起死亡的最主要原因［3］。SSc 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，針對SSc 尚未有一種特效診療手段，研究其發(fā)病機(jī)制及有效治療藥物已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的一個重要目標(biāo)。研究表明，SSc 患者受損皮膚和從皮膚樣本中分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中都檢測到Notch 信號的激活，提示Notch 信號通路與SSc 有著密切的相關(guān)性［4］。本實驗室從新疆傳統(tǒng)維吾爾藥刺山柑果實中提取了有效成分刺山柑總生物堿，前期研究表明其可使SSc 模型小鼠真皮鱗狀上皮變薄，皮脂腺增多，炎性細(xì)胞浸潤減輕，能有效抑制皮膚膠原沉積，可能對SSc 皮膚纖維化有一定改善作用［5-6］?；谇捌趯嶒灒緦嶒炗^察了刺山柑總生物堿對SSc Notch 通路重要節(jié)點(diǎn)蛋白Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1 蛋白的調(diào)節(jié)作用，評價其對SSc Notch 通路的影響，探討刺山柑總生物堿抑制SSc皮膚纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無病原體雌性BALB/c小鼠60只，6 周齡，合格證號為SCXK（京）2016-0006，購自北京維通利華實驗動物公司。

1.2 藥物、試劑及儀器 博萊霉素（生產(chǎn)批號17001711）購自海正輝瑞制藥有限公司，青霉胺片（生產(chǎn)批號052160901）購自上海上藥信誼藥廠。兔抗小鼠Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1 抗體及山羊抗兔IgG-HRP 購自美國Cell Signaling 公司，SABC 免疫組化試劑盒、Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。Multifuge X1R型低溫離心機(jī)購自美國Thermo Fisher 公司，RM2245 型組織切片機(jī)、DFC360FX 型顯微鏡購自德國Leica 公司，Mini-protean Tetra System 型Western blotting 設(shè) 備 購自美國Biorad公司。

1.3 刺山柑總生物堿的提取 刺山柑干果打粉過篩，95%乙醇（10倍量）水?。?0 ℃）回流提取2次，每次0.5 h，合并過濾，減壓濃縮至藥材為藥液質(zhì)量的2倍。紫外分光光度法定量總生物堿占提取物的32%（w/w），高效液相色譜法測得鹽酸水蘇堿在提取物中含量為2.2%（w/w）。

1.4 實驗動物分組、SSc 模型制備、刺山柑總生物堿外敷方法及標(biāo)本取材 將60只小鼠隨機(jī)分為4組各15只。刺山柑總生物堿給藥組、模型組和陽性對照組均制備SSc模型［7-8］，小鼠背部被毛剃去，皮下注射博萊霉素造模（30 μg/d，30 d）?？瞻讓φ战M不制備SSc 模型，僅背部皮下注射生理鹽水。造模結(jié)束后，按刺山總生物堿乳膏臨床給藥劑量換算小鼠給藥劑量為450 mg/kg，將藥物外敷小鼠背部注射部位，陽性對照組灌胃給予青霉胺片（125 mg/kg），模型組、空白對照組背部注射部位外敷不含藥基質(zhì)，1次/天，共60 d。末次給藥后，各組小鼠均注射過量麻醉劑10%水合氯醛處死，取背部注射部位皮膚約0.2 g，一部分凍存于-80 ℃，用于Western blotting 實驗，另一部分置于10%甲醛中，用于免疫組化實驗。

1.5 小鼠背部注射部位皮膚組織Notch2、Jagged1、MAML1 蛋白檢測 采用Western blotting 法。取存于-80 ℃的皮膚組織標(biāo)本，加入預(yù)冷的RIPA裂解液制成10%組織勻漿，冰上裂解30 min，以12 000 r/min速度離心20 min，取上清液，用Lowry 法測定蛋白濃度，等量的蛋白樣品用十二烷基磺酸聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，Notch2、Jagged1、MAML1 一抗4 ℃下孵育12 h，用HRP 標(biāo)記的抗小鼠二抗孵育1 h，ECL 發(fā)光后顯影，使用ImageJ 軟件測量條帶的灰度值。以待測蛋白與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值的比值作相對蛋白表達(dá)量分析。

1.6 小鼠背部注射部位皮膚組織Hes1 蛋白檢測 取置于10%甲醛中的皮膚組織標(biāo)本，脫水，石蠟包埋，切片，行免疫組化染色：兔抗小鼠Hes1一抗在4 ℃孵育12 h，山羊抗兔IgG-HRP 二抗室溫孵育1 h，DAB 染色，水洗后蘇木精復(fù)染。顯微鏡攝片，Image-Pro Plus 6.0 軟件對圖片進(jìn)行Hes1 的相對表達(dá)量分析，平均光密度（MOD）=積分光密度（IOD）/組織面積（area），以平均光密度值作為Hes1 相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組皮膚組織Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1蛋白相對表達(dá)量比較見表1。

表1 各組皮膚組織Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表1 各組皮膚組織Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別刺山柑總生物堿組模型組陽性對照組空白對照組n 15 15 15 15 Notch2蛋白0.184±0.007△0.236±0.010*0.181±0.008△0.179±0.007 Jagged1蛋白0.645±0.024△0.953±0.035*0.672±0.025△0.654±0.024 MAML1蛋白0.926±0.034△0.676±0.025*0.708±0.060 0.474±0.185 Hes1蛋白0.175±0.049△0.343±0.124*0.143±0.021△0.105±0.012

3 討論

SSc 是一種慢性纖維化結(jié)締組織疾病，會影響皮膚和各種內(nèi)臟器官，包括肺、胃腸道和心臟，預(yù)后較差。SSc 早期的組織病理學(xué)特征是血管周圍炎性浸潤和毛細(xì)血管密度降低，而晚期的特征是細(xì)胞外基質(zhì)過度積累［9-10］，由此產(chǎn)生的纖維化破壞了受影響組織的生理結(jié)構(gòu)并干擾了正常的器官功能，組織纖維化是SSc 患者死亡的主要原因［11］。在彌漫性皮膚SSc 患者中，總體10 年生存率為60%～70%［11］。SSc的發(fā)病原因尚不能完全解釋清楚，但是可能和遺傳因素有關(guān)，遺傳基因差異性可以解釋SSc 的易感性和臨床異質(zhì)性。也有研究表明，SSc 患病是接觸了某些化學(xué)品與職業(yè)病的原因（如氯乙烯和有機(jī)溶劑）［12-13］。SSC 發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，并且目前還沒有一種特別有效的治療方法或者特效藥物，所以研究SSc 的發(fā)病機(jī)制和有效治療藥物成為了一個熱點(diǎn)［14-15］。

刺山柑又名老鼠瓜、野西瓜、槌果藤，為白花菜科山柑屬植物，系維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材之一，多分布在新疆南北坡地，喜生于沙漠戈壁和低山坡石質(zhì)沙土地帶，我國新疆、西藏等地均有分布。刺山柑性味辛苦溫，具有祛風(fēng)散寒、除濕、消腫止痛、擴(kuò)張血管的功效。研究表明，刺山柑乙醇提取物可抑制SSc 患者成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原的合成［16］；刺山柑鮮果75%乙醇調(diào)制的糊膏以及刺山柑流浸膏均能顯著抑制硬皮病模型小鼠的真皮增厚、膠原沉積［17］；刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物能減小硬皮病小鼠真皮厚度，抑制Ⅰ型膠原及轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)［18］。本課題組從刺山柑中提取了有效部位刺山柑總生物堿，其可使博萊霉素誘導(dǎo)的SSc 小鼠真皮鱗狀上皮變薄，膠原纖維明顯減少，排列疏松、均質(zhì)化，皮脂腺增多，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少；可明顯降低小鼠真皮厚度，降低小鼠皮膚羥脯氨酸，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原含量和膠原沉積，降低Ⅰ型膠原α 亞單位及α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)，抑制SSc 纖維化形成過程中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，減少膠原表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)合成，改善SSc組織纖維化［19-21］。

Notch 通路是一種進(jìn)化上高度保守的信號通路，有5 種 不 同 的Notch 配 體Jagged1、Jagged2 和Delta-like 1、3、4和4種不同的Notch受體（Notch1-4），Notch受體及配體都是跨膜蛋白，通過細(xì)胞間的相互作用啟動信號級聯(lián)，Notch 受體與其配體之一結(jié)合，會誘導(dǎo)Notch 構(gòu)象變化，導(dǎo)致S2 位點(diǎn)暴露，在ADAM17 金屬蛋白酶作用下引發(fā)Notch 在細(xì)胞外分裂，釋放出Notch 的胞內(nèi)段（NICD），NICD 轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，NICD 與核中RBP-Jκ 的結(jié)合通過組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶的募集和共激活物MAML1 相互作用，通過置換與結(jié)合的共阻遏物復(fù)合物來激活轉(zhuǎn)錄，啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因主要屬于Hes 和Hey 家族，上述Notch 傳導(dǎo)途徑被稱為經(jīng)典的Notch通路［22-24］。

最近一些文獻(xiàn)表明，Notch信號的過度表達(dá)可能在多種疾病中產(chǎn)生纖維化效應(yīng)，包括硬皮病、特發(fā)性肺纖維化、腎纖維化和心臟纖維化［25-26］。異常的Notch 信號與SSc 有關(guān)［27-28］，Notch 配體Jagged1 在SSc皮膚過度表達(dá)，誘導(dǎo)SSc 成纖維細(xì)胞內(nèi)NICD 的積累，導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄增加［27］。在SSc 患者體內(nèi)也證實了存在Notch2 上調(diào)，并且Notch2 的活化促進(jìn)了纖維化的進(jìn)展［29］。重組Jagged1 在健康皮膚成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)出類似SSc 的表型，它刺激靜息期成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，促進(jìn)膠原蛋白的釋放［27］。用DAPT（一種阻止NICD 釋放的分泌酶抑制劑）治療小鼠，可以減少皮膚和肺部的膠原含量和自身抗體的產(chǎn)生，從而阻止不同小鼠模型中SSc 的發(fā)展［30-31］；Notch 信號在SSc 患者和不同的實驗性纖維化模型中被激活，并伴隨著NICD 的積累和目標(biāo)基因Hes1轉(zhuǎn)錄的增加，用Notch siRNA治療SSc小鼠可以防止皮膚增厚和纖維化［31］。與上述研究相同，本實驗也證實Notch 通路相關(guān)蛋白Notch2、Jagged1、MAML1 和Hes1 在模型組小鼠皮膚過表達(dá)，提示模型組小鼠存在Notch 通路的過度激活，而刺山柑總生物堿可下調(diào)Notch2、Jagged1 和Hes1 蛋白的表達(dá)，提示SSc 小鼠受損皮膚Notch 通路中過表達(dá)的Notch2、Jagged1 和Hes1 可被刺山柑總生物堿抑制，其對SSc Notch 通路的過度激活有一定調(diào)控作用。而刺山柑總生物堿組MAML1 蛋白表達(dá)卻顯示升高，具體原因還不清楚，還需進(jìn)一步的實驗加以驗證。

總之，刺山柑總生物堿可調(diào)控SSc 小鼠受損皮膚Notch 通路，具體作用機(jī)制為抑制Notch2、Jagged1、Hes1蛋白表達(dá)。