骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對成年大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞鐵死亡的改善作用及其機(jī)制

陳美婷，肖邦，朱怡卿，劉夢，黃金鳳，王芳

海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，上海200433

宮腔粘連（IUA）指女性子宮腔或者宮頸管發(fā)生部分或完全閉塞，進(jìn)而引起月經(jīng)異常、周期性腹痛、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及不育等的一種綜合病癥［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%的IUA 與宮內(nèi)手術(shù)對子宮內(nèi)膜的損傷有關(guān)。鐵死亡是一種區(qū)別于細(xì)胞凋亡、壞死、自噬性死亡的細(xì)胞程序性死亡方式，其在創(chuàng)傷性損傷誘發(fā)的繼發(fā)性損傷過程中發(fā)揮重要作用［2-4］。在體內(nèi)外腦出血模型中存在神經(jīng)元鐵死亡現(xiàn)象，采用鐵死亡抑制劑能有效地減輕腦出血性損傷［5-7］。外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小膜泡，其中含有的信號分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變靶細(xì)胞的功能。最近有研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過靶向TGFβ/SMAD2 信號通路促進(jìn)傷口的愈合。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體（BMSCs-Exo）在子宮內(nèi)膜損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡中的作用及機(jī)制還有待研究。2021 年3—11 月，我們觀察了BMSCs-Exo對子宮內(nèi)膜細(xì)胞鐵死亡的改善作用，并探討其可能機(jī)制，旨在為IUA的防治提供潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 斷乳雌性SD 乳鼠（50～60 g）5 只、成年雌性SD 大鼠（200～220 g）90 只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，并飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物屏障設(shè)施。動物所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 主要儀器：超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、透射電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀、高速低溫離心機(jī)、恒溫干燥箱、電泳儀、垂直電泳槽、分光光度計(jì)等。主要試劑：ficoll 密度梯度離心液、低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒、Fe2+檢測試劑盒、細(xì)胞或組織提取液GSH 檢測試劑盒、小鼠GAPDH 單抗、小鼠HNE單抗、小鼠GPX4單抗、HRP標(biāo)記兔抗小鼠二抗、預(yù)染蛋白maker。

1.3 乳鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定及外泌體提取 ①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定：參照文獻(xiàn)［8］報(bào)道方法分離乳鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。應(yīng)用頸椎脫臼的方法處死乳鼠，75%酒精浸泡2 min 充分消毒，然后用手術(shù)剪分離雙側(cè)股骨，并且把股骨上的肌肉組織剔除干凈。然后用冰預(yù)冷的含100 U/mL 肝素鈉的低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗骨髓腔三次，收集骨髓腔里面的細(xì)胞。接著將沖洗收集到的骨髓細(xì)胞懸液 與ficoll 梯 度 液 按1∶3 比 例 混 合，300 g 離 心20 min，收集白顏色細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移至一個新的離心管，然后用含10%胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次。接著用低糖DMEM 完全培養(yǎng)基（含體積比10%胎牛血清、100 U/mL雙抗）重懸細(xì)胞，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃）。培養(yǎng)3 d 后，緊密黏附細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞即為P0 代BMSCs。BMSCs 傳代培養(yǎng)至P3 代，細(xì)胞生長到每孔面積80%～90%的匯合程度時，棄去培養(yǎng)基，然后用2.5%胰蛋白酶消化貼壁的細(xì)胞，2 000 r/min 離心10 min，倒掉上清，用冰預(yù)冷PBS 重懸洗滌兩遍細(xì)胞沉淀，最后用含5 μL 異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD90、CD29 和CD34、CD45 抗體孵育緩沖液重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀對BMSCs 的表面陽性標(biāo)記CD90、CD29 和陰性標(biāo)記CD34、CD45 進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29 和CD90 在我們分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面高水平表達(dá)，分別為99.54%±0.22%和98.10% ± 0.11%，而幾乎不表達(dá)CD34（0.05% ±0.03%）和CD45（3.13% ± 0.52%）。②BMSCs-Exo提取：參照文獻(xiàn)［9］方法，以超速離心法從乳鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM）中分離外泌體。主要包含以下幾個步驟：a.300 g離心CM 10 min，去除中的死細(xì)胞或細(xì)胞碎片。b.20 000 g離心30 min，去除大的微泡。c.轉(zhuǎn)移上述步驟離心后得到的上層清液至新的試管里面，應(yīng)用0.8 μm的Poretics PCTE 濾膜過濾，接著超高速離心（110 000 g 離心2 h），濃縮過濾樣品。d.濃縮后的樣品用PBS 重懸，離心（100 000 g，時間1 h）。e.用50～100 μL 的PBS 重懸外泌體顆粒，保儲在－80°C，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 成年大鼠分組、子宮內(nèi)膜損傷模型制備及BMSCs-Exo 注射方法 每天下午14點(diǎn)～18點(diǎn)對大鼠進(jìn)行陰道涂片分析，確定動物的動情周期。選擇具有4 個連續(xù)動情周期的雌性SD 大鼠進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。取60只大鼠，并分為治療組和損傷組，各30例，兩組均制備子宮內(nèi)膜損傷模型，制備過程：腹腔注射3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，在腹中線靠后1/3處按順序依次切開皮膚、肌肉、腹膜，暴露子宮。在子宮中、遠(yuǎn)端連接處的下1/3 處切開子宮壁1.0 cm切口，然后用2 mm刮勺刮取子宮內(nèi)膜，直至子宮壁變得粗糙及子宮內(nèi)膜明顯腫脹，用可吸收縫線縫合切口。治療組尾靜脈注射BMSCs-Exo（800 μg/200 g），損傷組靜脈注射等量生理鹽水。術(shù)后連續(xù)肌肉注射青霉素5 d，每天注射1 次，防止術(shù)后感染。另取30只成年大鼠作對照（對照組），不制備子宮內(nèi)膜損傷模型，只靜脈注射等量生理鹽水。手術(shù)4周后，安樂死處死大鼠，收集子宮內(nèi)膜組織樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及子宮內(nèi)膜組織Fe2+、MDA、GSH、GSSG 檢測 ①子宮內(nèi)膜細(xì)胞線粒體外膜、線粒體脊形態(tài)：采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞線粒體外膜、線粒體脊。收取子宮內(nèi)膜組織樣本，用電鏡專用固定液進(jìn)行固定，鋨酸固定，酒精脫水，甲基丙烯酸甲酯或環(huán)氧樹脂包埋，切片，染色，用透射電子顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞線粒體外膜、線粒體脊。②子宮內(nèi)膜組織Fe2+、MDA、GSH、GSSG：采用活體組織二價鐵離子測定試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）含量測定試劑盒、氧化型谷胱甘肽（GSSG）檢測試劑盒分別檢測各組子宮內(nèi)膜組織Fe2+、MDA、GSH、GSSG。a.Fe2+：取1 g 子宮內(nèi)膜組織，按照質(zhì)量體積比1∶9 加入9 倍體積的生理鹽水，然后運(yùn)用組織研磨儀研磨制作成組織勻漿液，離心（2 000 r/min，10 min），收集上清，用于后續(xù)檢測。每個樣品加入鐵還原劑混勻，室溫孵育30 min。然后在每個樣品加入鐵探針100 μL，用移液器輕輕混勻，室溫孵育60 min，整個孵育過程注意在避光的條件下進(jìn)行，使用分光光度計(jì)在593 nm 處測量吸光度值。b.MDA：取500 μL 勻漿液，加入1.5 mL 的50%冰醋酸，水浴煮沸20 min，反應(yīng)液PH 調(diào)至7.0，加入2 mL 溶液后煮沸5 min，測定540 nm 處吸光度值。c.GSH、GSSG：取0.5 g 子宮內(nèi)膜組織，加入3 mL 冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol/L EDTA，pH2.8），冰浴研磨，勻漿液以20 000 g 速度，在4 ℃條件下離心15 min，取上清液測定GSH和GSSG的含量。GSH含量測定如下：200 μL 提取液加1.2 mL 反應(yīng)液包含400 μL 反 應(yīng) 液1（110 mmol/L Na2HPO4·7H20，40 mmol/L NaH2PO4·H2O，15 mmol/L EDTA，0.3 mmol/L 5，5'-二硫代雙，0.04%BSA）、320 μL 反應(yīng) 液2（1 mmol/L EDTA，50 mmol/L 咪 唑 溶 液，0.02%BSA）、400 μL 反應(yīng)液3（5%Na2HPO4，pH 7.5的溶液稀釋50 倍）、80 μL NADPH（9.0 mmol/L），測定OD412 下的吸光度值。GSSG 含量測定如下：200 μL 提取液加入1 mL 的2-2 乙烯嘧啶（稀釋50倍），25 ℃水浴1 h，測定OD412 下的吸光度值。每個樣本測三個復(fù)孔，最后計(jì)算每組的平均值。以對照組為參照，計(jì)算損傷組或治療組與對照組之間的比值。

1.6 實(shí)驗(yàn)大鼠子宮內(nèi)膜組織谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）、4-羥基壬烯醛（4-HNE）檢測 采用蛋白印跡法。取子宮內(nèi)膜組織，剪成1 mm3小塊，用含1 mmol苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液裂解各個組的子宮內(nèi)膜組織，提取組織總蛋白。蛋白變性處理：蛋白提取液與5×loading buffer 按照1∶4 的體積比進(jìn)行混合均勻，然后煮沸15 min。電泳：壓縮膠電壓設(shè)定為60 V，時間30 min，分離膠電壓和時間 為120 V、60 min。轉(zhuǎn) 膜：電 壓120 V，時 間120 min 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。封閉：封閉液（5%脫脂牛奶）孵育過夜。一抗孵育：抗4HNE 一抗（1∶2 000）、抗GPX4 一抗（1∶1 000），孵育（4 ℃，過夜）。二抗孵育：抗體稀釋液（5%脫脂奶粉）與HRP 標(biāo)記的二抗按1∶10 000 體積比稀釋，然后室溫孵育，時間為60 min。 Kodak Gel Logic 4000 R 成 像 系 統(tǒng)（Carestream，美國）掃描拍照，并進(jìn)行條帶的光密度掃描分析，計(jì)算每組動物的光密度平均值，GAPDH作為內(nèi)參對照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞線粒體外膜、線粒體脊比較 各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞線粒體外膜、線粒體脊比較見圖1。由圖1 可知，對照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整、線粒體脊清晰可見；損傷組子宮內(nèi)膜組織中線粒體出現(xiàn)濃縮、膜增厚、脊減小或消失及外膜破裂等細(xì)胞鐵死亡的特征；治療組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)、線粒體脊增多、線粒體大小正常。

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞線粒體外膜、線粒體脊形態(tài)（TEM下）

2.2 治療組、損傷組大鼠子宮內(nèi)膜組織Fe2+、MDA、GSH、GSSG 表達(dá)比較 大鼠子宮內(nèi)膜組織Fe2+、MDA、GSH、GSSG表達(dá)比較見表1。

表1 治療組、損傷組大鼠子宮內(nèi)膜組織Fe2+、MDA、GSH、GSSG表達(dá)比較（%，±s）

表1 治療組、損傷組大鼠子宮內(nèi)膜組織Fe2+、MDA、GSH、GSSG表達(dá)比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與損傷組比較，△P＜0.05。

組別治療組損傷組n 30 30 MDA 108± 5△170±20*Fe2+104± 2△158±12*GSH 96±16△53± 6*GSSG 89± 3△167±21*

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織GPX4、4HNE 表達(dá)比較 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織GPX4、4HNE 表達(dá)比較見表2。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織GPX4、4HNE表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織GPX4、4HNE表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與損傷組比較，△P＜0.05。

組別治療組損傷組對照組n 30 30 30 GPX4 0.145±0.002△0.026±0.023*0.149±0.003 4HNE 0.043±0.008△0.132±0.004*0.047±0.034

3 討論

子宮內(nèi)膜損傷是引起IUA 的最重要原因，90%的IUA 與宮內(nèi)手術(shù)引起的子宮內(nèi)膜損傷有關(guān)。目前認(rèn)為，子宮內(nèi)膜損傷后細(xì)胞功能嚴(yán)重受損，腺體減少或者缺乏活性，同時損傷后出血導(dǎo)致的間質(zhì)內(nèi)局部微環(huán)境誘發(fā)的繼發(fā)性損傷使子宮內(nèi)膜不能完全修復(fù)，最終導(dǎo)致IUA 形成。因此，子宮內(nèi)膜損傷后如何有效地控制繼發(fā)性損傷，促進(jìn)殘存細(xì)胞的存活，對于保護(hù)子宮內(nèi)膜細(xì)胞功能從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)至關(guān)重要。鐵死亡是細(xì)胞膜上高表達(dá)的不飽和脂肪酸在二價鐵離子或酯氧合酶的催化下發(fā)生脂質(zhì)過氧化而誘導(dǎo)的一種細(xì)胞程序性死亡方式，其主要的形態(tài)學(xué)特征是線粒體膜增厚、皺縮，線粒體脊減少或者消失，線粒體外膜破裂，細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞核正常，染色體無凝聚，細(xì)胞發(fā)生聚集［10］。已有研究數(shù)據(jù)表明，鐵死亡在諸多疾病的的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著及其重要的角色，包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、缺血再灌注損傷、腦卒中以及創(chuàng)傷性損傷等［11-12］。然而，鐵死亡在子宮內(nèi)膜損傷不完全修復(fù)過程中的作用還不甚明了。

外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的包含有許多特殊調(diào)控小分子的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)微小囊泡，其通過介導(dǎo)信號分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能。越來越多的研究證實(shí)，外泌體在很多生理病理過程中（如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等）起重要的作用。在缺血再灌注的早期階段，BMSCs-Exo 通過miR-199a-5p靶向免疫球蛋白結(jié)合蛋白抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減少腎臟缺血再灌注損傷。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在子宮內(nèi)膜損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡中的作用及機(jī)制還有待研究。本研究顯示，損傷4周后，大鼠子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞發(fā)生線粒體皺縮、線粒體嵴減少或消失，同時鐵死亡相關(guān)指標(biāo)二價鐵離子、MDA、GSSG發(fā)生顯著上調(diào)，GSH 發(fā)生顯著下調(diào)。這提示機(jī)械損傷導(dǎo)致出血引起子宮內(nèi)膜組織鐵超載從而誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。另外我們的數(shù)據(jù)也顯示，BMSCs-Exo處理可以抑制損傷誘導(dǎo)的二價鐵離子、MDA、GSSG上調(diào)及GSH下調(diào)，這表明BMSCs-Exo可以抑制損傷誘導(dǎo)的大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞鐵死亡。

目前已有研究數(shù)據(jù)表明，鐵死亡可以被不同的條件因素（例如缺血再灌注損傷、創(chuàng)傷性損傷、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等）或者小分子激活劑所誘導(dǎo)，同時，不同的條件因素引發(fā)細(xì)胞鐵死亡的上游信號通路不同，但是不同的上游信號最終都是通過直接或間接影響谷胱甘肽合成從而抑制GPX4 的活性，后者的活性降低導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力降低，ROS 堆積，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧生成與降解平衡失調(diào)，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［13-14］。本研究中發(fā)現(xiàn)，機(jī)械損傷誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜組織中GSH、GPX4 發(fā)生顯著性下調(diào)，而BMSCs-Exo 可以顯著地抑制損傷下調(diào)GSH、GPX4 表達(dá)的作用。上述結(jié)果提示，BMSCs-Exo 可能通過恢復(fù)損傷的子宮內(nèi)膜組織中GPX4 的表達(dá)，進(jìn)而提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的堆積，從而減輕細(xì)胞膜過氧化，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞鐵死亡。4HNE 為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其還可以通過與蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定狀態(tài)的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，被HNE 修飾后，被氧化的蛋白質(zhì)會在結(jié)構(gòu)發(fā)生進(jìn)一步的改變從而影響其功能［15］。越來越多的研究證據(jù)表明，增加脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物會破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致線粒體損傷［16］。細(xì)胞的存活和功能發(fā)揮都依賴細(xì)胞內(nèi)能量代謝的正常進(jìn)行。而線粒體作為細(xì)胞能量的供給站，其結(jié)構(gòu)完整性和功能的喪失導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要因素，其也是鐵死亡的一個重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)BMSCs-Exo 可以顯著地下調(diào)損傷誘導(dǎo)的大鼠子宮內(nèi)膜組織中4HNE 表達(dá)，促進(jìn)損傷導(dǎo)致的線粒體外膜結(jié)構(gòu)、線粒體脊破壞恢復(fù)。因此，我們猜測BMSCs-Exo 可能通過下調(diào)4HNE 的表達(dá)來維持細(xì)胞線粒體的完整性，從而維持線粒體內(nèi)正常的生理生化反應(yīng)及能量代謝過程，進(jìn)而抑制細(xì)胞鐵死亡。因此，基于以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們推斷，BMSCs-Exo 抑制損傷誘導(dǎo)的大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞鐵死亡的一種機(jī)制可能是：上調(diào)GPX4 的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗氧化能力，同時下調(diào)4HNE 的表達(dá)進(jìn)而維持細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)完整和正常功能的發(fā)揮，從而來抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

總之，BMSCs-Exo 對成年大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞鐵死亡有改善作用，其可能機(jī)制是通過上調(diào)子宮內(nèi)膜組織中GPX4表達(dá)以及下調(diào)4HNE的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。