子宮內膜癌組織中miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA的表達變化及其意義

吳曉蕊，靳榮，盧慧

天津市第五中心醫(yī)院婦產科，天津300450

子宮內膜癌是起源于子宮內膜上皮的惡性腫瘤，為女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，全球發(fā)病率為10.8/10 萬，約41.7 萬例［1］。早期子宮內膜癌的腫瘤局限于子宮體，手術切除病灶可取得較好預后，但對于晚期子宮內膜癌，術后轉移復發(fā)幾率高，盡管近年靶向和免疫治療顯著進步，但患者生存率仍不能令人滿意［2］。腫瘤是多因素、多基因變異參與的過程，非編碼RNA 是一類不編碼蛋白質的RNA，參與調節(jié)細胞增殖、分化、侵襲、遷移、凋亡等行為，在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調控作用［3-4］。微小RNA-128-3p（miRNA-128-3p）是 一 種 高 度 保 守的miRNA，其參與宮頸癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤進展［5-6］。缺口受體1（Notch1）是一種配體激活的轉錄因子，能與同源配體相互作用而改變蛋白構象，激活下游特定靶基因表達，在細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮調節(jié)作用［7］。B 細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒整合位點1（BMI1）是多梳抑制復合物1復合體的一個組分，能通過修飾染色質，參與細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等調控［8］。研究報道，Notch1和BMI1在子宮內膜癌中高表達，與癌細胞惡性行為相關［9-10］。2014 年10 月—2018 年10 月，我們觀察了子宮內膜癌組織中miR-128-3p 及Notch1、BMI1 mRNA的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014 年10 月—2018 年10 月天津市第五中心醫(yī)院收治的子宮內膜癌患者50例，年齡35～76（50.25±5.66）歲；組織學分型：子宮內膜樣癌（EEC）124 例，非子宮內膜樣癌（NEEC）26例；分化程度：低分化59 例，中高分化91 例；國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）分期［11］：Ⅰ～Ⅱ期91 例，Ⅲ～Ⅳ期59 例；血管侵犯：有36 例，無114 例；淋巴結轉移：有60 例，無90 例。納入標準：①經術后病理檢查確診為子宮內膜癌；②入院前未接受任何放療、化療、免疫治療、激素治療等；③病理資料和隨訪資料完整者。排除標準：①合并其他部位腫瘤者；②非原發(fā)性性子宮內膜癌者；③嚴重心、肝、腎等臟器疾病者；④全身感染性疾病者；⑤合并其他嚴重婦科疾病者。手術留取子宮內膜癌及其癌旁（距離癌組織＞5 cm）組織各150 例份，新鮮組織獲取后立即分裝于凍存管中置放入液氮保存。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，且患者及家屬均知情同意。

1.2 子宮內膜癌組織中miR-128-3p 及Notch1、BMI1 mRNA 檢測 取出液氮凍存組織，加入TRIzol（上海捷瑞生物工程有限公司，貨號：GK3006）裂解提取組織總RNA，核酸蛋白測定儀（德國艾本德，型號：BioPhotometer plus）測定總DNA 濃度及純度，使OD260/OD280為1.8～2.0，Takara 試劑盒反轉錄合成cDNA，使用qRT-PCR 儀（美國伯樂公司，型號：S1000）和試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術有限公司，貨號：639506）進行qRT-PCR 擴增。miR-128-3p 上游引 物：5′-GGAATTCAACCAACTGTCAATAACTGGAG-3′，下游引物：5′-CGGGATCCAATTTGTCATCCAAATCTACTTTGG-3′；內 參U6 上 游 引 物：5′-TGAACGCCGAGGGTGAGTGTCG-3′，下游引物：5′-CGGAACGTGACGTGTGGCGTACG-3′；Notch1 上游引物：5′-CGTGTGAACCCGTAGGCGCC-3′，下游引物：5′-GGCCAACGTGTGCAAGCGACGGC-3′；內參GAPDH 上 游 引 物：5′-GCGATAAGTGCTGAGCTGCTC-3′，下游引物：5′-GTTGACGCGAACTGACGTGT-3′；BMI1 上游引物：5′-CTGGTTGCCCATTGACAGC-3′，下 游 引 物：5′-CAGAAAATGAATGCGAGCCA-3′；內參GAPDH 上游引物：5′-TGCACCACCA ACTGCTTAGC-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。反 應 體 積 共20 μL：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix；2 μL上游、下游引物；2 μL cDNA 模板；4 μL 經DEPC 處理水。反應條件：95 ℃預變性10 min 1 次；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)40次。反應結束后得到各反 應 管Ct，構 建 溶解 曲線，采 用2-ΔΔCt法 計算 組織中miR-128-3p及Notch1、BMI1 mRNA相對表達量。

1.3 隨訪方法 通過門診或電話方式隨訪3 年，隨訪至2021 年10 月，隨訪內容包括婦科盆腔檢查、陰道B 超、胸部X 線檢查，必要時進行CT 或MRI檢查，統(tǒng)計術后3年累積生存率。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；Pearson 相關分析法分析子宮內膜癌組織中miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達的相關性；K-M 法繪制不同miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達子宮內膜癌患者生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank檢驗；多因素Cox 回歸分析法分析子宮內膜癌患者死亡影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌及其癌旁組織中miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 相對表達量比較 子宮內 膜 癌 組 織 中 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 相對表達量分別為0.66±0.22、2.79±0.43、1.25 ± 0.26，癌旁組織分別為1.00 ± 0.21、2.02±0.37、0.76±0.28，兩者比較，P均＜0.05。

2.2 子 宮 內 膜 癌 組 織 中 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達的相關性 子宮內膜 癌 組 織 中 miR-128-3p 與 Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達均呈負相關（r分別為-0.744、-0.733，P均＜0.05），Notch1 mRNA 與BMI1 mRNA表達呈正相關（r=0.803，P＜0.05）。

2.3 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系 結果見表1，由 表 1 可 知 ，miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達與子宮內膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴結轉移有關（P均＜0.05）。

表1 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系（±s）

表1 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系（±s）

臨床病理特征年齡≥50歲＜50歲組織學分型EEC NEEC分化程度低分化中高分化FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期血管侵犯有 無淋巴結轉移是 否n 86 64 124 26 59 91 91 59 36 114 60 90 miR-128-3p 0.66±0.21 0.67±0.24 0.68±0.21 0.59±0.26 0.51±0.20 0.70±0.23 0.71±0.22 0.45±0.20 0.52±0.21 0.69±0.22 0.48±0.19 0.72±0.22 Notch1 mRNA 2.82±0.41 2.75±0.46 2.79±0.42 2.78±0.49 2.99±0.43 2.72±0.42 2.69±0.41 2.95±0.42 3.05±0.43 2.74±0.42 2.96±0.41 2.67±0.41 BMI1 mRNA 1.27±0.25 1.23±0.26 1.25±0.26 1.27±0.25 1.41±0.26 1.21±0.24 1.19±0.24 1.59±0.25 1.46±0.24 1.21±0.25 1.65±0.24 1.19±0.24

2.4 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達與子宮內膜癌患者預后的關系 根據(jù)miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 相對表達量將150 例子宮內膜癌患者分為高低表達者，miR-128-3p≥0.66、0.66 者術后3 年累積生存率分別為80.56%（58/72）、57.69%（45/78），兩 者 比 較，P＜0.05；Notch1 mRNA≥2.79、＜2.79 者術后3 年累積生存率分別為60.00%（45/75）、77.33%（58/75），兩者比較，P＜0.05；BMI1 mRNA≥1.25、＜1.25 者術后3 年累積生存率分別為55.84%（43/77）、82.19%（60/73），兩者比較，P＜0.05。

2.5 子宮內膜癌患者死亡影響因素的多因素Cox回歸分析結果 隨訪3～36個月，中位隨訪27個月，死亡47 例，存活103 例。死亡者年齡≥50 歲29 例（61.70%）、EEC 40 例（85.11%）、低 分 化25 例（53.19%）、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期42 例（89.36%）、血管 侵 犯21 例（44.68%）、淋 巴 結 轉 移41 例（87.23%）、miR-128-3p≥0.66 9 例（19.15%）、Notch1 mRNA≥2.79 38 例（80.85%）、BMI1 mRNA≥1.25 40 例（85.11%），存 活 者 年 齡≥50 歲57 例（55.34%）、EEC 84 例（81.55%）、低 分 化34 例（33.01%）、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期17 例（16.50%）、血管 侵 犯15 例（14.56%）、淋 巴 結 轉 移19 例（18.45%）、miR-128-3p≥0.66 63 例（61.17%）、Notch1 mRNA≥2.79 37 例（35.92%）、BMI1 mRNA≥1.25 37 例（35.92%），兩者低分化比例、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期比例、血管侵犯比例、淋巴結轉移比例、miR-128-3p≥0.66 比例、Notch1 mRNA≥2.79 比例、BMI1 mRNA≥1.25 比例比較，P均＜0.05。以隨訪時間為時間變量，年齡（≥50歲=1，＜50歲=0）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、FIGO分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、血管侵犯（有=1，無=0）、淋巴結轉移（有=1，無=0）、miR-128-3p（≥0.66=1，＜0.66=0）、Notch1 mRNA（≥2.79=1，＜2.79=0）、BMI1 mRNA（≥1.25=1，＜1.25=0）為自變量，是否死亡（是=1，否=0）為因變量，多因素Cox 回歸分析顯示，F(xiàn)IGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋 巴 結 轉 移、Notch1 mRNA≥2.79、BMI1 mRNA≥1.25為子宮內膜癌患者死亡獨立風險因素，miR-128-3p≥0.66 為獨立保護因素（P＜0.05），詳見表2。

表2 子宮內膜癌患者死亡影響因素的多因素Cox回歸分析結果

3 討論

子宮內膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，通常發(fā)生于絕經后，臨床癥狀以不規(guī)則陰道流血、排液為主，其相關危險因素包括持續(xù)雌激素暴露、初潮早、未育、絕經延遲、代謝異常、攜帶子宮內膜癌遺傳易感基因等，近年來由于低運動量和高脂高熱飲食生活方式的影響，子宮內膜癌發(fā)病率呈年輕化和上升趨勢，嚴重影響女性生理和心理健康［12-14］。目前，子宮內膜癌的治療仍以手術為主，放療和化療為輔，對于早期子宮內膜癌一般預后較好，但仍有部分患者可能存在癌灶轉移，同時對于晚期存在宮外轉移患者，即使進行多學科協(xié)作治療也難獲得良好預后，因此亟需闡明子宮內膜癌發(fā)病機制，尋找評估預后指標對改善患者預后具有重要意義。

miRNA 是約22 個核苷酸組成的非編碼RNA，能在3′-非翻譯區(qū)與靶基因的mRNA結合，導致靶基因轉錄后沉默，從而調控靶基因表達，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌或抑癌作用［15］。研究［16-17］表明，子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多種miRNA 的異常表達，對子宮內膜癌細胞增殖、遷移、浸潤等生物學行為產生影響。miR-326能靶向抑制B細胞淋巴瘤/白血病-2 表達，抑制子宮內膜癌細胞增殖和促進凋亡［16］。miR-501 能靶向抑制同源框D10 表達，促進子宮內膜癌細胞增殖和轉移［17］。miR-128-3p是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其在多種惡性腫瘤中異常表達。楊吉鵬等［18］發(fā)現(xiàn)，miR-128-3p 在膠質母細胞瘤中低表達，能靶向抑制同源框A5 抑制膠質母細胞瘤細胞增殖、侵襲及抗凋亡能力。BAI 等［19］認為，miR-128-3p在結直腸癌中高表達，能通過抑制叉頭框O4 激活JAK 激酶/信號轉導和轉錄活化因子3和轉化生長因子β/SMAD 信號調節(jié)上皮間質轉化，促進結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲。上述研究提示，miR-128-3p 在不同惡性腫瘤中發(fā)揮致癌或抑癌基因作用。本研究顯示，與癌旁組織比較，子宮內膜癌組織中miR-128-3p 表達降低，并且與子宮內膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴結轉移有關，提示miR-128-3p 在子宮內膜癌中發(fā)揮抑癌基因作用。文獻［20］報道，上調miR-128-3p 表達能抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的能力。本研究還顯示，miR-128-3p 高表達者術后3 年累積生存率明顯升高，生存時間明顯延長，提示miR-128-3p 低表達與子宮內膜癌患者預后不良相關；miR-128-3p 高表達是子宮內膜癌患者死亡的獨立保護因素，說明miR-128-3p可作為判斷預后的分子標志物。

既往研究認為腫瘤的發(fā)生原癌基因激活和抑癌基因失活有關，近年研究認為信號轉導途徑異常，導致細胞接受異常增殖、分化信號是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵因素［21］。Notch1 作為一種配體激活的轉錄因子，能將胞外信號轉化為核內基因表達，進而調控細胞表面受體和核轉錄，其信號通路是一條進化保守的細胞間相互作用機制，在細胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用，能通過激活核因子-κB、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白等多條信號通路促進腫瘤細胞增殖、分化、遷移、上皮—間質轉化等行為［22-23］。本研究顯示，與癌旁組織比較，子宮內膜癌組織中Notch1 mRNA 表達升高，并且與子宮內膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴結轉移有關，提示Notch1 在子宮內膜癌中發(fā)揮致癌基因作用，其機制可能與Notch1 可激活多條腫瘤相關信號通路促進子宮內膜癌惡性進展有關。牛麗佳等［24］認為，Notch1 能誘導子宮內膜癌細胞上皮—間質轉化，促進子宮內膜癌細胞增殖、遷移、侵襲。本研究還顯示，Notch1 mRNA 高表達者術后3 年累積生存率明顯降低，生存時間明顯縮短，提示Notch1 mRNA高表達與子宮內膜癌患者預后不良相關；Notch1 mRNA高表達是子宮內膜癌患者死亡的獨立風險因素，說明Notch1 mRNA 可作為判斷預后的分子標志物。

多梳基因家族是重要的表觀遺傳修飾基因，與細胞增殖和細胞周期密切相關，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用，BMI1是首個被鑒定的多梳基因家族功能基因，作為一種原癌基因，BMI1 能通過調控WNT/β-連環(huán)蛋白、Notch、磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B、c-Jun 氨基端激酶等信號通路參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展［25-27］。本研究顯示，與癌旁組織比較，子宮內膜癌組織中BMI1 mRNA表達升高，并且與子宮內膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴結轉移有關，提示BMI1 在子宮內膜癌中發(fā)揮致癌基因作用，其機制可能與BMI1能調節(jié)多種腫瘤信號通路有關。研究［28-29］報道，BMI1能增加磷酸化蛋白激酶B水平，促進子宮內膜癌細胞增殖、分化、遷移等行為，沉默BMI1表達能發(fā)揮相反作用，同時能提升子宮內膜癌細胞的化療敏感性，促進癌細胞凋亡。本研究還顯示，BMI1 mRNA 高表達者術后3 年累積生存率明顯降低，生存時間明顯縮短，提示BMI1 mRNA 高表達與子宮內膜癌患者預后不良相關；BMI1 mRNA 高表達是子宮內膜癌患者死亡的獨立風險因素，說明BMI1 mRNA亦可作為判斷預后的分子標志物。

本研究還發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌組織中miR-128-3p與Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表達呈負相關，Notch1 mRNA 與BMI1 mRNA 表達呈正相關，說明三者可能共同參與子宮內膜癌進展，考慮與miR-128-3p與Notch1、BMI1 的3′-非翻譯區(qū)存在互補結合位有關。顧曉荔等［30］的研究指出，miR-128-3p 能靶向抑制Notch1 表達抑制子宮內膜癌細胞增殖，促進細胞凋 亡。YANG 等［31］發(fā)現(xiàn)，miR-128-3p 能 靶 向抑 制BMI1 表達抑制視網膜母細胞瘤細胞活力、遷移、侵襲。同時研究［32］指出，BMI1 抑制劑能影響Notch 信號通路蛋白的表達和活性。但關于miR-128-3p 是否能靶向下調Notch1、BMI1 參與子宮內膜癌進展有待進一步細胞研究證實。

總之，子宮內膜癌組織中miR-128-3p 低表達，Notch1、BMI1 mRNA高表達，均與分化程度、FIGO分期、血管侵犯、淋巴結轉移有關，是子宮內膜癌患者死亡的獨立影響因素，可能成為子宮內膜癌患者預后評估生物標志物。