地黃飲子對(duì)腎虛血瘀證帕金森病α-synuclein表達(dá)的影響*

趙嘉琳 竇志芳 趙 瓊

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)又名震顫麻痹(Paralysis agitans),作為臨床常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,癥狀多見(jiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、靜止性震顫、姿勢(shì)平衡障礙等[1]。本病發(fā)病年齡多集中于60歲及以上[2]，中國(guó)65歲以上患病率約達(dá)1.7%，由于社會(huì)老齡化問(wèn)題日趨嚴(yán)重，患病率仍有提升[3]。臨床治療中PD多使用左旋多巴為主要成分的藥物制劑，但局限于對(duì)癥治療,且長(zhǎng)期使用該類藥物患者易產(chǎn)生不良作用[4]。地黃飲子臨床用以治療下元虛衰、陰陽(yáng)俱虛的喑痱證，組方藥物有熟地黃、山萸肉、肉蓯蓉等，具有腎陰陽(yáng)雙補(bǔ)的功效。國(guó)家名老中醫(yī)韓明向教授，在治療PD的臨床用藥中以地黃飲子方為基礎(chǔ)，以滋補(bǔ)肝腎作為主要治療方向，并辨證論治效如桴鼓[5]，伍愛(ài)國(guó)[6]在黃煌教授“方人”理論指導(dǎo)下，明確指出，臨床中地黃飲子用藥后可明顯改善精神情態(tài)，長(zhǎng)期堅(jiān)持可改善行走質(zhì)量。腎為先天之本，虛則氣滯，氣停則血瘀。多研究表明[7]PD不同證候均可伴有瘀血的存在。趙冠英和楊明會(huì)教授認(rèn)為，腎虛血瘀為PD的基本病機(jī)，補(bǔ)腎活血法臨床治療屢獲奇效[8]。已有實(shí)驗(yàn)證明，丹皮酚作為牡丹皮的活性成分，能夠?qū)D模型細(xì)胞損傷進(jìn)行保護(hù)[9]。因此，此研究以“腎腦相關(guān)”“腎虛血瘀”為理論指導(dǎo)，使用長(zhǎng)期低劑量腹腔注射D-半乳糖結(jié)合頸背部皮下注射魚藤酮溶液復(fù)合式方法制備PD病證結(jié)合模型，選用地黃飲子加活血化瘀藥牡丹皮進(jìn)行干預(yù)，研究地黃飲子加減方對(duì)PD大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn的影響，探討地黃飲子加減方對(duì)腎虛血瘀證PD大鼠治療中的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(230±20)g，6個(gè)月齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)：SCXF(京)2018-0003)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，自由飲食，自然光源，室溫(25±2)℃。為保證大鼠存活率，進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑D-半乳糖(北京索萊寶科技有限公司，D8310-100 g)，魚藤酮(羅恩，R006873)，DMSO(Solarbio,D8370-100 g)，α-synuclein 抗體(武漢三鷹，66412-1-Ig)，HPR標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(武漢賽維爾，G1216-3)，高脂飼料(特洛菲飼料科技有限公司)，地黃飲子加減方(熟地黃、巴戟天、山萸肉、石斛、肉蓯蓉、炮附片、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠(yuǎn)志、薄荷、牡丹皮)購(gòu)置于北京同仁堂，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)趙瓊副教授鑒定為正品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組將80只大鼠據(jù)Rand函數(shù)，隨機(jī)分為PDZC組、PDJB組、SXYY組、DHYZ組,每組20只。PDZC組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠喂養(yǎng)高脂飼料。

1.3.2 病癥結(jié)合PD大鼠模型建立PD模型構(gòu)建：除PDZC組大鼠，余下組行頸背部皮下注射魚藤酮法造PD模型[11]。每日早9：00，在PDJB、SXXY、DHYZ組大鼠頸背部皮下注射濃度為1.0 mg/(kg·d)的魚藤酮溶液(DMSO為溶劑：1.5 mg/ml)。前3周注射1/2正常水平的魚藤酮溶液，以降低大鼠病死率。3周后恢復(fù)正常水平注射。每周休息1 d。PDZC組用同樣方法注入等體積生理鹽水。腎虛血瘀證模型構(gòu)建：SXYY、DHYZ組大鼠連續(xù)腹腔注射D-gal溶液(D-gal粉末50 mg/(kg·d)溶于0.9%生理鹽水)6周。其余各組大鼠用同樣方法注入等體積生理鹽水。

1.3.3 藥物制備及給藥地黃飲子加減方：藥物浸泡后，反復(fù)2次煎煮濃縮成178%的混懸液，最終每劑藥濃縮成55.6 ml，每毫升含生藥1.78 g，經(jīng)高壓滅菌后放進(jìn)冰箱4 ℃冷藏備用。

給藥方法：在病證結(jié)合造模第3周予DHYZ組灌胃給藥，依據(jù)大鼠與人體的體表面積折算等效比率計(jì)量表，算出大鼠等效劑量為1 ml/100 g/d。其余各組大鼠用同樣方法注入等體積生理鹽水。每天給藥，每天1次，連續(xù)4周。

1.3.4 行為學(xué)測(cè)試一般行為學(xué)觀察：觀察各組大鼠外觀形態(tài)、行動(dòng)反應(yīng)能力等。依以下標(biāo)準(zhǔn)劃分等級(jí)類別[12]：1分：拘捕表現(xiàn)變?nèi)?、毛發(fā)臟黃可見(jiàn)、弓背抬高及自主活動(dòng)稍減少；2分：1分的基礎(chǔ)上，大鼠自主活動(dòng)弱化、行為緩慢且平衡力減弱；4分：2分基礎(chǔ)上，平衡力明顯變差，甚則無(wú)法直線行走，前進(jìn)時(shí)或有呈一側(cè)偏轉(zhuǎn)傾向；6分：4分基礎(chǔ)上，大鼠呈臥向單側(cè)姿態(tài)行步，癱軟、較少主動(dòng)前進(jìn)行為、進(jìn)食減少；8分：6分基礎(chǔ)上，大鼠體態(tài)臥向一側(cè)、無(wú)法行進(jìn)、進(jìn)食停止；10分：綜合以上，大鼠表現(xiàn)有癱瘓、體質(zhì)量降低明顯，生命體征弱或已死亡狀態(tài)。行為學(xué)評(píng)分3分及以上考慮為造模成功。

懸掛實(shí)驗(yàn)：根據(jù)KURIBARA實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，制作懸掛儀器[10]。用直徑為1.5 mm的鐵絲，水平固定于支架兩端。支架左右距離間隔15 cm，離地面高度為20 cm。懸掛絲下放置敷料墊，防止大鼠墜落造成傷害。觀察大鼠兩前肢穩(wěn)定抓握鐵絲，開(kāi)始計(jì)時(shí)記錄大鼠懸掛時(shí)間。懸掛8 s及以上雙足記5分，單足記4分；懸掛5 s及以上雙足記3分，單足記2分；懸掛不足1 s記0分。其余記1分。

1.3.5 待測(cè)樣品制備及測(cè)定大腦標(biāo)本采集:行為學(xué)檢測(cè)完畢。使用Rand函數(shù)，每組選擇5只大鼠行開(kāi)胸心臟灌注術(shù)，使用復(fù)合麻藥(水合氯醛、烏來(lái)糖5∶1的比例，溶于30 g生理鹽水)以4.5 ml/kg標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腹腔注射麻醉各組大鼠。觀察大鼠深度麻醉后，在大鼠左心室處插入注射針頭，剪開(kāi)右心耳注射灌注0.9%生理鹽水。行進(jìn)過(guò)程中觀察肝臟發(fā)白后，改換4%多聚甲醛液進(jìn)行固定灌注，直至觸摸大鼠頸部、尾部完全僵硬。灌注后迅速取出腦組織，在4%多聚甲醛液重固定1周以上，全部進(jìn)行石蠟切片處理。

黑質(zhì)紋狀體采集：大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，放置于冰上進(jìn)行黑質(zhì)、紋狀體組織分離術(shù)。剝離組織分裝于標(biāo)號(hào)凍存管后移至液氮罐內(nèi)，結(jié)束后一并放-80 ℃冰箱冷凍保存。

α-syn免疫組化檢測(cè)：將石蠟切片依次置于不同濃度二甲苯及乙醇溶液內(nèi)，蒸餾水洗至脫蠟。在盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中放入切片，高溫下條件下進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后置玻片于PBS試劑液體中洗滌3次，每次5 min。洗滌后在3%雙氧水溶液中，室溫避光孵育25 min，放置于PBS中洗滌3次，每次5 min。洗滌后的切片組化圈內(nèi)滴加3%BSA溶液，室溫下封閉30 min。滴加PBS及一抗，放入4 ℃孵育過(guò)夜。取出切片后使用PBS溶液洗滌3次，每次5 min。組化圈內(nèi)滴加相對(duì)種屬的HRP標(biāo)記物，室溫下孵育50 min。置于PBS溶液中洗滌3次，每次5 min。稍風(fēng)干后加DAB顯色液，顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陽(yáng)性為棕黃色。顯色結(jié)束后自來(lái)水沖洗切片。用蘇木素復(fù)染后自來(lái)水沖洗。等待切片自然干燥后，使用中性樹膠封片。每組內(nèi)使用Rand函數(shù)隨機(jī)選取5個(gè)組織，每組織每張切片拍出至少3個(gè)200 X照片，應(yīng)用IPP 6.0軟件進(jìn)行光密度分析，計(jì)算3張照片的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實(shí)驗(yàn)過(guò)程中PDZC、PDJB、SXYY組大鼠存活率為100%，DHYZ組因魚藤酮毒性致死2只，操作失誤致死2只。

觀察各組大鼠造模情況可得，PDZC組大鼠形態(tài)正常，毛色干凈潔白，且活動(dòng)反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)。PDJB組第7天左右進(jìn)食減緩，呈現(xiàn)弓背姿勢(shì)，毛色發(fā)黃變臟。SXXY組皮毛臟黃，重心降低，且捕捉抵抗力明顯變?nèi)?，自潔能力明顯變差。DHYZ組較SXXY組有所改善，具備基本自潔能力，且拘捕具有明顯抵抗，毛色趨于PDZC組。

2.2 體質(zhì)量變化相比較前3周各組大鼠造模過(guò)程體質(zhì)量變化。與PDZC組比較，PDJB、SXXY、DHYZ組體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯延緩，SXXY組與PDZC組比較體質(zhì)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DHYZ組相較SXXY組體質(zhì)量改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明地黃飲子加減方可顯著提高PD大鼠生存質(zhì)量。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較

2.3 行為學(xué)評(píng)分結(jié)果根據(jù)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，觀察記錄各組大鼠實(shí)驗(yàn)后行為學(xué)表現(xiàn)。與PDZC組比較，PDJB、SXXY、DHYZ組分?jǐn)?shù)差異明顯。SXXY組較PDZC組分?jǐn)?shù)增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DHYZ組較SXXY組分?jǐn)?shù)明顯降低，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明地黃飲子加減方可使PD大鼠異常行為得到修正，提升大鼠生活狀態(tài)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)評(píng)分結(jié)果比較(分，

2.4 懸掛實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果基于懸掛評(píng)分高低考察大鼠身體肌力及協(xié)調(diào)能力，高分代表大鼠四肢肌力及協(xié)調(diào)能力正常，低分反之。根據(jù)表3結(jié)果示，與PDZC組相比，PDJB、SXXY、DHYZ組懸掛實(shí)驗(yàn)得分低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DHYZ組相較SXXY組實(shí)驗(yàn)得分高，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)說(shuō)明SXXY組四肢肌力減退，協(xié)調(diào)能力差，DHYZ組肢體肌力有所恢復(fù)，協(xié)調(diào)能力良好。

表3 各組大鼠懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果比較 (分，

2.5 各組大鼠免疫組化結(jié)果以PDZC組實(shí)驗(yàn)大鼠為參考，SXXY組黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn平均光密度值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；以SXYY組實(shí)驗(yàn)大鼠作為參考，DHYZ組大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn平均光密度值降低差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明對(duì)比PDZC組，SXXY組大鼠黑質(zhì)及紋狀體中α-syn含量增多。DHYZ組對(duì)比SXXY組大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn含量有所控制，證明地黃飲子方加減可有效控制α-syn含量。

注：與PDZC組比較，**P<0.01;與SXXY組比較，##P<0.01。

4組大鼠中腦黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果如圖2、圖3所示，PDZC組內(nèi)大鼠黑質(zhì)紋狀體中胞體清晰完整，未見(jiàn)明顯棕褐色核團(tuán)(α-syn陽(yáng)性表達(dá))，PDJB組內(nèi)大鼠黑質(zhì)紋狀體中可見(jiàn)明顯棕褐色核團(tuán)群體，SXXU組內(nèi)大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)細(xì)胞明顯減少，且棕褐色核團(tuán)表達(dá)明顯。DHYZ組內(nèi)大鼠黑質(zhì)紋狀體體內(nèi)雖見(jiàn)細(xì)胞核明顯偏移，但細(xì)胞數(shù)量有所恢復(fù)，且棕褐色表達(dá)減弱，α-syn表達(dá)不明顯。

圖2 各組大鼠黑質(zhì)內(nèi)α-syn免疫組化比較

圖3 各組大鼠紋狀體內(nèi)α-syn免疫組化比較

3 討論

PD為老年病多發(fā)性疾病之一，中醫(yī)討論歸為“顫證” “顫震”“癡呆”“痙證”等范疇，認(rèn)為其病位為腦。中醫(yī)藏象腎腦系統(tǒng)理論認(rèn)為，腎藏精，精生髓，髓聚為腦，腦為髓海[11]。腦是主司感覺(jué)運(yùn)動(dòng)的器官，張錫純明確指出：“人之腦髓空者……甚或猝然昏厥，知覺(jué)運(yùn)動(dòng)俱廢”。腦髓空虛是運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)生的根本原因。腎精作為腦髓生化之源，異?？蓪?dǎo)致腦生理功能失常，在老年人多見(jiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、姿態(tài)不穩(wěn)等。生理上，腎作為先天之本，其物質(zhì)基礎(chǔ)及功能作用，隨人體的生、長(zhǎng)、壯、老自然消耗。腎中陰精化生和陽(yáng)氣溫煦作為各臟腑維持生理功能及精血津液的重要保證，一旦虧損則臟氣推動(dòng)無(wú)力，化氣無(wú)源，導(dǎo)致陰血虧少，機(jī)體臟腑失去濡養(yǎng)。氣機(jī)升降乖張，血液運(yùn)行受到影響，導(dǎo)致脈道阻塞形成血瘀。病理上，外感六淫、飲食勞倦、時(shí)行疫毒等均可直接或間接損及腎臟，從而導(dǎo)致氣不運(yùn)血，停積為血瘀。PD好發(fā)于高齡人群，中醫(yī)討論P(yáng)D病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，從生理與病理分析均可導(dǎo)致腎虛血瘀證的發(fā)生，其中腎虛為本，血瘀為標(biāo)[12]。腎虛血瘀證作為老年病患者的特征[13]，已被李軍艷等[14]證實(shí)為PD的基本病機(jī)。臨床上治療多使用地黃飲子組方進(jìn)行干預(yù)治療[15]。地黃飲子最早為唐代的補(bǔ)腎方，宋代以后逐漸作為治療中風(fēng)后腎虛專用方，《黃帝素問(wèn)宣明論方》記載：“內(nèi)奪而厥，舌喑不能言，二足廢不為用。腎脈虛弱，其氣厥不至，舌不仁”。此組方中藥物熟地黃、山萸肉以補(bǔ)腎陰，肉蓯蓉、巴戟天共壯腎陽(yáng)；附片、肉桂、石斛、麥冬、五味子有溫陽(yáng)固元，引火下行，滋肺腎的功效。前期研究發(fā)現(xiàn),地黃飲子方可以“腎”為靶點(diǎn)[16]。此實(shí)驗(yàn)在地黃飲子方的基礎(chǔ)上加用牡丹皮，補(bǔ)腎同時(shí)兼?zhèn)浠钛淖饔?。探討地黃飲子加減方對(duì)PD腎虛血瘀證的作用機(jī)制，以期為改善臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，達(dá)到對(duì)癥治療、早期干預(yù)的目的，具有十分重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明PD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多變，可能受異常蛋白聚集、氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎癥等影響。其診斷金標(biāo)準(zhǔn)為PD患者大腦黑質(zhì)、紋狀體神經(jīng)元胞體內(nèi)路易小體(Lewy bodies, LBs)的存在。而α-syn作為L(zhǎng)Bs的重要組成，雖還未明確其與PD的關(guān)系。但多學(xué)者表明，α-syn的異常聚集是PD發(fā)病的重點(diǎn)。α-syn通過(guò)病理反應(yīng)后形成的聚集體能夠引起多巴胺能神經(jīng)元死亡，進(jìn)一步導(dǎo)致PD產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)癥狀[17]。目前中醫(yī)藥對(duì)PD作用機(jī)制多圍繞氧化應(yīng)激展開(kāi)，對(duì)異常蛋白聚集較少涉及[18]。綜上所述，PD作為一類臨床發(fā)病率極高的老年性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是多種致病機(jī)制復(fù)雜交錯(cuò)最終導(dǎo)致α-syn聚集LBs的形成，而地黃飲子加減方能夠抑制黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷[12]，對(duì)α-syn含量是否有影響仍待探究。

研究使用頸背部皮下注射魚藤酮溶液方法制備PD大鼠模型，并于此基礎(chǔ)上復(fù)合制備腎虛血瘀證PD大鼠模型，實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)弓背向上、運(yùn)動(dòng)遲緩等PD行為學(xué)表現(xiàn)。PD腎虛血瘀證患者臨床表現(xiàn)不僅表現(xiàn)為步態(tài)失衡或震顫，常有多種行為學(xué)共存，如病患四肢肌張力升高，運(yùn)動(dòng)能力失常所導(dǎo)致的肌肉萎縮，肌肉功能下降，以及腎虛血瘀，久病致瘀，從而影響身體各臟器的正常運(yùn)轉(zhuǎn)所表現(xiàn)的體質(zhì)量減弱。故實(shí)驗(yàn)結(jié)合了多種行為學(xué)檢測(cè)方式以期達(dá)到對(duì)臨床PD模型的立體化呈現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)通過(guò)地黃飲子加減方干預(yù)后的大鼠體質(zhì)量明顯高于未治療前，與人類PD腎虛血瘀證治療后的體質(zhì)量表現(xiàn)相同。而行為學(xué)及懸掛實(shí)驗(yàn)大鼠評(píng)分DHYZ組均高于SXXY組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，此實(shí)驗(yàn)大鼠的免疫組化法結(jié)果顯示，SXXY組大鼠黑質(zhì)紋狀體中α-syn平均光密度升高，DHYZ組內(nèi)α-syn平均光密度降低，提示地黃飲子加減方能夠作用于α-syn，且可在鏡下觀察到其聚集體，但表達(dá)含量過(guò)低對(duì)于檢測(cè)黑質(zhì)紋狀體α-syn是否有特異性仍有待研究。實(shí)驗(yàn)將體質(zhì)量、多類行為學(xué)檢測(cè)法、黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn平均光密度值及免疫組化法結(jié)合，證實(shí)了地黃飲子加減方對(duì)PD腎虛血瘀證黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn的含量具有影響，且α-syn含量表達(dá)呈下降趨勢(shì)，為臨床進(jìn)一步研究PD腎虛血瘀證的特征神經(jīng)病理變化，改善治療方案，提升治療效果等提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但PD腎虛血瘀證致病涉及多種蛋白多種因素的共同參與，且病程漫長(zhǎng)易生他變。由此可見(jiàn)地黃飲子加減方可有效降低PD腎虛血瘀證大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-syn含量。但地黃飲子加減方可否能夠通過(guò)對(duì)其他蛋白或其他因素影響腎虛血瘀證PD大鼠尚未可知，仍有待進(jìn)一步研究。