急性心肌梗死患者血漿NETs水平與冠狀動脈病變嚴重程度的關系*

段宇清， 黃 輝， 范 傲， 王 忠，2△

石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1心內二科 2國家衛(wèi)健委中亞高發(fā)病防治重點實驗室，石河子 832000

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種常見的心血管急癥，其發(fā)病主要是由于動脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛形成血栓栓塞罪犯血管所致，其中炎癥反應在動脈粥樣硬化中發(fā)揮了重要的作用，而中性粒細胞作用最為廣泛，貫穿心肌梗死發(fā)生發(fā)展的全過程[1]。中性粒細胞胞外捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是近年發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞發(fā)揮功能的一種新的形式，它是由中性粒細胞受到刺激活化后釋放到胞外的一種網(wǎng)狀結構，主要由雙鏈DNA(dsDNA)和瓜氨酸組蛋白組成，此外，還結合有髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織因子等中性粒細胞的顆粒蛋白[2]。研究顯示，循環(huán)中的NETs相關成分可能通過激活血小板，觸發(fā)凝血級聯(lián)反應，從而導致內皮功能障礙和斑塊不穩(wěn)定，以及冠狀動脈血栓形成[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在嚴重冠狀動脈粥樣硬化患者中，血漿NETs相關結構，如dsDNA、核小體和MPO-DNA復合物大量存在[5]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，NETs的主要成分dsDNA水平與急性ST段抬高型心肌梗死(acute ST-segment elevated myocardial infarction，STEMI)患者心肌梗死的面積大小、心室重塑和院內不良心血管事件相關[6-7]，提示NETs可能參與了AMI的發(fā)生發(fā)展。但血漿中NETs及其相關結構與AMI患者冠脈病變嚴重程度的關系并不清楚。本研究旨在探討AMI患者血漿中NETs水平與冠脈病變嚴重程度的關系，為AMI患者危險分層提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2020年10月至2021年5月在石河子大學第一附屬醫(yī)院住院的AMI患者及同期健康體檢者各95例作為研究對象，血液標本及信息收集均獲得患者的知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會批準。AMI組納入標準：符合Fourth Universal Definition of Myocardial Infarction(2018)[8]的相關診斷標準，并在發(fā)病12 h內接受急診冠狀動脈支架植入術開通罪犯血管的患者。排除標準：伴腎功能不全、肝功能不全；伴類風濕性關節(jié)炎、潰瘍性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等系統(tǒng)性疾??；既往有瓣膜性心臟病、持續(xù)性心房纖顫等心血管疾?。徊煌饧安慌浜贤瓿杀狙芯空?。對照組為正常健康人群，依據(jù)隨機原則與AMI組在性別、年齡上進行匹配。AMI組又根據(jù)Gensini評分結果分為冠脈輕度狹窄組(≤36分)34例與重度狹窄組(>36分)61例。

1.2 材料與方法

收集臨床基線資料及白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、肌鈣蛋白T、D-二聚體、左心室射血分數(shù)等臨床指標。在冠脈造影前采外周靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中，以3000 r/min離心5 min，分離血漿，儲存在-80℃冰箱待用。使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿瓜氨酸組蛋白3(CitH3)水平，采用PicoGreen熒光染料定量分析血漿中dsDNA水平。CitH3 ELISA試劑盒購于美國Cayman Chemical公司，Quant-iTTMPicoGreen?reagent試劑盒購于美國Invitrogen公司。

冠脈病變分析方法采用標準Judkins法行選擇性冠脈造影，根據(jù)冠脈造影結果運用Gensini評分系統(tǒng)對病變進行量化。Gensini評分系統(tǒng)包括：①病變部位：左冠脈主干5分，左前降支及左回旋支近段2.5分，左前降支中段1.5分，左前降支遠段及左回旋支中段、遠段1分，右冠脈及后降支1分，第一對角支1分，第二對角支0.5分，其余小分支0.5分；②管腔狹窄程度：1%～為1分，26%～為2分，51%～為4分，76%～為8分，91%～為16分，完全閉塞為32分。根據(jù)每處病變積分計算出Gensini評分。冠脈病變血管定義為冠脈造影確認的主要冠狀動脈(左前降支、左回旋支、右冠狀動脈)且直徑狹窄超過50%以上。按照冠脈病變支數(shù)分為單支病變組、雙支病變組、三支病變組，若冠脈病變累及左主干則屬于雙支病變組(不管病變有無累及左前降支、左回旋支)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組患者基本資料比較

AMI組患者血漿CitH3、dsDNA水平均高于對照組(均P<0.05)。年齡、體質量指數(shù)、性別及吸煙、飲酒比例，兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 AMI組與對照組的基本資料比較Table 1 Comparison of basic information between AMI group and control group

2.2 AMI組患者Pearson相關性分析

經Pearson相關性分析表明Gensini評分與血漿中CitH3(r=0.590，P<0.01)、dsDNA(r=0.613，P<0.01)水平呈正相關；冠脈病變血管支數(shù)與血漿中CitH3(r=0.368，P<0.01)、dsDNA(r=0.257，P=0.012)水平呈正相關。

2.3 冠脈輕度狹窄組與重度狹窄組臨床資料比較

冠脈重度狹窄組血漿CitH3、dsDNA、白細胞計數(shù)、NT-proBNP、D-二聚體、MHR水平顯著高于冠脈輕度狹窄組；其余基線資料在兩組間差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 AMI組中冠脈輕度狹窄組與重度狹窄組臨床資料比較Table 2 Comparison of clinical data between mild coronary stenosis group and severe coronary stenosis group in the AMI group

2.4 不同病變血管支數(shù)患者血漿CitH3、dsDNA水平比較

與單支病變組比較，雙支病變組、三支病變組血漿CitH3、dsDNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；雙支病變與三支病變兩組間血漿CitH3、dsDNA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見圖1。

與單支病變組比較，*P<0.05圖1 AMI患者單支病變組、雙支病變組和三支病變組CitH3、dsDNA水平的比較Fig.1 Comparison of CitH3 and dsDNA levels in patients with AMI among single-vessel，double-vessel and three-vessel groups

2.5 Logistic分析

將可能影響AMI患者冠脈重度狹窄的變量進行Logistic單因素回歸分析，然后將單變量分析中有顯著性差異(P<0.05)的變量納入Logistic多因素回歸分析。結果顯示，血漿CitH3、dsDNA是冠脈重度狹窄的獨立危險因素，見表3。

表3 冠脈重度狹窄的多因素logistic回歸分析Table 3 Multivariate logistic regression analysis of severe coronary stenosis

2.6 ROC曲線

將AMI患者血漿CitH3、dsDNA水平和CitH3聯(lián)合dsDNA作為檢驗變量，將冠脈重度狹窄作為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，結果顯示，在識別重度冠狀動脈狹窄的AMI患者能力方面，CitH3聯(lián)合dsDNA優(yōu)于CitH3、dsDNA兩個指標，見圖2、表4。

圖2 預測冠脈重度狹窄ROC曲線Fig.2 ROC curve predicting severe coronary stenosis

表4 dsDNA、CitH3單獨及聯(lián)合預測冠脈重度狹窄的效能Table 4 Prediction efficacy of dsDNA and CitH3 alone or in combination for severe coronary stenosis

3 討論

動脈粥樣硬化是急性心肌梗死的基本病理基礎，與AMI患者的冠脈病變嚴重程度密切相關[9]。現(xiàn)有的證據(jù)表明，炎癥在整個動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關鍵作用[10]，活躍的炎癥過程可促使白細胞大量匯聚，分泌蛋白酶(基質金屬蛋白酶)，使斑塊的纖維帽逐漸變薄，易于破裂，最終導致血栓梗阻冠脈血管[11]。AMI是臨床常見的心血管急危重癥之一，具有起病迅速、癥狀危重、病情兇險、預后差等特點。因此，盡早對疾病的嚴重程度做出評估，可為臨床診療工作提供重要參考。

眾所周知，中性粒細胞屬于抵御入侵病原體的第一道防線，是非特異性免疫的重要組成部分，通過趨化、吞噬、脫顆粒作用，消除無菌炎癥。目前研究表明中性粒細胞參與了動脈粥樣硬化血栓的形成[12-13]，并在急性冠狀動脈事件中有一定的預測作用[14]。此外，在缺血/再灌注損傷(IRI)的動物模型中也描述了中性粒細胞和NETs[15]。NETs作為近年來發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞發(fā)揮功能的一種新的形式，具有強有力的促炎、促血栓形成、細胞毒作用，并可通過多種途徑促進動脈粥樣硬化的發(fā)展[16]。本研究檢測了AMI患者血漿中NETs主要成分CitH3、dsDNA的水平，結果顯示AMI組的CitH3、dsDNA水平明顯高于健康對照組，重度狹窄組血漿中CitH3、dsDNA水平明顯高于輕度狹窄組，且AMI患者血漿中NETs水平與Gensini評分呈正相關，Borissoff等[5]學者也發(fā)現(xiàn)血漿中與NETs的相關結構，如dsDNA、核小體和MPO-DNA復合物在嚴重冠狀動脈硬化或極鈣化的冠狀動脈患者中顯著升高，這與本研究的結果一致，提示NETs可能與AMI患者冠脈病變的嚴重程度相關。本研究發(fā)現(xiàn)AMI三支病變組與雙支病變組血漿NETs水平高于單支病變組，且血漿中NETs水平與冠脈病變血管支數(shù)呈正相關，提示NETs可能不僅參與了AMI罪犯血管病變的形成，還參與了非罪犯血管病變的形成。本研究中三支病變組與雙支病變組之間NETs水平無統(tǒng)計學差異，考慮可能是由于NETs在所有冠脈病變血管中均發(fā)揮作用，從而導致兩組血漿中NETs的總體水平無明顯差異，此外本研究樣本量較少，有待擴大樣本量進一步探討。

研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化的小鼠模型中，膽固醇晶體可觸發(fā)中性粒細胞釋放NETs，NETs引發(fā)巨噬細胞釋放細胞因子，進一步激活輔助性T細胞17(TH17)放大動脈粥樣硬化斑塊中免疫細胞的招募，引起慢性炎癥反應[17]。同樣，在危險相關分子模式(如氧化低密度脂蛋白)存在的情況下，血漿中膽固醇的積累可能會導致巨噬細胞炎癥小體激活，促進動脈中性粒細胞浸潤和NETs的釋放，從而加速硬化性病變的形成[18]，以上結果提示NETs可能參與了早期動脈粥樣硬化的發(fā)生及斑塊活動中的炎癥反應。Silvestre-Roig等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊部位，活化的血管平滑肌細胞可誘發(fā)NETs的形成，導致斑塊不穩(wěn)定性增加，NETs的相關成分組蛋白可引起血管平滑肌細胞的極化，破壞細胞膜結構，具有強烈的細胞毒性作用，進一步加劇斑塊的不穩(wěn)定性。Stakos等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在STEMI過程中，血小板與斑塊破裂部位的中性粒細胞相互作用后，NETs被識別為表達功能性組織因子，并誘導血小板活化和進一步的凝血酶生成，從而增加NETs促進血栓生成的潛能。NETs通過為血小板，紅細胞，細胞外囊泡和促凝血分子提供支架來促進血管閉塞，該支架提供了血栓形成的結構基礎[16]。Langseth等[21]研究表明，STEMI患者血清中dsDNA、MPO-DNA和CitH3水平與白細胞計數(shù)均呈正相關，且血清中dsDNA水平與D-二聚體呈正相關，本研究也發(fā)現(xiàn)在重度狹窄組中白細胞計數(shù)和D-二聚體水平明顯升高，以上結果提示NETs可能參與了動脈粥樣硬化過程中的急慢性炎癥反應，最終導致不穩(wěn)定斑塊的糜爛和破裂，進而導致血栓的形成和AMI的發(fā)生，其有望成為評估AMI患者冠脈病變嚴重程度的有效指標。

為了進一步明確血漿中NETs與AMI患者冠脈病變嚴重程度的關系，本研究中將可能影響AMI患者冠脈重度狹窄的變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，血漿CitH3、dsDNA是冠脈重度狹窄的獨立危險因素；除此之外，ROC曲線結果也顯示，血漿CitH3、dsDNA對AMI冠脈重度狹窄的患者有一定的預測價值，且CitH3聯(lián)合dsDNA對重度冠脈狹窄的預測能力明顯優(yōu)于CitH3、dsDNA兩個指標，其敏感度和特異度分別為88.5%和70.6%，預測效能較高。

綜上所述，AMI患者血漿CitH3、dsDNA水平過表達可能提示冠脈重度狹窄，病情較嚴重，早期可考慮通過檢測AMI患者血漿CitH3、dsDNA水平，并結合其他冠脈病變評估指標預測患者冠脈病變程度，為AMI患者危險分層及臨床診療工作提供重要參考。