柚子幼果精油的提取及其抗氧化活性研究

莊姍姍，劉袆帆,2，張沁銘，肖更生，戴宏杰，馬路凱,4

1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院/廣東省嶺南特色食品科學與技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510225；2.廣東省梅州市梅縣區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，廣東 梅州 514783；3.西南大學 食品科學學院，重慶 400715；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225

0 引言

我國南方柚子種植歷史悠久、技術(shù)成熟、面積廣泛，其中廣東省梅州市的沙田柚更是味道鮮甜、脆嫩爽口、品質(zhì)優(yōu)良。柚子幼果泛指未成熟的柚子，包括生理落果和人工疏果，通常因未發(fā)育完全、直徑較小、果皮青綠、無法食用而被丟棄。柚子幼果大部分為果皮，揮發(fā)性精油含量豐富，主要成分為單萜類化合物和檸檬烯[1]。當生物體體內(nèi)產(chǎn)生過量自由基，其誘導生成的有害物質(zhì)會對細胞造成嚴重損傷[2]。而大量文獻[3-7]研究表明，植物精油具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗高血壓等藥理特性，其中抗氧化活性效果顯著，可以從源頭抑制生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，或直接清除已存在的自由基[8]。目前，關(guān)于柚子幼果的研究多集中于化學成分分析和提取工藝，柚子幼果精油作為柚子幼果中活性組分之一，受到的關(guān)注仍較少[9-12]。

成熟的紅細胞結(jié)構(gòu)簡單，無細胞核或細胞器，無復雜的代謝路徑，可產(chǎn)生輔酶因子以抵抗氧化應激[13]。同時，紅細胞模型較接近有機體的真實狀態(tài)，適用于抗氧化能力的研究，尤其是進行細胞抗氧化酶體系的研究評價[14]。亞臨界流體萃取是一種新興技術(shù)，與傳統(tǒng)的超臨界流體萃取相比，其可以在更低的溫度和壓力下進行物質(zhì)萃取，且能耗更低，有助于降低生產(chǎn)成本[15]?；诖?，本研究以柚子幼果為原料，擬采用亞臨界流體萃取技術(shù)萃取其精油，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對精油成分進行測定分析，應用AAPH(偶氮二異丁脒鹽酸鹽，水溶性自由基引發(fā)劑)誘導紅細胞氧化應激模型評價柚子幼果精油的抗氧化活性，初步探究柚子幼果精油的抗氧化能力和機理，為柚子幼果的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為柚子幼果精油在食品保鮮等領域的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沙田柚幼果，采自廣東省梅州市。

1.2 主要試劑

石油醚、無水乙醇，廣州市一馬試劑儀器有限公司產(chǎn)；AAPH，上海瑞永生物科技有限公司產(chǎn)。以上試劑均為分析純。磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液，pH值為7.2)，北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；非酶抗氧化劑(GSH)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)。

1.3 主要儀器與設備

CBE-10 L型亞臨界萃取實驗室成套設備，河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；RV10型德國IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，武漢集思儀器設備有限公司產(chǎn)；FD-1C-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司產(chǎn)；TGL16E型低速離心機，廣州芯康醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)；6980 N/5975B型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國 Agilent 公司產(chǎn)；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)；SH-1000型酶標儀，山東博科科學儀器有限公司產(chǎn)；YB-700A型高速多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司產(chǎn)。

1.4 實驗方法

1.4.1 原料預處理將柚子幼果大致切成邊長1～2 cm的正方塊，冷凍干燥后，置于高速多功能粉碎機中粉碎數(shù)分鐘，過60目篩，得到柚子幼果粉，分袋裝好并密封，置于干燥避光處保存，備用。

1.4.2 柚子幼果精油的亞臨界流體萃取取800 g柚子幼果粉，用干凈紗布袋裝好，放入亞臨界萃取實驗室成套設備的萃取釜中，以丁烷為萃取劑、石油醚為夾帶劑，于50 ℃萃取45 min，得到精油粗產(chǎn)品；對精油粗產(chǎn)品繼續(xù)進行50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入5 mL無水乙醇進行溶解，置于-20 ℃冰箱中冷凍，低溫過濾后真空濃縮，于3000 r/min 條件下離心20 min，過濾得到黃色澄清液體，即為柚子幼果精油[16]。

1.4.3 柚子幼果精油化學成分測定GC條件：色譜柱為Agilent HP-5 MSUI(30 m×250 μm×0.25 μm);進樣體積為1 μL;進樣口溫度為280 ℃;載氣為He，不分流，流速為1.3 mL/min；起始溫度為60 ℃，以10 ℃/min升溫至300 ℃。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源，離子源為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)譜接口溫度為250 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，質(zhì)量掃描范圍 (m/z)為30～500 amu[17]。

1.4.4 柚子幼果精油抗氧化活性研究1)紅細胞溶血率的測定。取適量柚子精油，用 PBS 緩沖液充分溶解后，在 420 nm 波長處測定該溶液黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，最終配制成質(zhì)量濃度為 0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL 的待測液。將預處理后體積分數(shù)為6%的紅細胞懸液裝于 0.2～5.0 mL 離心管中，加入配制好的待測液，充分混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光緩慢振蕩孵育30 min；加入AAPH溶液(200 mmol/L)充分混勻，在相同條件下繼續(xù)孵育2.5 h。每個處理組均設 3 個平行[18]。孵育結(jié)束后，將反應液于4 ℃、3000 r/min條件下離心10 min，取0.2 mL上清液置于96 孔板中，使用酶標儀于540 nm波長處測吸光值A。取相同體積分數(shù)的紅細胞懸液，加入等體積的水后進行裂解，同樣于540 nm波長處測吸光值B。以未經(jīng)AAPH 溶液處理且未添加柚子幼果精油的紅細胞懸液為空白對照組，以經(jīng)AAPH 溶液處理且未添加柚子幼果精油的紅細胞懸液為陽性對照組。溶血率按照以下公式計算：

溶血率=A/B×100%

2)抗氧化活性研究。取適量預處理后的紅細胞，加入 PBS 緩沖液洗滌2～3次，加入約4倍體積超純水裂解細胞，冰浴后于3000 r/min，4 ℃條件下離心5 min；離心完畢后，取上清液保存于-40 ℃冰箱中，備用。按上述1)的方法配置質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL 的待測液。GSH-Px、LDH、CAT的測定按照試劑盒的提示進行。以上實驗均重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性分析(P<0.05)，結(jié)果表示為(平均值±標準差)，用 Origin 2019對分析數(shù)據(jù)作圖，紅細胞溶血保護作用機理圖由AI制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚子幼果精油成分分析

GC-MS總離子流譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，峰段主要集中出現(xiàn)在13～33 min階段，從峰段中共檢測出300種化學成分，并確定了其中126種化學成分。這126種有效化學成分主要包括7類化合物，分別為醇類、萜烯類、酮類、酯類、醛類、酚類和烷烴類。醇類為主要化合物，共11種，相對含量為16.43%，其中植物甾醇相對含量為4.09%。萜烯類共10種，相對含量為5.37%，γ-松油烯、角鯊烯、3-蒈烯是其主要成分，其中γ-松油烯相對含量最高，為4.14%。酮類共10種，相對含量為3.71%。酯類共19種，相對含量僅為2.73%，其中，2-棕櫚酰甘油是其主要成分，相對含量超過1%。醛類共3種，相對含量為0.19%。酚類共43種，相對含量為0.19%。烷烴類共11種，相對含量為4.64%。

圖1 GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of GC-MS

2.2 柚子幼果精油抗氧化活性分析

2.2.1 對紅細胞溶血的保護作用柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞溶血率的影響如圖2所示，其中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；+表示添加AAPH溶液，-表示未添加，下同。由圖2可以看出，與空白對照組相比，經(jīng)AAPH處理后的陽性對照組，紅細胞的溶血率顯著增加，達(52.79±0.80)%，這說明AAPH能夠引起紅細胞溶血。加入不同質(zhì)量濃度的柚子幼果精油后，紅細胞的溶血率呈緩慢降低趨勢，其中柚子幼果精油的質(zhì)量濃度越高，紅細胞的溶血率越低，這說明柚子幼果精油對損傷的紅細胞具有保護作用。已有研究[19]證明，柚子幼果中含有大量的黃酮類等能夠清除自由基的活性物質(zhì)，可抑制由AAPH誘導的紅細胞溶血。

圖2 柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞溶血率的影響Fig.2 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on hemolysis rate in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.2 對脂質(zhì)過氧化的抑制作用在生物體內(nèi)，當自由基對細胞進行攻擊時，細胞膜上會產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應，而MDA作為該脅迫反應過程中的一種生物標志物，濃度會升高，導致細胞結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞[20]。柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)MDA濃度的影響如圖3所示。由圖3可以看出，當紅細胞遭到AAPH脅迫時，產(chǎn)生的大量MDA會對紅細胞造成損傷?？瞻讓φ战M產(chǎn)生的MDA濃度為(28.35±3.60) nmol/mL。未添加柚子幼果精油并直接受到AAPH攻擊的陽性對照組的MDA濃度為(53.37±7.91) nmol/mL。經(jīng)不同質(zhì)量濃度的柚子幼果精油預處理后的紅細胞，MDA濃度變化與陽性對照組有較大差異，其中精油質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，MDA產(chǎn)生的濃度最低，這說明該質(zhì)量濃度下的柚子幼果精油對AAPH誘導產(chǎn)生的MDA有較強的抑制作用。

圖3 柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)MDA濃度的影響Fig.3 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on MDA content in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.3 對細胞膜的保護作用柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)LDH釋放量的影響如圖4所示。由圖4可以看出，空白對照組的紅細胞內(nèi)LDH釋放量最低，為(144.96±3.27) U/L。陽性對照組的紅細胞內(nèi)LDH釋放量顯著增加，達(470.85±3.18) U/L，這可能是因為AAPH攻擊紅細胞時產(chǎn)生的大量活性氧會破壞紅細胞的細胞膜，從而導致細胞內(nèi)的LDH酶被釋放[21]。而經(jīng)不同質(zhì)量濃度的柚子幼果精油處理后，隨著柚子幼果精油質(zhì)量濃度的增加，LDH釋放量顯著降低，這說明，一定質(zhì)量濃度的柚子幼果精油能夠保護細胞膜免受氧化損傷，從而抑制LDH向細胞外釋放。

圖4 柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)LDH釋放量的影響Fig.4 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on LDHrelease content in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.4 對非酶促抗氧化的影響GSH是細胞內(nèi)一種具有較強抗氧化作用的非酶抗氧化劑。柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)GSH濃度的影響如圖5所示。由圖5可以看出，經(jīng)AAPH處理后的陽性對照組，紅細胞內(nèi)GSH濃度最低，這說明AAPH處理細胞后能引起細胞的氧化損傷[22]。而經(jīng)柚子幼果精油處理后，紅細胞內(nèi)GSH濃度呈上升的趨勢，這說明柚子幼果精油處理能顯著提高細胞的抗氧化活性，從而起到清除自由基的作用。

圖5 柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)GSH濃度的影響Fig.5 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on GSH content in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.5 對酶促抗氧化體系的影響紅細胞內(nèi)的抗氧化酶體系主要包括SOD、GSH-Px和CAT。SOD 通過歧化作用，可催化高氧化活性超氧化物的陰離子轉(zhuǎn)化為低氧化性的氧和H2O2，從而起到清除自由基的作用[23]，而CAT和GSH-Px可將H2O2轉(zhuǎn)化為O2和H2O[24]。柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)SOD、GSH-Px和CAT活性的影響如圖6所示。由圖6可以看出，空白對照組的抗氧化酶體系的活性最低。而經(jīng)AAPH處理的陽性對照組的抗氧化酶體系活性最高，這可能是因為紅細胞在受AAPH刺激后，激發(fā)了細胞內(nèi)的防御體系保護細胞。經(jīng)柚子幼果精油處理后，抗氧化酶體系的活性顯著降低，并對精油質(zhì)量濃度形成劑量依賴性。因此，柚子幼果精油可能是通過直接抑制由AAPH誘導的MDA形成以減少對細胞膜的損傷作用，同時調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗氧化酶的活性，從而起到抗氧化的作用。

圖6 柚子幼果精油對AAPH處理后紅細胞內(nèi)SOD、GSH-Px和CAT活性的影響Fig.6 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on activity of SOD, GSH-Px and CAT in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.6 柚子幼果精油抑制紅細胞溶血機理的推測柚子幼果精油抑制 AAPH誘導紅細胞溶血的機理如圖7所示。由圖7a)可以看出，當自由基引發(fā)劑AAPH刺激紅細胞時，O2-、H2O2等活性自由基(ROS)含量會增加，ROS物質(zhì)含量過多會破壞蛋白質(zhì)導致細胞凋亡；同時，細胞膜上的不飽和脂肪酸遇到ROS會發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生大量 MDA，破壞磷脂雙分子層，從而引起細胞損傷，胞內(nèi)LDH被釋放，最終造成紅細胞溶血。紅細胞內(nèi)存在的酶促抗氧化防御體系啟動，一方面，SOD會催化O2-發(fā)生歧化反應生成較為安全的H2O2，或者CAT將細胞內(nèi)所含的H2O2和SOD催化產(chǎn)生的H2O2一同轉(zhuǎn)化為H2O；另一方面，GSH-Px與GSH通過相互作用生成H2O。而此時，紅細胞內(nèi)的非酶促防御體系也會發(fā)生協(xié)調(diào)作用，當細胞發(fā)生氧化應激時，GHS(谷胱甘肽)發(fā)生氧化反應，生成GSSH(氧化型谷胱甘肽)，過多的GSSH會在還原酶的作用下還原成GSH。降低GSH與GSSH的轉(zhuǎn)化效率有助于抑制脂質(zhì)過氧化反應[24-27]。酶促抗氧化和非酶促防御體系以多種途徑協(xié)調(diào)作用，不斷清除或抑制對機體有害的自由基，維持動態(tài)平衡，讓紅細胞可以進行正常的生命活動。

圖7 柚子幼果精油抑制AAPH引起氧化損傷的胞內(nèi)抗氧化機理Fig.7 Intracellular antioxidant mechanism of grapefruit fruitlet essential oil inhibiting oxidative damage caused by AAPH

若自由基長時間對紅細胞發(fā)起攻擊，紅細胞內(nèi)的防御體系將無法清除過多的自由基，從而破損凋亡。如圖7b)所示，加入柚子幼果精油后，紅細胞的溶血率有效降低，MDA濃度和LDH釋放量在紅細胞外顯著減少，說明細胞膜得到了保護，紅細胞的完整性得以維持，這也是抑制紅細胞溶血的直接原因。在前期GC-MS檢測的有效化學成分中，生育酚、菜油甾醇、維生素E、植物甾醇等[28]都具有抗氧化功效，同時柚子幼果中含有大量黃酮類活性物質(zhì)[15]，筆者推測柚子幼果精油中的這些物質(zhì)共同作用清除了自由基，避免了自由基造成的氧化損傷，維持了酶促抗氧化和非酶促防御體系之間的平衡，抑制了AAPH刺激引發(fā)的紅細胞溶血。

3 結(jié)論

本文以柚子幼果為原料，采用亞臨界流體萃取技術(shù)提取了柚子幼果精油，利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對該精油的化學成分進行分析發(fā)現(xiàn)，柚子幼果精油共鑒定出126種有效成分，包括醇類、萜烯類、酮類、酯類、醛類、酚類和烷烴類7類化合物，主要以醇類化合物為主，其相對含量為16.43%，萜烯類相對含量為5.37%，酮類相對含量為3.71%。通過AAPH誘導紅細胞氧化應激模型對柚子幼果精油的抗氧化活性進行了研究，結(jié)果表明，柚子幼果精油具有抗氧化活性，其抑制紅細胞溶血的機理可能是AAPH誘導形成MDA，從而減少對紅細胞細胞膜的損傷，同時調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酶促抗氧化和非酶促防御體系之間的平衡，實現(xiàn)抗氧化的作用。本研究可為柚子幼果資源的深度開發(fā)利用提供參考，也可為柚子幼果精油在市場中的實際應用提供研究基礎。