miR-133a-3p靶向BMP9調(diào)控人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化和凋亡的研究

郭瑩葉 高建華 郭永梅 陳劍英

成骨細(xì)胞通過分泌骨基質(zhì)蛋白在骨形成過程中發(fā)揮重要作用［1］。近年來，人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human orofacial bone marrow mesenchyml stem cells，hOBMSCs）的成骨分化調(diào)控機制已被研究，并可能在干細(xì)胞治療由創(chuàng)傷、腫瘤切除和先天性畸形等引起的大面積骨缺損的臨床應(yīng)用中具有重要潛力［2－3］。微小RNA（microRNA，miRNAs）是一種短鏈的、進化保守的非編碼RNA，其通過調(diào)節(jié)靶基因表達參與多種生物學(xué)過程調(diào)控，如細(xì)胞分化、增殖和凋亡等［4］。近年研究表明多種miRNAs在BMSCs成骨分化中發(fā)揮重要作用。有研究指出miR-133a-3p可抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥BMSCs成骨分化［5］。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）是miR-133a-3p的潛在靶基因。BMP9是最具成骨能力的BMPs之一，可誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化［6］。本研究擬通過揭示 miR-133a-3p靶向調(diào)控BMP9在hOBMSCs增殖、成骨分化和凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胚腎細(xì)胞HEK-293（上海酶研生物科技有限公司）；低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；本研究所用miRNA抑制物、抑制物陰性對照、小干擾RNA、小干擾RNA陰性對照、miRNA模擬物、模擬物陰性對照、熒光素酶報告基因載體（上海生工生物公司有限公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green Fast qPCR Mix（北京天根生化科技有限公司）；兔源細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）抗體、兔源裂解的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）抗體、兔源Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）抗體、鼠源骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）抗體、兔源骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體以及山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗、兔源BMP9抗體（Abcam公司，美國）；二甲基亞砜、膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素／碘化丙啶（Annexin V-FITC／PI）試劑盒、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（上海碧云天生物科技公司）；兔源 p-Smad1／5／8及兔源 Smad1／5／8抗體（Santa Cruz公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hOBMSCs細(xì)胞分離、培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo) 本研究經(jīng)骨碎片提供者知情同意且獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。hOBMSCs由無遺傳及系統(tǒng)性疾病的下頜畸形患者接受正頜手術(shù)獲得的骨碎片分離培養(yǎng)獲得。原代細(xì)胞融合度為80%時，進行消化傳代，取處于對數(shù)生長期的第5代細(xì)胞進行研究［2］。將hOBMSCs接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合約90%，更換成骨誘導(dǎo)液，每隔1 d換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d。

1.2.2 實驗分組和處理 實驗分組如下：正常培養(yǎng)組（正常培養(yǎng)的 hOBMSCs）、成骨誘導(dǎo)液組（按照 1.2.1方法進行成骨誘導(dǎo)）、anti-miR-con組（轉(zhuǎn)染anti-miR-con后進行成骨誘導(dǎo)）、anti-miR-133a-3p組（轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p后進行成骨誘導(dǎo)）、anti-miR-133a-3p＋si-con組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-con后進行成骨誘導(dǎo)）、anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9后進行成骨誘導(dǎo)）。

1.2.3 RT-qPCR檢測成骨分化過程中miR-133a-3p和BMP9 mRNA的表達 收集成骨誘導(dǎo)7 d的hOBMSCs，采用Trizol法提取hOBMSCs總RNA，以紫外分光光度計測定總RNA的純度。按cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green Fast qPCR Mix說明書進行cDNA合成和熒光定量PCR擴增。引物序列如下：miR-133a-3p上游 5′-TTAAACCATTAAGCGCAGGA-3′，下游 5′-TTAAATCCTTAAGTCATCCATACA-3′；U6 上 游 5′-ACACTCCAGCTGGGTCAAAATCGTGAAGCG-3′，下 游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′；BMP9上游 5′-GCTGCAGAACTGGGAACA-3′，下 游 5′-AACAAGCATCCCCTGGGG-3′；β-actin 上 游 5′-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下 游 5′-CGATGCCGTGCTCGATGGGG-3′。分別以 U6和 β-actin為內(nèi)源性參照，按照 2－ΔΔCt法計算 miR-133a-3p和 BMP9 mRNA的相對表達量。按照上述方式檢測miR-133a-3p和BMP9表達對Runx2 mRNA、OCN mRNA和OPN mRNA表達的影響。Runx2上游 5′-CGGGTCTCCTTCCAGGAT-3′，下 游 5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′；OCN上 游 5′-GGTGGTGAATAGACTCCGGC-3′，下 游5′-AGCTCGTCACAATTGGGGTT-3′；OPN上游 5′-GCTATCACCTCGGCCGTTGGGG-3′，下 游 5′-CATTGCCTCCTCCCTCCCGGTG-3′。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-133a-3p對BMP9的靶向作用 TargetScan在線分析顯示BMP9是miR-133a-3p下游潛在性功能靶基因之一。為驗證miR-133a-3p1對BMP9的靶向調(diào)控作用，將含有miR-133a-3p結(jié)合位點的野生型（WT-BMP9）以及含有miR-133a-3p結(jié)合位點突變序列的突變型（MUTBMP9）熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC、miR-133a-3p mimics分別共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，48 h后，嚴(yán)格按熒光素酶活性檢測試劑盒的規(guī)定測定各組的熒光素酶活性。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力 將 hOBMSCs（2×103cells／孔）接種于96孔板，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000按照上述分組進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h時進行成骨誘導(dǎo)。分別于成骨誘導(dǎo)后0、1、3、5、7 d，MTT法測定各孔的吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測成骨分化標(biāo)志蛋白和Smad通路蛋白的表達 將 hOBMSCs（1×105cells／孔）接種于6孔板，按照實驗分組進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h時進行成骨誘導(dǎo)。于成骨誘導(dǎo)后7 d時，收集細(xì)胞檢測成骨分化標(biāo)志蛋白和Smad通路蛋白的表達量：分別用RIPA裂解液及BCA法提取和測定細(xì)胞蛋白濃度。制膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉、一、二抗孵育、顯色、采集圖像，檢測目標(biāo)蛋白的相對表達，β-actin為內(nèi)參。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將hOBMSCs（1×105cells／孔）接種于6孔板，按照實驗分組進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h時進行成骨誘導(dǎo)。胰酶消化后，PBS洗滌2次，離心后，收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)。取105個細(xì)胞，加入195μL的Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5μL的PI輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，立即上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，所有實驗均設(shè)置3個平行實驗且重復(fù)3次，實驗的計量數(shù)據(jù)，如hOBMSCs中 miR-133a-3p、BMP9 mRNA和 BMP9蛋白表達，均采用±s表示。兩組間比較采用T檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩均數(shù)比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hOBMSCs成骨分化過程中 miR-133a-3p和BMP9的表達

RT-qPCR和Western blot檢測hOBMSCs成骨分化過程中miR-133a-3p和BMP9的表達，結(jié)果見表 1和圖1，與正常培養(yǎng)組比，成骨誘導(dǎo)液組hOBMSCs中miR-133a-3p的表達顯著降低，BMP9 mRNA和BMP9蛋白的表達升高（P＜0.05）。

表1 成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后hOBMSCs中miR-133a-3p、BMP9 mRNA和BMP9蛋白表達（±s，n＝9）Tab 1 The expression of miR-133a-3p，BMP9 mRNA and BMP9 protein in osteogenic induction induced hOBMSCs（±s，n＝9）

表1 成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后hOBMSCs中miR-133a-3p、BMP9 mRNA和BMP9蛋白表達（±s，n＝9）Tab 1 The expression of miR-133a-3p，BMP9 mRNA and BMP9 protein in osteogenic induction induced hOBMSCs（±s，n＝9）

注：與正常培養(yǎng)組比較，① P＜0.05

分 組 miR-133a-3p BMP9 mRNA BMP9蛋白正常培養(yǎng)組 1.02±0.05 0.97±0.08 0.32±0.05成骨誘導(dǎo)液組 0.68±0.04① 3.47±0.21① 0.66±0.07①t值 15.930 33.375 11.857 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 Western blot檢測hOBMSCs中BMP9蛋白表達Fig 1 BMP9 protein expression in hOBMSCs detected by Western blot

2.2 miR-133a-3p靶向BMP9表達

采用targetscan預(yù)測miR-133a-3p下游靶基因發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p與BMP9的3＇-UTR區(qū)域存在部分連續(xù)結(jié)合位點（圖2A）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示（表2），在HEK-293細(xì)胞中，與 miR-con組比，miR-133a-3p組可顯著降低WT-BMP9的熒光素酶活性（P＜0.05）；而miR-133a-3p組與miR-NC組比MUT-BMP9熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）；與 anti-miR-con組比，antimiR-133a-3p組可顯著升高WT-BMP9的熒光素酶活性（P＜0.05）；而 anti-miR-133a-3p組與 anti-miR-con組比MUT-BMP94熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）。Western blot和RT-qPCR檢測顯示，與miR-con組比，miR-133a-3p組HEK-293細(xì)胞BMP9 mRNA和蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）；與 anti-miR-con組比，antimiR-133a-3p組HEK-293細(xì)胞BMP9 mRNA和蛋白的表達顯著升高（P＜0.05）（表 2和圖 2B）。

圖2 Western blot檢測HEK-293細(xì)胞中BMP9蛋白表達Fig 2 BMP9 protein expression in HEK-293 cells detected by Western blot

表2 miR-133a-3p對BMP9蛋白表達的調(diào)控作用（雙熒光素酶報告實驗）（±s，n＝9）Tab 2 The regulation of miR-133a-3p on BMP9 protein expression（Dual luciferase report assay）（±s，n＝9）

表2 miR-133a-3p對BMP9蛋白表達的調(diào)控作用（雙熒光素酶報告實驗）（±s，n＝9）Tab 2 The regulation of miR-133a-3p on BMP9 protein expression（Dual luciferase report assay）（±s，n＝9）

注：①與miR-con組比較，P＜0.05；②與anti-miR-con組比較，P＜0.05

分組 WT-BMP9 MUT-BMP9 BMP9 mRNA BMP9蛋白miR-con 0.96±0.09 1.25±0.09 1.00±0.10 0.42±0.05 miR-133a-3p 0.61±0.07① 1.22±0.13 0.45±0.04 0.21±0.03①anti-miR-con 1.08±0.12 1.21±0.09 1.02±0.09 0.35±0.04 anti-miR-133a-3p 1.63±0.14② 1.24±0.11 1.59±0.13 0.68±0.07②F值 137.209 0.265 213.148 141.212 P值 0.000 0.850 0.000 0.000

2.3 沉默 BMP9部分逆轉(zhuǎn)干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs的增殖促進作用

采用MTT實驗檢測hOBMSCs增殖，結(jié)果見圖 3和表 3，與 anti-miR-con組比，誘導(dǎo)第 3、5、7天時hOBMSCs增殖活力顯著增加（P＜0.05），誘導(dǎo)第 7天時CyclinD1蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）；與 antimiR-133a-3p＋si-con組比較，誘導(dǎo)第 3、5、7天時hOBMSCs增殖活力顯著降低（P＜0.05），誘導(dǎo)第 7天時CyclinD1蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。

表3 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs增殖的影響（±s，n＝9）Tab 3 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the proliferation of hOBMSCs（±s，n＝9）

表3 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs增殖的影響（±s，n＝9）Tab 3 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the proliferation of hOBMSCs（±s，n＝9）

注：① 與anti-miR-con組比較，P＜0.05；② 與anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，P＜0.05

分 組CyclinD1 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d 7 d A490 anti-miR-con 0.27±0.02 0.31±0.03 0.39±0.03 0.57±0.04 0.74±0.05 0.59±0.05 anti-miR-133a-3p 0.26±0.03 0.33±0.02 0.58±0.04① 0.82±0.05① 1.14±0.07① 0.92±0.09 anti-miR-133a-3p＋si-con 0.28±0.02 0.34±0.03 0.54±0.04 0.79±0.05 1.08±0.07 0.94±0.08 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 0.29±0.03 0.32±0.04 0.45±0.03② 0.69±0.03② 0.82±0.06② 0.64±0.06 F值 2.308 1.579 53.580 99.640 85.962 58.646 P值 0.095 0.214 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 Western blot檢測CyclinD1蛋白表達Fig 3 CyclinD1 protein expression detected by Western blot

2.4 沉默 BMP9部分逆轉(zhuǎn)干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs的促分化作用

Western blot檢測hOBMSCs分化相關(guān)蛋白表達，結(jié)果見表 4和圖 4，與 anti-miR-con組比，anti-miR-133a-3p組 hOBMSCs中 BMP9、Runx2、OCN以及 OPN在mRNA和蛋白水平的表達均顯著升高（P＜0.05）；與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比，anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組hOBMSCs中BMP9、Runx2、OCN以及OPN在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低（P＜0.05）。

表4 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中BMP9、Runx2、OCN和OPN蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 4 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of BMP9，Runx2，OCN and OPN protein in hOBMSCs（±s，n＝9）

表4 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中BMP9、Runx2、OCN和OPN蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 4 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of BMP9，Runx2，OCN and OPN protein in hOBMSCs（±s，n＝9）

注：① 與anti-miR-con組比較，P＜0.05；② 與anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，P＜0.05

分 組 BMP9 mRNA Runx2 mRNA OCN mRNA OPNmRNA BMP9蛋白 Runx2蛋白 OCN蛋白 OPN蛋白anti-miR-con 1.00±0.10 1.00±0.11 1.00±0.10 1.00±0.09 0.32±0.04 0.23±0.02 0.25±0.02 0.33±0.03 anti-miR-133a-3p 1.86±0.15① 1.52±0.14① 1.61±0.14① 1.39±0.12① 0.68±0.05① 0.42±0.02① 0.49±0.04① 0.46±0.06①anti-miR-133a-3p＋si-con 1.92±0.16 1.61±0.15 1.57±0.13 1.42±0.13 0.62±0.07 0.43±0.03 0.48±0.03 0.54±0.05 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 1.25±0.11② 1.08±0.09② 1.18±0.11② 1.10±0.09② 0.36±0.04② 0.28±0.04② 0.35±0.02② 0.36±0.04②F值 105.688 54.486 54.676 33.215 111.736 109.818 142.818 38.616 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖 4 Western blot檢測 hOBMSCs中 BMP9、Runx2、OCN和OPN蛋白表達（第7天）Fig 4 The expresion of BMP9，Runx2，OCN and OPN protein in hOBMSCs detected by Western blot（7th day）

2.5 沉默 BMP9部分逆轉(zhuǎn)干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs的凋亡抑制作用

流式細(xì)胞術(shù)和Western blot（表 5、圖 5），與 antimiR-con組比，anti-miR-133a-3p組 hOBMSCs的凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組 hOBMSCs的凋亡率、Cleavedcaspase-3蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。

圖5 沉默BMP9部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-133a-3p對hOBMSCs的凋亡抑制作用Fig 5 The inhibitory effect of interference of miR-133a-3p by silencing BMP9 partially on hOBMSCs apoptosis

表5 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs凋亡的影響（±s，n＝9）Tab 5 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the apoptosis of hOBMSCs（±s，n＝9）

表5 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs凋亡的影響（±s，n＝9）Tab 5 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the apoptosis of hOBMSCs（±s，n＝9）

注：與anti-miR-con組比較，①P＜0.05；與anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，② P＜0.05

分 組 細(xì)胞凋亡率（%） Cleaved-caspase-3 anti-miR-con 9.24±0.76 0.72±0.07 anti-miR-133a-3p 3.58±0.34① 0.31±0.03 anti-miR-133a-3p＋si-con 3.14±0.48 0.28±0.02 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 5.83±0.61② 0.65±0.06 F值 216.175 189.796 P值 0.000 0.000

2.6 沉默 BMP9部分逆轉(zhuǎn)干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs中Smad通路的影響

Western blot檢測Smad通路相關(guān)蛋白表達，見表6和圖 6，與 anti-miR-con組比，anti-miR-133a-3p組hOBMSCs中 p-Smad1／5／8蛋白的表達顯著升高（P＜0.05）；與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組 hOBMSCs中 p-Smad1／5／8蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）。

圖 6 Western blot檢測 hOBMSCs中 p-Smad1／5／8和 Smad1／5／8蛋白表達Fig 6 p-Smad1／5／8 and Smad1／5／8 protein expression in hOBMSCs detected by Western blot

表6 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中p-Smad1／5／8和Smad1／5／8蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 6 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of p-Smad1／5／8 and Smad1／5／8 in hOBMSCs（±s，n＝9）

表6 共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中p-Smad1／5／8和Smad1／5／8蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 6 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of p-Smad1／5／8 and Smad1／5／8 in hOBMSCs（±s，n＝9）

注：①與 anti-miR-con組比較，P＜0.05；②與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，P＜0.05

分 組 Smad1／5／8蛋白 p-Smad1／5／8蛋白anti-miR-con 0.66±0.08 0.29±0.02 anti-miR-133a-3p 0.68±0.05 0.62±0.07①anti-miR-133a-3p＋si-con 0.64±0.06 0.61±0.06 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 0.63±0.05 0.41±0.05②F值 1.180 81.553 P值 0.333 0.000

3 討 論

BMSCs成骨分化研究可有效的調(diào)控骨損傷疾病的再生和修復(fù)，其在組織工程中的應(yīng)用越來越受到重視［7］。研究發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p的異常表達還可參與肌源性分化和骨骼肌生長的調(diào)控［8］。miR-133a-3p還調(diào)控BMSCs的成骨分化，并與BMSCs異常分化引起的人類疾病密切相關(guān)［9］。單核細(xì)胞中miR-133a表達還可作為臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥輔助診斷指標(biāo)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)hOBMSCs成骨分化過程中miR-133a-3p表達顯著降低，提示miR-133a-3p表達改變可能與hOBMSCs成骨分化相關(guān)。功能分析顯示，干擾miR-133a-3p表達顯著增加細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡。

Runx2是調(diào)節(jié)BMSCs形態(tài)和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的早期成骨標(biāo)志物，OCN是BMSCs晚期成骨分化標(biāo)志物，OPN通過與組織中的輕磷灰石結(jié)合在骨基質(zhì)礦化中發(fā)揮作用，三者是檢測BMSCs成骨功能的關(guān)鍵指標(biāo)［11］。本研究表明，干擾miR-133a-3p表達可顯著上調(diào) Runx2、OCN、OPN蛋白表達水平，與 Zhang等［12］抑制miR-133a表達可促進BMSCs成骨分化的結(jié)論基本吻合。以上研究說明干擾miR-133a-3p可促進hOBMSCs增殖和成骨分化，抑制細(xì)胞凋亡。

BMP9被認(rèn)為是最具成骨能力的BMPs之一。研究顯示miR-155通過下調(diào)BMP信號通路可抑制BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［13］。黃芪多糖通過下調(diào)miR-152增加BMP9表達促進骨間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化［14］。本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)hOBMSCs成骨分化過程中BMP9表達顯著升高，并證實miR-133a-3p靶向負(fù)性調(diào)控BMP9表達?；謴?fù)實驗顯示干擾BMP9部分逆轉(zhuǎn)miR-133a-3p抑制對hOBMSCs增殖、成骨分化和凋亡的影響。Smad信號通路與骨骼發(fā)育過程中BMSCs分化相關(guān)，BMPs可誘導(dǎo) Smad1／5／8磷酸化，磷酸化的Smad1／5／8與Smad4結(jié)合并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，進而與組織特異性轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同驅(qū)動成骨靶基因表達［15］。研究發(fā)現(xiàn)包括miRNA在內(nèi)的多種因子通過激活Smad通路參與調(diào)控 BMPs成骨分化［16－17］。本研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-133a-3p表達抑制hOBMSCs細(xì)胞p-Smad1／5／8蛋白表達，而干擾BMP9部分逆轉(zhuǎn)miR-133a-3p抑制對 p-Smad1／5／8蛋白表達的影響，說明miR-133a-3p通過調(diào)控BMP9表達參與hOBMSCs的增殖、成骨分化和凋亡，其機制可能與調(diào)控Smad通路有關(guān)。干擾miR-133a-3p表達有望成為骨損傷相關(guān)疾病治療的新途徑。