磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4根際高效解有機(jī)磷細(xì)菌的分離鑒定

張樂，張思宇，王亞露，李剛，楊殿林，趙建寧 *

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實驗室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實驗室，天津 300191）

磷是地球生命系統(tǒng)的主要營養(yǎng)元素之一，也是生態(tài)系統(tǒng)常見的營養(yǎng)限制因子。磷素是植物必需的大量無機(jī)營養(yǎng)元素，在植物體內(nèi)的含量通常僅次于氮和鉀，對于植物生長代謝有非常重要的作用。但是世界上絕大部分農(nóng)田土壤嚴(yán)重缺乏作物可利用的有效態(tài)磷。據(jù)報道全世界13.19 億hm的耕地中約有43%缺磷，我國1.07 億hm農(nóng)田中大約有2/3 嚴(yán)重缺磷。然而土壤總磷資源豐富，但其主要以無法直接被作物吸收利用的不溶態(tài)和難溶態(tài)形式存在，可供植株吸收利用的可溶性無機(jī)態(tài)磷酸鹽含量嚴(yán)重缺少，因此提高作物對農(nóng)田土壤中磷素的高效利用有重要的研究意義和價值。

為了解決大面積農(nóng)田土壤有效磷缺失的現(xiàn)狀，基于土壤中磷素的分布情況，當(dāng)前主要從3個方面提高作物對農(nóng)田土壤磷素的利用效率：第一個方面是施加磷肥，補(bǔ)充農(nóng)田土壤中的磷素；第二方面是利用解磷微生物生產(chǎn)解磷菌劑，解磷微生物的發(fā)現(xiàn)為解磷肥料的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；第三方面是培育磷高效作物品種，通過一些傳統(tǒng)雜交育種手段及現(xiàn)代生物技術(shù)手段培育出對土壤磷素有更高吸收利用效率的品種。雖然施加磷肥在一定程度上緩解了大面積農(nóng)田土壤有效磷缺失的現(xiàn)狀，但是研究表明磷肥在施用農(nóng)田后大部分會轉(zhuǎn)化成溶解度較低的鈣化態(tài)磷和閉蓄態(tài)磷，同時由于磷在土壤中的擴(kuò)散系數(shù)很低且受土壤對磷的吸附和固化作用等因素的影響，土壤中的有效態(tài)磷含量依然很低，可供作物直接吸收利用的磷素十分有限，磷素水平依舊制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。而且由于磷肥的消耗，可供生產(chǎn)的磷礦資源日益緊張。在未來的研究工作中，從提高土壤磷素的吸收效率出發(fā)，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)解磷菌劑和培育磷高效作物品種將更加具有現(xiàn)實意義。

土壤微生物是土壤中數(shù)量最大、種類最豐富的生物類群，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和結(jié)構(gòu)形成中發(fā)揮著重要的作用，其中有一類可以將植物無法吸收的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可吸收無機(jī)磷形態(tài)的功能微生物類群被稱為解磷菌（Phosphate-solubilizing microorganisms，PSM）。解磷菌不僅種類繁多，而且在自然界中數(shù)量也十分龐大，是一項非常值得開發(fā)研究的資源。1903 年STALSTROM 發(fā)現(xiàn)土壤中存在的某些微生物具有解磷作用，目前已發(fā)現(xiàn)在自然界中存在著大量具有解磷作用的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌及藍(lán)藻。世界上應(yīng)用最早且最廣的具有解磷作用的微生物是巨大芽孢桿菌，在后續(xù)的研究中，各類芽孢桿菌、假單胞菌和一些桿菌及部分真菌也被開發(fā)利用為菌劑菌肥，這些微生物在生物肥料的生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。

磷高效轉(zhuǎn)基因水稻品種OsPT4，是利用生物技術(shù)手段將水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)胧荏w而獲得的磷高效吸收型水稻，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院培育。OsPT4通過編碼磷高效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因合成磷高效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而提高了其對土壤中有效磷的吸收消耗速率。在此基礎(chǔ)上開發(fā)解磷菌劑增加土壤有機(jī)磷水解是否可以進(jìn)一步提升其磷素利用效率？為此本研究以磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4為試驗材料，利用改良的蒙金娜有機(jī)磷選擇培養(yǎng)基分離OsPT4根際土壤中的高效解有機(jī)磷菌株，初步探究其解磷能力和溶磷特性，并通過與傳統(tǒng)大田作物中分離獲得的解磷菌資源進(jìn)行比較判斷，以其應(yīng)用可行性和價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

從2014 年開始在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所內(nèi)的網(wǎng)室中進(jìn)行磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4 連續(xù)種植實驗，目前已連續(xù)種植7 年。土壤樣品為2020 年9月采集的磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4根際土壤，使用直徑3.5 cm 的土鉆在距水稻主莖2 cm 處采集0~20 cm深的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良的蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH）SO0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO·7HO 0.3 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.03 g，MnSO·4HO 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO5.0 g，酵母膏 0.4 g，瓊脂 20 g，ddHO 1 000 mL，pH為7.0~7.5（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 1 g，酵母 0.5 g，NaCl 1 g，ddHO 100 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 解有機(jī)磷菌株的分離純化

稱取1.0 g根際土壤樣品，加入9 mL無菌水，渦旋混勻30 s，靜置10 min。吸取1 mL 土壤懸液，加入49 mL 配制好的蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r·min振蕩培養(yǎng)24 h。吸取1 mL 培養(yǎng)好的菌液按照10~10進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋，分別涂布在蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，每個梯度設(shè)置3 個平行。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，確定10為最佳稀釋倍數(shù)。按照上述方法和最佳稀釋倍數(shù)將土壤樣品進(jìn)行解有機(jī)磷菌株的分離，挑取產(chǎn)生溶磷圈的單菌落進(jìn)行劃線純化3~5 代獲得純菌株，將純菌株在LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)后使用甘油法保存。

1.2.2 解有機(jī)磷菌株的菌落特征觀察和可溶性指數(shù)的測定

將分離得到的純菌株點(diǎn)接到蒙金娜固體有機(jī)磷培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)特征，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進(jìn)行初步鑒定。分別測定菌落直徑和溶磷圈直徑以計算可溶性指數(shù)，初步判斷解有機(jī)磷菌株的解磷能力。計算公式為：

可溶性指數(shù)=溶磷圈直徑/菌落直徑

1.2.3 解有機(jī)磷菌株24 h解磷量和溶磷特性的測定

挑選產(chǎn)生明顯溶磷圈的解磷菌株進(jìn)行解磷量、pH 和堿性磷酸酶的測定。將各菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min培養(yǎng)7 h，然后用分光光度計調(diào)整菌液濃度至OD=0.6。分別吸取750μL菌懸液加入到15 mL 蒙金娜液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)24 h（每個菌株3 組重復(fù)），取10 mL 培養(yǎng)液用酸度計測定pH，剩余培養(yǎng)液4 ℃、12 000 r·min離心 5 min 獲得上清液。取 2 mL 上清液用鉬銻抗顯色法測定有效磷含量。另取0.5 mL 上清液用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒（BOXBIO）測定堿性磷酸酶活性。

1.2.4 解有機(jī)磷菌株生長曲線的測定

將解有機(jī)磷菌株分別接種到LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min培養(yǎng)7 h，然后使用分光光度計調(diào)整菌液濃度至OD=0.1 用于接種。在100 mL LB 液體培養(yǎng)基中接種 5 mL OD=0.1 的菌液，30 ℃、180 r·min恒溫振蕩培養(yǎng)30 h，每隔2 h監(jiān)測一次OD值并記錄，觀測菌株的生長狀況并繪制生長曲線。

1.2.5 菌株的鑒定及其同源性分析

將純化的單菌落挑入10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至菌液渾濁后，吸取菌液2 mL進(jìn)行DNA的提取。采用16S rDNA 通用引物27F 和1492R 進(jìn)行16S rDNA基因序列的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測后，送上海生工進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 進(jìn)行初步整理后，用SPSS 軟件（21.0版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對可溶性指數(shù)、24 h 菌株的解磷量、pH、堿性磷酸酶活性進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較（<0.05 表示差異顯著）。使用Origin 軟件（2018 版本）繪制菌株24 h 解磷量、pH 和堿性磷酸酶圖，并擬合6 株菌株的生長曲線。菌株鑒定測序結(jié)果通過Blast 程序與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，下載同源性高的序列使用MEGA 軟件（7.0 版本）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 解有機(jī)磷菌株的篩選純化

采用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法，使用蒙金娜固體有機(jī)磷培養(yǎng)基對磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4 根際土壤中的解有機(jī)磷菌株進(jìn)行分離，共獲得15 株解有機(jī)磷菌株（圖1a），分別命名為Y1~Y15。經(jīng)過純化培養(yǎng)3代后獲得6 株解磷能力較強(qiáng)且生長穩(wěn)定的菌株（圖1b），分別是Y1、Y4、Y6、Y7、Y11、Y13，對其進(jìn)行進(jìn)一步解磷能力和溶磷特性的研究。

圖1 解有機(jī)磷菌株的篩選Figure 1 Screening picture of solution organophosphorus hydrolyzing strains

2.2 菌株的菌落特征觀察

從菌落的形狀、大小、顏色等方面觀察6 株解有機(jī)磷菌株單菌落的形態(tài)特征并記錄，初步判斷6 株菌株均為革蘭氏陰性細(xì)菌（表1）。

表1 6株解有機(jī)磷菌株菌落形態(tài)特征Table 1 Colony morphological characteristics of 6 strains of organophosphorus hydrolyzing bacteria

2.3 解有機(jī)磷菌株的解磷能力

可溶性指數(shù)和24 h 解磷量常作為表征菌株解磷能力的指標(biāo)。可溶性指數(shù)結(jié)果顯示：6 株解有機(jī)磷菌株的解磷能力之間存在一定差異，可溶性指數(shù)由大到小排序為Y7>Y11>Y1>Y13>Y4>Y6，Y7 菌株的可溶性指數(shù)最高為6.33，其次的Y11 為3.81（表2）。另外，對6 株解有機(jī)磷菌株的解磷能力進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明Y7 培養(yǎng)24 h 后的菌液中的無機(jī)磷濃度達(dá)到87.43 mg·L（圖2），顯著高于其他5個菌株。

圖2 6株解有機(jī)磷菌株培養(yǎng)24 h的解磷量Figure 2 Phosphorus solubility of the 6 organophosphorus hydrolyzing strains

表2 6株解有機(jī)磷菌株的可溶性指數(shù)Table 2 Disolving phosphate zone diameter to culture community zone diameter of organophosphorus hydrolyzing bacteria

2.4 解有機(jī)磷菌株的溶磷特性

酸化作用和堿性磷酸酶作用是解磷菌溶磷的主要機(jī)制。各菌液在培養(yǎng)24 h 后pH 均有所降低，表現(xiàn)為酸性，Y7 菌株的pH 下降最顯著，為3.42，各菌株培養(yǎng)24 h 后菌液pH 由大到小的排序為Y11>Y6>Y1>Y13>Y4>Y7（圖3a）。培養(yǎng)24 h 菌液中的堿性磷酸酶活性結(jié)果顯示（圖3b）：6 株解有機(jī)磷菌株之間分泌堿性磷酸酶的能力存在一定的差異，Y11菌株分泌堿性磷酸酶的能力最強(qiáng)，為38.69 μg·mL·h，其次是Y7菌株，為36.20 μg·mL·h，堿性磷酸酶活性由大到小排序為Y11>Y7>Y4>Y13>Y6>Y1。

圖3 6株解有機(jī)磷菌株培養(yǎng)24 h后菌液的pH和堿性磷酸酶活性Figure 3 The pH and alkaline phosphatase activity of the 6 organophosphorus hydrolyzing strains

2.5 解有機(jī)磷菌株的生長曲線

各菌株生長曲線均可分為3 個時期，即指數(shù)生長期、平穩(wěn)增長期和緩慢衰落期。在培養(yǎng)的前8 h中，菌落環(huán)境和營養(yǎng)條件適宜，菌株以指數(shù)倍數(shù)快速增長，在8~26 h 內(nèi)以平穩(wěn)速度緩慢增長，在第26 h 達(dá)到頂峰，隨后受營養(yǎng)條件的限制速度開始緩慢下降。其中Y1 和 Y4 增長稍緩慢，Y6、Y7、Y11 和 Y13 增長速度基本一致（圖4）。

圖4 6株解有機(jī)磷菌株的生長曲線Figure 4 Growth curve of 6 organophosphorus hydrolyzing strains

2.6 解有機(jī)磷菌株的鑒定

經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增子基因序列測序分析（圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6 株菌株屬于不動桿菌屬（）、假單胞菌屬（）、腸桿菌屬（）和泛菌屬（）4 個菌屬。Y6 與 Y13 的親緣關(guān)系較近，同屬腸桿菌屬；Y4 和Y11 的親緣關(guān)系較近，同屬假單胞菌屬。

圖5 6株解有機(jī)磷菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Figure 5 Phylogenetic tree of established based on 16S rDNA sequences of 6 organophosphorus hydrolyzing strains

3 討論

解磷微生物在土壤磷素循環(huán)中具有重要作用，解磷微生物的分布具有明顯的根際效應(yīng)，且受到土壤類型、環(huán)境因子和種植作物類型等多因素的影響。本研究從OsPT4根際土壤中共分離獲得15株解有機(jī)磷菌株，在后續(xù)分離純化過程中僅6株能在有機(jī)磷培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長且形成明顯的透明圈。有研究發(fā)現(xiàn)，約60%初篩得到的有解磷能力的菌株在后續(xù)純化培養(yǎng)過程中失去解磷能力，其原因可能是不同菌株對環(huán)境的適應(yīng)性和對磷素的要求有一定差異。此外，6株菌株的生長特性和活性基本保持一致，生長曲線均符合微生物培養(yǎng)特點(diǎn)，即在有限資源的條件下培養(yǎng)階段分為指數(shù)生長期、平穩(wěn)增長期和緩慢衰落期3個階段。

解磷能力是篩選解磷菌資源的基本標(biāo)準(zhǔn)。聶振等從我國南方水稻根際土中分離的24 株解磷菌株的發(fā)酵液的可溶性總磷含量為23.7~79.3μg·mL，張廣志等從設(shè)施菜地土壤中分離獲得的14 株解磷菌株的平均解磷量為48.7 mg·L，莊馥璐等從蘋果根際分離獲得的10株解磷菌株的可溶性指數(shù)在1.5~5.3之間，解磷量最高為104.125 mg·L。本研究OsPT4根際土中分離獲得的6 株解磷菌的可溶性指數(shù)為1.50~6.33，培養(yǎng)24 h 后培養(yǎng)液中的有效磷含量為10.60~87.43 mg·L，解磷能力與上述研究中篩選得到的菌株相當(dāng)，其中Y7 菌株在可溶性指數(shù)和解磷量上均表現(xiàn)最好，解磷能力在上述解磷菌株中也屬于較高水平，為高效解磷菌資源。

不同菌株在不同培養(yǎng)條件下的解磷能力有差異，菌株之間的溶磷特性也不完全相同。目前，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)解磷菌解磷主要有兩大機(jī)制：一是部分微生物可以分泌出有機(jī)酸、硫化物、H等酸性物質(zhì)降低生長環(huán)境的pH，從而使難溶性磷酸鹽溶解；二是在受到磷限制時，一些微生物可以分泌釋放胞外磷酸酶水解有機(jī)磷。通過測定培養(yǎng)24 h 后菌液的pH 和堿性磷酸酶活性分析菌株的解磷特性發(fā)現(xiàn)，Y7 菌株的解磷機(jī)制主要為酸化作用和堿性磷酸酶作用，而Y11菌株解磷的主要機(jī)制是堿性磷酸酶作用，其他菌株在分泌堿性磷酸酶活性方面差異不顯著，pH 降低量與解磷能力有一定的相關(guān)性。

從大田作物中篩選獲得的常見解磷微生物種類主要有芽孢桿菌、不動桿菌、假單胞菌、埃希氏菌、歐文氏菌、沙雷氏菌和腸桿菌等菌屬。從OsPT4根際土中篩選獲得的6株高效解有機(jī)磷菌株在分類上，Y1屬于不動桿菌屬，Y6和Y13屬于腸桿菌屬，Y4和Y11為假單胞菌屬，5 株菌株均為常見的解磷菌類別。特殊的是解有機(jī)磷能力最強(qiáng)的Y7菌株屬于泛菌屬，雖然目前從水稻土壤中分離獲得高效解磷泛菌菌株的研究較少，但相關(guān)研究表明泛菌在自然界中分布廣泛，可以從水中和土壤中分離獲得，且在研究中其常作為水稻、大麥、蘿卜等大田作物的種子內(nèi)生菌核心類群，多個類型的泛菌都具有解磷能力和分泌IAA的能力，對植物具有促生作用和抵抗真菌性病害的功能。

4 結(jié)論

從磷高效轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤中分離獲得15 株解有機(jī)磷菌株，純化復(fù)篩后獲得6 株可以在有機(jī)磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯透明圈的解有機(jī)磷菌株。6 株菌株在解磷能力上與大田作物中分離獲得的解磷菌解磷能力相當(dāng)，其中Y7 菌株表現(xiàn)最好，可溶性指數(shù)高達(dá)6.33，在 24 h 內(nèi)的解磷量達(dá)到87.43 mg·L，為高效解磷菌資源。除菌株Y7 外的5 株菌株均為大田土壤中可分離獲得的常見解磷菌類別，Y7 屬于水稻種子內(nèi)生菌核心類群泛菌屬（），酸化作用和堿性磷酸酶作用是其主要的解磷機(jī)制。另外，磷高效轉(zhuǎn)基因水稻的種植對有效磷消耗效率的影響是否改變了根系土壤中的解磷菌群落結(jié)構(gòu)，使泛菌等類群菌株的相對豐度增加則需要基于現(xiàn)代分子生物學(xué)方法對解磷微生物整體群落進(jìn)行進(jìn)一步研究。