稻麥輪作體系長(zhǎng)期秸稈還田對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及秸稈降解潛力的影響

紀(jì)程，孫玉香，2，孟圓，2，劉耀斌，2，徐聰，張永春，2，谷益安，汪吉東，2*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部江蘇耕地保育科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095；3.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京 211816）

稻麥輪作（夏水稻-冬小麥）是我國(guó)長(zhǎng)江流域的主要種植制度之一，稻麥輪作區(qū)糧食產(chǎn)量占我國(guó)糧食總產(chǎn)量的72%。由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平高，該地區(qū)每年產(chǎn)生大量的秸稈，小麥秸稈產(chǎn)量可達(dá)4.5 t?hm，水稻秸稈產(chǎn)量可達(dá)9 t?hm。傳統(tǒng)的秸稈焚燒方式不僅對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，同時(shí)浪費(fèi)了可利用資源。秸稈中富含氮、磷、鉀等養(yǎng)分，相比于為追求作物高產(chǎn)而過(guò)量施用化肥，利用秸稈還田替代或部分替代化肥是一種能夠有效緩解農(nóng)田土壤退化以及實(shí)現(xiàn)培肥地力的措施。研究表明，秸稈還田能夠提高土壤中有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀及其他微量元素的含量并降低土壤容重。微生物是土壤養(yǎng)分循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)者，秸稈還田可促進(jìn)土壤微生物活性和養(yǎng)分分解利用。然而田間環(huán)境復(fù)雜且秸稈降解周期較長(zhǎng)，可能造成短期和長(zhǎng)期秸稈還田試驗(yàn)結(jié)果之間差異較大，本研究擬通過(guò)長(zhǎng)期田間試驗(yàn)探明稻麥輪作體系下秸稈還田對(duì)土壤養(yǎng)分含量及土壤微生物群落的影響。

田間條件下秸稈降解緩慢，未及時(shí)腐解的秸稈極大地影響了下茬作物的種植和生長(zhǎng)。秸稈腐解過(guò)程由土壤微生物主導(dǎo)，例如，CHEN 等發(fā)現(xiàn)玉米秸稈降解時(shí)土壤革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和放線菌的豐度明顯上升。相比于細(xì)菌，真菌不僅能分解秸稈中的易降解組分，還能高效分解難降解組分（如纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）。韋中等以稻稈粉為唯一碳源篩選獲得降解能力較強(qiáng)的兩株真菌和兩株細(xì)菌，兩株真菌分泌的纖維素酶活性是兩株細(xì)菌的5~14 倍。研究表明秸稈降解導(dǎo)致的腐殖質(zhì)大量累積主要依賴真菌對(duì)木質(zhì)素的降解作用。此外，LI 等發(fā)現(xiàn)水稻秸稈腐解過(guò)程中土壤真菌群落多樣性顯著提高，而細(xì)菌群落多樣性基本保持不變。上述結(jié)果表明還田秸稈降解過(guò)程中真菌的分解作用占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。秸稈降解會(huì)導(dǎo)致土壤真菌群落組成發(fā)生改變。例如，秸稈還田能夠顯著提高真菌總量，影響真菌群落多樣性，并改變真菌類(lèi)群如接合菌門(mén)和子囊菌門(mén)以及核盤(pán)菌屬和隱球菌屬的相對(duì)豐度。針對(duì)秸稈還田對(duì)土壤理化特性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響方面已開(kāi)展了廣泛研究，但尚不清楚長(zhǎng)期秸稈還田是否能富集秸稈腐解微生物從而加速秸稈降解。

本研究依托稻麥輪作系統(tǒng)長(zhǎng)期秸稈還田試驗(yàn)（10 a），研究土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)秸稈還田的響應(yīng)，并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析秸稈還田對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，最后通過(guò)埋盆試驗(yàn)探究秸稈還田土壤是否誘導(dǎo)秸稈降解微生物的富集，從而加速后續(xù)還田秸稈的降解。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤樣品采自江蘇省典型稻麥輪作種植區(qū)，位于淮安市原種場(chǎng)江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（稻麥）科技綜合示范基地。該地區(qū)受季風(fēng)氣候影響，四季分明，雨量集中，雨熱同季，年平均氣溫為14.4 ℃，年降水量為906~1 007 mm，土壤類(lèi)型為潮黃土，土壤pH 為8.1，總有機(jī)質(zhì)含量 6.21 g?kg，全氮含量1.23 g?kg，全磷含量0.8 g?kg。每季作物的施肥情況如下：稻季基肥施用375 kg?hm45%復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）和150 kg?hm尿素，追施分蘗肥、促花肥和?；ǚ示鶠?50 kg?hm尿素。麥季基肥施用375 kg?hm45%復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）和150 kg?hm尿素，分蘗期和拔節(jié)期分別追施150 kg?hm尿素。該示范基地自2009 年后每年均實(shí)行稻麥雙季秸稈還田，獲取上一季作物的全量秸稈后，將秸稈機(jī)械粉碎至5~10 cm，再用旋耕機(jī)旋入土壤耕層（0~20 cm）。每年水稻秸稈的還田量約為9 t?hm，小麥秸稈的還田量約為6 t?hm。對(duì)照田塊收獲秸稈后不還田。采樣時(shí)間為2019年8月水稻季，上季麥稈已全量粉碎并用旋耕機(jī)旋入土壤耕層。

分別采集秸稈還田和對(duì)照田塊土壤樣品，每個(gè)處理田塊按單對(duì)角線取樣法選取3 個(gè)小區(qū)（3 個(gè)生物重復(fù)），每個(gè)小區(qū)依據(jù)梅花形布點(diǎn)法各設(shè)5 個(gè)采樣點(diǎn)采集耕層（0~20 cm）土壤，挑除土樣中殘余秸稈、石塊、植物根系等雜質(zhì)，一部分于陰涼處風(fēng)干用以檢測(cè)土壤化學(xué)性質(zhì)，一部分保存在-80 ℃冰箱，用于DNA 提取及后續(xù)擴(kuò)增子MiSeq測(cè)序。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)秸稈還田土壤中微生物群落對(duì)秸稈的降解能力，余下土壤適當(dāng)風(fēng)干后經(jīng)過(guò)篩處理（10目）用于開(kāi)展秸稈埋盆試驗(yàn)。

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[17-18]。土壤總碳和可溶性有機(jī)碳含量分別利用元素分析儀（Ele?mental, Germany）和總有機(jī)碳分析儀（Shimadzu, Kyo?to,Japan）測(cè)定。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量利用流動(dòng)分析儀（SEAL AutoAnalyzer 3,Germany）測(cè)定，礦物質(zhì)氮含量為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的加和。土壤總磷含量采用酸溶-鉬銻抗比色法測(cè)定。土壤pH 利用復(fù)合玻璃電極儀（PHS-3C mv/pH detector，上海）測(cè)定，測(cè)定時(shí)的土水比為1∶5。土壤電導(dǎo)率利用數(shù)字式電導(dǎo)率儀（DDS-11A）測(cè)定。

1.3 土壤DNA提取及真菌群落結(jié)構(gòu)分析

采用土壤DNA 提取試劑盒（Power Soil DNA Iso?lation kit）提取土壤總DNA，稱取0.3 g新鮮土壤樣品，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用Nano?drop分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）檢測(cè)DNA 樣品濃度和純度。DNA樣品于-20 ℃保存。

利 用 引 物 ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAG?TAA）和ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）擴(kuò)增真菌 ITS1 區(qū)。PCR 擴(kuò)增體系（25 μL）含 5×反應(yīng)緩沖液 5 μL，5×GC 緩沖液 5 μL，dNTP（2.5 mmol·L）2μL，前引物（10 μmol·L）1 μL，后引物（10 μmol·L）1 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 8.75 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL。PCR 條件（30 個(gè)循環(huán)）包括98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃最后延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用Pure link 快速凝膠萃取試劑盒（Trans Gen Biotech）對(duì)所需條帶進(jìn)行剪切純化。純化后的PCR 產(chǎn)物送至上海凌恩生物公司在Illumina MiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)使用QIIME Pipe?line-Version 1.7.0 的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，先對(duì)雙向序列進(jìn)行拼接，去除低質(zhì)量序列（最大錯(cuò)誤率0.25）和barcode 序列，然后用UCHIME 算法去除嵌合體序列。以97%的相似度為閾值劃分操作分類(lèi)單元（OTU），利用UNITE 數(shù)據(jù)庫(kù)的核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)（RDP）確定每個(gè)真菌OTU的分類(lèi)地位，閾值為0.8。利用QI?IME 軟件計(jì)算真菌群落OTU 數(shù)量和Shannon 多樣性指數(shù)。利用LEfSe 軟件對(duì)真菌序列進(jìn)行線性判別分析（Liner discriminant analysis, LDA），獲得秸稈還田和對(duì)照土壤中豐度具有顯著差異的主要真菌屬（相對(duì)豐度前20%），篩選標(biāo)準(zhǔn)為顯著性檢驗(yàn)<0.05 和線性判別分析值≥3。

1.4 土壤微生物群落秸稈降解潛力的測(cè)定

為了探究10 a 秸稈還田處理對(duì)土壤微生物消納秸稈潛力的影響，利用秸稈埋盆試驗(yàn)測(cè)定土壤微生物群落的秸稈降解潛力，該試驗(yàn)可最大程度地避免田間條件下前期還田而未腐解秸稈對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。供試土壤為過(guò)篩的田間土壤，分別稱取1 kg秸稈還田和未還田土壤置于容量為1.5 L的盆缽內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)盆缽。將7 g 烘干后的小麥秸稈剪成5 cm 小段，裝入尼龍袋（80 目）并填埋于花盆內(nèi)。尼龍網(wǎng)袋能使微生物通過(guò)，同時(shí)防止未分解秸稈的損失，且秸稈腐解后呈絲狀、絮狀，導(dǎo)致腐解秸稈與土壤難以區(qū)分，使用尼龍袋可從土壤中快速、有效回收秸稈。尼龍網(wǎng)袋填埋深度為8 cm，調(diào)節(jié)土壤水分至60%田間最大持水量，培養(yǎng)過(guò)程中利用稱質(zhì)量法保持水分（每2 d 測(cè)一次）。室溫培養(yǎng)兩個(gè)月后（2019 年8—10 月）取出尼龍袋。尼龍網(wǎng)袋中土壤的去除方式參照文獻(xiàn)[23-24]，將尼龍網(wǎng)袋中的秸稈放入100 目篩網(wǎng)中，使用流速相同且緩慢的去離子水洗去秸稈表面附著的土壤顆粒，直至篩孔流出的水變清澈為止，隨后將洗去土壤顆粒的秸稈置于80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，利用秸稈降解率（）計(jì)算土壤秸稈降解潛力：

式中：為初始秸稈干質(zhì)量，g；W為培養(yǎng)時(shí)間后秸稈干質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析土壤化學(xué)性質(zhì)和秸稈降解率在對(duì)照和處理間的差異顯著性（SPSS 21.0）。利用基于非權(quán)重UniFrac 距離矩陣的主坐標(biāo)軸分析（PCoA）研究秸稈還田對(duì)土壤真菌群落的影響。熱圖采用R 語(yǔ)言（pheatmap 包）繪制。利用冗余分析（RDA，CANOCO 4.5）研究秸稈降解率、土壤化學(xué)特性及真菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，排序軸的顯著性通過(guò)蒙特卡羅排列檢驗(yàn)（=499）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈還田對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

由表1 可以看出，與未還田對(duì)照相比，10 a 秸稈還田處理能夠顯著降低土壤pH，下降了約0.22 個(gè)單位；秸稈還田分別提高了土壤可溶性有機(jī)碳和總碳含量的23%和2%。同時(shí)，秸稈還田處理下土壤電導(dǎo)率（EC）和總磷（TP）含量分別增加了48%和24%。然而，秸稈還田對(duì)土壤銨態(tài)氮（NH-N）含量的影響并不顯著（=0.81）。盡管秸稈還田對(duì)硝態(tài)氮（NO-N，=0.14）和礦質(zhì)氮（=0.14）含量有一定程度的提高，但與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。

表1 秸稈還田對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響Table 1 Effects of straw incorporation on the soil physical and chemical properties

2.2 秸稈還田對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

與對(duì)照土壤相比，10 a秸稈還田顯著降低土壤真菌群落Alpha 多樣性，真菌群落OTU 數(shù)量和Shannon多樣性指數(shù)分別降低了32.9%（<0.05）和14.2%（<0.05）（圖1a、圖1b）。基于非權(quán)重UniFrac距離矩陣的PCoA 結(jié)果表明，對(duì)照和秸稈還田土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)沿主坐標(biāo)軸1明顯區(qū)分（圖1c），該坐標(biāo)軸可解釋真菌群落變異比的88.7%。

圖1 秸稈還田對(duì)土壤真菌群落Alpha多樣性和Beta多樣性的影響Figure 1 Effects of straw incorporation on the Alpha-diversity and Beta-diversity of fungal community

序列比對(duì)結(jié)果表明供試土壤真菌群落主要由子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）和接合菌門(mén)（Zygomycota）組成（圖2a），其中子囊菌門(mén)（Ascomycota）為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，其相對(duì)豐度占整體真菌群落的50%以上。秸稈還田顯著增加了子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度（<0.05），增幅為25%；同時(shí)，接合菌門(mén)（Zygomycota）的相對(duì)豐度有所下降，但并不顯著（=0.17）。由熱圖可看出秸稈還田對(duì)土壤主要真菌屬（相對(duì)豐度前20%）的相對(duì)豐度影響明顯，對(duì)照和秸稈還田處理形成明顯聚類(lèi)（圖2b）。線性判別分析結(jié)果表明裂殼菌屬（）、帚枝菌屬（）、赤雷菌屬（）、囊根壺菌屬（）、林氏草孔菌屬（）、隱球菌屬（）、漆斑菌屬（）等真菌屬在秸稈還田土壤中被富集（>3，<0.05），增幅為2.5~132.3 倍，而秸稈還田顯著降低了、、、、、和等真菌屬的相對(duì)豐度（<-3，<0.05）。

圖2 秸稈還田對(duì)土壤真菌群落門(mén)水平組成及土壤真菌群落屬水平組成的影響Figure 2 Effects of straw incorporation on the relative abundances of fungal phyla and the relative abundances of dominant fungal genus

2.3 秸稈還田對(duì)土壤微生物群落降解麥稈潛力的影響

秸稈埋盆試驗(yàn)中，對(duì)照和秸稈還田土壤的秸稈降解率分別為38%和52%，長(zhǎng)期秸稈還田顯著提高了土壤微生物對(duì)小麥秸稈的降解潛力（<0.05），增幅為37%。

2.4 土壤化學(xué)性質(zhì)、真菌群落組成及秸稈降解潛力的冗余分析（RDA）

利用RDA分析了土壤化學(xué)性質(zhì)、真菌群落組成（屬水平）及秸稈降解潛力的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。RDA1 和RDA2 兩軸可共同解釋真菌群落結(jié)構(gòu)差異的96.1%。蒙特卡羅檢驗(yàn)結(jié)果表明秸稈還田土壤中的麥稈降解潛力與真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著相關(guān)性（<0.01）。此外，土壤 pH（<0.01）、EC（<0.01）、TP（<0.01）、TC（<0.01）和DOC（<0.01）對(duì)真菌群落組成具有顯著影響，、、、、、和等真菌屬的相對(duì)豐度與土壤EC、TP、TC和DOC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與pH呈正相關(guān)關(guān)系。秸稈還田通過(guò)提高、、、、、、、、、和真菌屬的相對(duì)豐度提高小麥秸稈降解率。

圖3 土壤化學(xué)性質(zhì)、真菌群落組成及秸稈降解率的相互關(guān)系Figure 3 Correlations between soil chemical properties,fungal community structure and straw degradation rates

3 討論

秸稈還田是提高土壤碳固存能力的有效手段。本研究發(fā)現(xiàn)稻麥輪作系統(tǒng)長(zhǎng)期秸稈還田可提高土壤總碳和可溶性有機(jī)碳含量（表1）。類(lèi)似地，CONG等通過(guò)4 a 田間試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)玉米秸稈還田可提高土壤可溶性有機(jī)碳含量；XIA 等的整合分析結(jié)果表明秸稈還田可提高土壤可溶性有機(jī)碳含量的22%，并提高土壤總有機(jī)碳含量的15%。上述結(jié)果的主要原因是：一方面，秸稈本身的有機(jī)碳含量較高，秸稈腐解加速土壤碳積累；另一方面，秸稈施用為土壤微生物提供了充足碳源，提高了微生物數(shù)量和活性，進(jìn)而能夠促進(jìn)秸稈中惰性碳向活性有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化。

ZHANG 等認(rèn)為秸稈還田能夠增加土壤中氮和磷元素的含量。本研究中秸稈還田顯著提高了土壤總磷含量，但對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮含量的影響并不顯著，可能的原因是秸稈經(jīng)礦化作用產(chǎn)生的無(wú)機(jī)氮被土壤微生物所同化。與以往諸多研究結(jié)果相同，本研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田顯著降低了土壤pH，該結(jié)果可能是由于秸稈腐解過(guò)程會(huì)釋放較多的有機(jī)酸。

秸稈還田可改變土壤微生物群落組成，相關(guān)研究表明，秸稈可提高土壤微生物多樣性。然而本研究中，秸稈還田降低了土壤真菌群落多樣性，這可能是由于秸稈作為碳氮源為微生物提供養(yǎng)分從而大幅提高了部分真菌類(lèi)群的相對(duì)豐度，導(dǎo)致整體群落多樣性的降低。例如，本研究中優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群——子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度在秸稈還田土壤中有較大幅度的上升。此外，本研究中秸稈還田增加了土壤可溶性有機(jī)碳、總碳以及總磷的含量，土壤養(yǎng)分含量的提升可能進(jìn)一步影響土壤真菌群落組成。本研究?jī)H關(guān)注了秸稈還田對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響，但秸稈還田同樣可以改善土壤物理性狀，如增加土壤孔隙度和透氣性，通過(guò)改善土壤物理性狀間接對(duì)土壤微生物群落組成的影響尚需進(jìn)一步探究。真菌群落組成與土壤pH聯(lián)系緊密，本研究中秸稈還田對(duì)土壤pH 的降低作用可能是造成土壤真菌組成發(fā)生變化的重要原因。

對(duì)于長(zhǎng)期秸稈還田是否會(huì)加速土壤微生物對(duì)秸稈降解的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期秸稈還田土壤可顯著提高還田秸稈的腐解效率。本研究中子囊菌門(mén)（Ascomycota）是真菌群落的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度受長(zhǎng)期秸稈還田的影響而大幅增加。MA 等發(fā)現(xiàn)在秸稈降解的不同階段子囊菌均占據(jù)主導(dǎo)地位，表明該類(lèi)菌是驅(qū)動(dòng)土壤秸稈降解的關(guān)鍵類(lèi)群。因此，子囊菌門(mén)相對(duì)豐度的增加可能是長(zhǎng)期秸稈還田條件下秸稈降解能力顯著增強(qiáng)的主要原因。此外，LEfSe 和RDA分析結(jié)果均表明裂殼菌屬（）、帚枝霉屬（）、赤霉菌屬（）、囊根壺菌屬（）、林氏革孔菌屬（）、隱球菌屬（）和漆斑菌屬（）能夠在長(zhǎng)期秸稈還田的土壤中富集。以往研究表明裂殼菌屬、帚枝霉屬、赤霉菌屬、囊根壺菌屬、漆斑菌屬以及隱球菌屬均具有高效秸稈纖維素降解能力，其中帚枝霉屬和隱球菌屬還可利用秸稈水解產(chǎn)物生產(chǎn)低聚糖氧化酶和脂質(zhì)。此外，LI 等發(fā)現(xiàn)接種人工合成的秸稈降解菌群可提高裂殼菌屬的豐度，說(shuō)明該菌屬可能與其他秸稈降解菌存在互利關(guān)系。林氏革孔菌屬與秸稈降解的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。

3 結(jié)論

（1）稻麥輪作系統(tǒng)長(zhǎng)期秸稈還田能顯著提高土壤可溶性有機(jī)碳、總碳以及總磷的含量。

（2）秸稈還田驅(qū)動(dòng)真菌群落組成改變，降低了土壤真菌群落多樣性，提高了子囊菌門(mén)及裂殼菌屬、帚枝霉屬、赤霉菌屬、囊根壺菌屬、漆斑菌屬以及隱球菌屬等潛在秸稈降解真菌的相對(duì)豐度。

（3）秸稈還田通過(guò)富集潛在秸稈降解真菌加速秸稈的降解。