天然有機(jī)酸強(qiáng)化伴礦景天提取鎘的潛力與機(jī)制

李茂林，陳喆，2*，周紅燕，吳佳玲，李侃麒，游少鴻，2

（1.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.桂林理工大學(xué)，廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004）

鎘（Cd）作為一種主要的無機(jī)污染物，在土壤中通常具有較高的生物利用性，容易從土壤轉(zhuǎn)移到食物鏈，并通過食物鏈的生物蓄積效應(yīng)對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，近年來備受關(guān)注。2014 年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國耕地土壤重金屬的總超標(biāo)率為19.4%，其中Cd 的點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%。因此，如何快速、有效地削減耕地土壤中Cd的含量，對(duì)保障我國糧食安全、人體健康與高質(zhì)量發(fā)展需求具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

目前，針對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)，已經(jīng)開發(fā)了多種原位和異位修復(fù)技術(shù)，例如固化、穩(wěn)定化、土壤淋洗、植物修復(fù)。化學(xué)和物理修復(fù)方法用于去除土壤Cd 的成本較高，且會(huì)破壞耕地土壤服務(wù)功能，與此相比，植物修復(fù)技術(shù)作為一種重金屬污染修復(fù)技術(shù)，具有原位修復(fù)、成本低、環(huán)境友好、無二次污染、景觀美化等諸多優(yōu)點(diǎn)。其中的植物提取技術(shù)是通過連續(xù)種植富集植物將重金屬等污染物吸收富集至地上部從而實(shí)現(xiàn)提取凈化土壤中污染物的目標(biāo)，這種方法不會(huì)破壞土壤原始結(jié)構(gòu)和微生物活性。然而，植物提取效率受到植物對(duì)重金屬的吸收富集量、植物生物量、土壤pH、養(yǎng)分、修復(fù)時(shí)間等因素的限制。目前，大多研究人員更專注于通過提高重金屬生物富集率和增加植物生物量來提高富集植物對(duì)重金屬的提取效率。研究表明，某些材料可用于提高植物產(chǎn)量或活化土壤金屬有效性，從而增加植物對(duì)金屬的吸收富集量，進(jìn)而縮短修復(fù)所需的時(shí)間。低分子量有機(jī)酸主要源自耕層土壤有機(jī)質(zhì)分解、植物根系分泌物和微生物代謝物，其通過對(duì)金屬螯合/絡(luò)合特性以及對(duì)微生物活性和根際物理特性的間接影響來調(diào)控離子溶解度和吸收速率。檸檬酸和蘋果酸不僅是根系分泌物中常見的天然低分子量有機(jī)酸，還是高效的活化劑，其可有效提高土壤中植物可利用態(tài)Cd 的含量，進(jìn)而強(qiáng)化植物對(duì)Cd 的吸收富集。水培研究表明，添加100μmol·L的檸檬酸和蘋果酸顯著促進(jìn)了秋華柳對(duì)Cd 的吸收和積累。土培盆栽研究表明，基施濃度為5 mmol·kg的檸檬酸時(shí)，青葙對(duì)Cd 的吸收富集效率最佳，相對(duì)于植物旺盛時(shí)加入強(qiáng)化劑，基施對(duì)植物的抗逆性要求更高，但可有效縮短修復(fù)所需時(shí)間。現(xiàn)已知的超積累植物有721種，但Cd的超富集植物僅有7種，其中伴礦景天（）是工程應(yīng)用最為廣泛的一種Cd 超富集植物。目前，對(duì)于伴礦景天修復(fù)污染土壤的研究主要集中于伴礦景天與其他植物間作、套作、輪作，添加化學(xué)改良劑、調(diào)整種植密度、調(diào)控肥料和強(qiáng)化微生物等方面。草酸和乙二胺二琥珀酸等有機(jī)酸已經(jīng)用于伴礦景天修復(fù)Cd 污染土壤，但施加檸檬酸和蘋果酸是否能強(qiáng)化伴礦景天對(duì)Cd 的吸收富集還不清楚。種子育苗、扦插育苗和組培育苗是伴礦景天3 種不同的育苗方式，伴礦景天的種子小、不易收集且發(fā)芽率低，難以大規(guī)模應(yīng)用，而無性繁殖的組培苗和扦插苗既可保留其生物特性，又可以大量擴(kuò)繁，因此有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前，組培嫩苗和扦插老苗對(duì)Cd污染土壤的適應(yīng)性及修復(fù)效率是否存在明顯差異尚不清楚。

因此，本研究利用土培盆栽試驗(yàn)的方法，選用檸檬酸和蘋果酸作為輔助強(qiáng)化劑，研究兩種強(qiáng)化劑對(duì)伴礦景天修復(fù)Cd污染土壤的效果與機(jī)制。同時(shí)選用伴礦景天組培苗和扦插苗，研究兩種苗富集Cd的差異性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：伴礦景天組織培養(yǎng)苗（ZP），由中國科學(xué)院植物研究所提供，無污染基質(zhì)室內(nèi)培養(yǎng)而成。伴礦景天扦插苗（QC），2017 年3 月在云南省蘭坪大田示范基地種植組培苗生長至壯苗，2018年1月將壯苗分株扦插移栽于廣東省仁化大田示范基地，2018 年6月收割地上部（留茬5 cm），留茬生長至2019年1月后分株為扦插苗用于本研究。兩種伴礦景天苗均先在裝有無污染基質(zhì)營養(yǎng)土的穴盤中預(yù)培養(yǎng)45 d，然后再進(jìn)行移栽。

供試土壤：土壤采自廣西壯族自治區(qū)桂林市陽朔縣興坪鎮(zhèn)思的村某鉛鋅礦周邊污染農(nóng)田（24°59'6.4″N、110°33'25.3″ E）0~20 cm 表層土壤。將采集的土壤置于陰涼處自然風(fēng)干，剔除石子和枯葉等雜物，壓碎后過10 目篩，并取混合樣品過20 目和100 目尼龍篩，裝袋備用。供試土壤的基本理化性質(zhì)見表1。根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018），土壤 pH 為 5.18，土壤總Cd含量為2.29 mg·kg，超過農(nóng)用地土壤風(fēng)險(xiǎn)管制值（Cd≤1.5 mg·kg），確定該供試土壤為偏酸性重度Cd污染土壤。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of test soil

供試有機(jī)酸：檸檬酸（Citric acid）和蘋果酸（Malic acid）均為阿拉丁公司生產(chǎn)的分析純化學(xué)試劑。

1.2 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于 2019 年 2 月 20 日至 7 月 6 日在桂林理工大學(xué)重金屬污染植物修復(fù)試驗(yàn)基地進(jìn)行。稱取6.5 kg 過10 目篩的風(fēng)干土壤填裝于18 個(gè)塑料盆（上口直徑25 cm、底部直徑19.5 cm、高20 cm）中。移苗前將5 mmol·kg（以風(fēng)干土壤質(zhì)量計(jì)）檸檬酸和蘋果酸以溶液形式加入盆栽土壤中，翻動(dòng)并平衡2 周后，選取長勢(shì)一致的伴礦景天苗（組培苗高5~7 cm，扦插苗高10~13 cm），移栽于盆中，每盆4株。另設(shè)不加強(qiáng)化劑的空白對(duì)照處理。本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)6 個(gè)處理：（1）ZP-CK，種植組培苗但不加強(qiáng)化劑；（2）ZP-CA，基施檸檬酸種植組培苗；（3）ZP-MA，基施蘋果酸種植組培苗；（4）QC-CK，種植扦插苗但不加強(qiáng)化劑；（5）QCCA，基施檸檬酸種植扦插苗；（6）QC-MA，基施蘋果酸種植扦插苗。每個(gè)處理重復(fù)3 次，隨機(jī)排列且定期變換位置。景天苗生長期間，定期澆水，使土壤含水量保持在田間最大持水量的60%~70%。

1.3 樣品的采集、處理及測定

按照水土比2.5∶1 的方法測定土壤pH，參照《土壤 pH 值的測定 電位法》（HJ 962—2018）；有機(jī)質(zhì)含量采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定；土壤銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量采用聯(lián)合浸提-比色法測定，參照《酸性土壤銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀的測定聯(lián)合浸提-比色法》（NY/T 1849—2010）。土壤重金屬總量測定，采用美國環(huán)保署推薦的HNO-HO消解法處理（USEPA：Method 3050B），分析過程中加入土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品（GSS-23）和空白進(jìn)行質(zhì)量控制，樣品回收率均在90%~110%之間，消解所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，所用水均為超純水，土壤有效態(tài)Cd 含量采用DTPA 法浸提，參照《土壤質(zhì)量有效態(tài)鉛和鎘的測定原子吸收法》（GB/T 23739—2009），并用 ICP-MS（PE NexION 350）測定土壤Cd的含量。

非損傷微測試技術(shù)（NMT）可以非侵入性地獲取有關(guān)材料表面特定離子/分子活性的動(dòng)態(tài)信息。使用NMT 系統(tǒng)（NMT150-SIM-XY，Younger USA LLC）研究土培伴礦景天根系微區(qū)（分生區(qū)、伸長區(qū)、成熟區(qū)）Cd的吸收/外排情況。測定Cd通量的玻璃微電極制作：向組織樣品專用流速傳感器（XY-CGQ-01）內(nèi)注入 1 cm 左右長度的灌沖液[10 mmol·LCd（NO）、0.1 mmol·LKCl]，然后向傳感器尖端填充40~50μm的Cd液體交換劑（XY-SJ-Cd-10），接著用細(xì)砂紙摩擦玻璃微流速傳感器固定架（XY003-Y11）上的銀絲，以去除表面氧化層，在0.1 mol·LKCl 溶液中氯化20~30 s后，插入微電極傳感器的背面，以與電解質(zhì)溶液進(jìn)行電接觸。在Cd通量測定中，使用含有0.05、0.1、0.5 mmol·LCdSO以及0.1 mmol·LKCl和0.3 mmol·LMES，pH 5.8 的標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)微電極。當(dāng)通過3 個(gè)點(diǎn)繪制的能斯特斜率為25~32 mV·de?cade時(shí)，則校準(zhǔn)工作完成。然后將生長了4 個(gè)月的伴礦景天整顆帶土挖出，帶土根部放入裝水的500 mL 塑料燒杯中浸泡12 h 后，先用自來水沖洗根部附著的泥土，再用去離子沖洗干凈，沿根尖切下3~5 cm長的根，轉(zhuǎn)移到裝有0.1 mmol·LCdSO的測試溶液中（pH 5.8），平衡 10 min 后，以 30 μm 步距對(duì)根部微區(qū)進(jìn)行測定。通過顯微鏡觀察根部微區(qū)的形態(tài)特點(diǎn)來區(qū)分不同微區(qū)的長度，在距根尖約100、500、1 500μm 附近的根表面測定Cd通量，分別代表根部分生區(qū)（Meristem zone）、伸長區(qū)（Elongation zone）和成熟區(qū)（Mature zone），測定值穩(wěn)定后，記錄10 min 的數(shù)據(jù)，且每個(gè)部位重復(fù)測定3次。

植物收獲后分解為根、莖、葉3 部分。根部先用自來水洗凈后，再用10 mmol·LNa-EDTA 浸泡15 min 以去除吸附在根表面的重金屬，最后用去離子水沖洗3 次；莖、葉部分先用自來水沖洗3 次，再用去離子水沖洗3 次。將洗凈的根、莖、葉于105 ℃下殺青30 min，70 ℃下烘干至質(zhì)量恒定，用電子天平稱量并記錄各部分干質(zhì)量，之后放入粉碎機(jī)中粉碎，裝袋待測。植物樣品消煮方法與土壤相同，采用植物樣品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GSV-2）和空白進(jìn)行質(zhì)量控制，樣品回收率均在90%~110%之間。采用ICP-OES（PE Optima 7000 DV）測定樣品Cd 含量。植物收獲時(shí)，采集植物根部區(qū)域的土壤，將其置于陰涼處自然風(fēng)干后，過20 目和100目尼龍篩，裝袋備用。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和Origin 2017處理和做圖，用SPSS 25單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 法對(duì)多組樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和顯著性檢驗(yàn)（<0.05）。植物富集系數(shù)（BCF）和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）的計(jì)算公式為：

富集系數(shù)=植株Cd 含量（mg·kg）/土壤Cd 含量（mg·kg）

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植株地上部Cd含量（mg·kg）/植株地下部Cd含量（mg·kg）

根、莖、葉間轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)計(jì)算公式：

根-莖的 Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=植株莖部 Cd 含量（mg·kg）/植株根部Cd含量（mg·kg）

莖-葉的 Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=植株葉部 Cd 含量（mg·kg）/植株莖部Cd含量（mg·kg）

2 結(jié)果與分析

2.1 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天生物量的影響

由表2 可知，兩種伴礦景天苗各組織生物量均表現(xiàn)為葉>莖>根，不同處理下伴礦景天生物量表現(xiàn)為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，伴礦景天扦插苗生物量高于組培苗。施加檸檬酸和蘋果酸處理下，伴礦景天生物量較對(duì)照組分別增加了32.7%~34.7%和23.4%~24.2%，QC-CA 處理的根、莖、葉生物量最高，分別為2.07、4.05、9.55 g·盆，較QC-CK 顯著增加了25.5%、30.6%、38.8%。

表2 不同處理方式下伴礦景天各組織生物量（g·盆-1）Table 2 Biomass of of Sedum plumbizincicola under different treatments（g·pot-1）

2.2 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)土壤有效態(tài)Cd 及pH 的影響

由圖1 可知，與供試土壤相比，添加5 mmol·kg檸檬酸和蘋果酸后，土壤中有效態(tài)Cd 含量顯著增加了19.9%~25.8%和14.3%~19.2%。ZP-CA 處理有效態(tài) Cd 含量最高，為 1.42 mg·kg，QC-CK 處理有效態(tài)Cd含量最低，為1.12 mg·kg。

圖1 不同處理對(duì)土壤有效態(tài)Cd及pH的影響Figure 1 Effects of different treatments on soil available Cd and pH

與供試土壤相比，施加5 mmol·kg檸檬酸和蘋果酸后，土壤pH顯著降低了0.20~0.25個(gè)和0.13~0.17個(gè)單位，ZP-CK 處理土壤 pH 最高，為 5.15，QC-CA 處理土壤pH最低，為4.92。

2.3 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天Cd含量的影響

由圖2可知，不同處理下的伴礦景天各組織中Cd含量分布規(guī)律為葉>莖>根。不同處理伴礦景天根、莖、葉中Cd含量規(guī)律均為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，QC-CA 處理的根、莖、葉組織中Cd 含量最高，分別為227.5、398.1、645.5 mg·kg。與對(duì)照組相比，施加檸檬酸處理的根、莖、葉Cd 含量分別顯著增加55.3%、19.3%、42.6%，施加蘋果酸處理的根、莖、葉Cd含量分別增加44.2%、9.9%、24.3%。與Cd 超富集植物標(biāo)準(zhǔn)（植物葉組織的干質(zhì)量中Cd 含量>100 μg·g）相比，本研究中伴礦景天葉組織Cd 含量是該標(biāo)準(zhǔn)的3.36~6.46倍，遠(yuǎn)超標(biāo)準(zhǔn)值。

圖2 不同處理方式下伴礦景天各組織中的Cd含量Figure 2 Contents of Cd in Sedum plumbizincicola tissues under different treatments

2.4 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天富集與轉(zhuǎn)運(yùn)Cd能力的影響

由表3可知，伴礦景天地上部對(duì)Cd的富集量遠(yuǎn)高于地下部，是地下部的15.0~18.3倍，對(duì)土壤Cd的富集量有94.1%位于地上部。有機(jī)酸處理下兩種伴礦景天苗生物量規(guī)律為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，其中QCCA處理對(duì)土壤Cd的富集量最高，為8.24 mg·盆，ZPCK 處理最低，為1.88 mg·盆。施加檸檬酸和蘋果酸處理的伴礦景天與對(duì)照組相比，地上部Cd富集量分別增加了73.8%~90.4%和34.5%~61.6%。

表3 不同處理伴礦景天對(duì)Cd的富集與轉(zhuǎn)運(yùn)特征Table 3 Characteristics of Cd enrichment and translocation in Sedum plumbizincicola with different treatments

兩種伴礦景天苗對(duì)土壤Cd均具有很高的富集系數(shù)（129.2~229.8），施加檸檬酸和蘋果酸顯著提高了伴礦景天對(duì)Cd的富集能力，富集規(guī)律為檸檬酸>蘋果酸>空白對(duì)照，其中QC-CA處理的富集系數(shù)最大。

伴礦景天地上部對(duì)地下部的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為2.20~3.03，施加檸檬酸和蘋果酸后，地上部對(duì)地下部Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分別顯著降低了6.1%~17.2%和10.6%~22.4%，莖對(duì)根部的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為1.64~2.35，Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力較高，葉對(duì)莖部的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為1.17~1.62。

2.5 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天根部微區(qū)Cd 吸收/外排的影響

由圖3 和圖4 可知，各處理組伴礦景天根部微區(qū)Cd流速均為負(fù)值，即表示吸收Cd。根部不同區(qū)域Cd流速差異較大，流速大小依次為伸長區(qū)>分生區(qū)>成熟區(qū)，其中QC-CA 處理伸長區(qū)Cd平均流速最大，為-39.95 pmol·cm·s，ZP-CK 處理成熟區(qū) Cd平均流速最小，僅為-5.53 pmol·cm·s。伴礦景天扦插苗根部各微區(qū)Cd流速高于同處理的組培苗，與對(duì)照組相比，施加檸檬酸和蘋果酸增加了伴礦景天根部微區(qū)Cd流速，且施加檸檬酸后根部微區(qū)Cd流速增加量高于施加蘋果酸。

圖3 不同處理伴礦景天根部微區(qū)凈Cd2+流速Figure 3 Net Cd2+in the root micro zone of Sedum plumbizincicola of different treatments

續(xù)圖3 不同處理伴礦景天根部微區(qū)凈Cd2+流速Continued figure 3 Net Cd2+flux in the root micro zone of Sedum plumbizincicola of different treatments

圖4 不同處理伴礦景天根部微區(qū)平均Cd2+流速Figure 4 The average Cd2+flux in the root micro zone of Sedum plumbizincicola of different treatments

3 討論

3.1 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)土壤pH 和Cd 有效性的影響

檸檬酸和蘋果酸都屬于低分子量有機(jī)酸，其官能團(tuán)（如羧基）是金屬的重要結(jié)合位點(diǎn)，含有2 個(gè)或3 個(gè)羧基的蘋果酸和檸檬酸，可以與Cd 形成具有五元環(huán)或六元環(huán)結(jié)構(gòu)的Cd-有機(jī)酸螯合物，從而解吸更多的土壤Cd。土壤薄層色譜和土柱試驗(yàn)也表明，檸檬酸和蘋果酸增強(qiáng)了Cd 的遷移。在本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤有效態(tài)Cd 含量與對(duì)照組相比顯著增加，說明施加的有機(jī)酸可活化土壤中的Cd，提高土壤中Cd的生物利用度。檸檬酸處理組土壤有效態(tài)Cd 含量高于蘋果酸處理，這可能得益于檸檬酸較大的分子量和較高的Cd-檸檬酸螯合系數(shù)。前人研究表明，與分子量較小的蘋果酸相比，檸檬酸帶有更多的負(fù)電荷，具有更大的表面積和更強(qiáng)的吸附、螯合重金屬的能力，檸檬酸與Cd 的螯合常數(shù)又高于蘋果酸，因此檸檬酸螯合Cd 的能力大于蘋果酸。研究表明，檸檬酸對(duì)Cd遷移率的影響高于蘋果酸，施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤乙酸可提取Cd 的比例分別增加6.11%~9.43%和3.06%~6.63%，而乙酸可萃取Cd又與重金屬的可萃取性呈正相關(guān)關(guān)系，表明檸檬酸在提高土壤Cd 有效性方面要優(yōu)于蘋果酸，這與本研究結(jié)果一致。

研究表明，施加的檸檬酸和蘋果酸不僅可以與金屬離子形成可溶性螯合物，改變重金屬的溶解度，還可以酸化土壤。本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤pH 低于對(duì)照組0.13~0.25 個(gè)單位，一方面，得益于施加檸檬酸和蘋果酸電離出的H，另一方面，得益于伴礦景天根部分泌的有機(jī)酸、離子交換作用和呼吸產(chǎn)生的CO溶解作用。SUN等的研究也表明伴礦景天和東南景天的根系土壤會(huì)被酸化。在本研究中，施加檸檬酸的土壤pH 比施加蘋果酸低0.07~0.08 個(gè)單位，可能是因?yàn)闄幟仕岜忍O果酸多電離一個(gè)H，和/或施加檸檬酸的伴礦景天根部分泌更多的H和有機(jī)酸，也可能是土壤自身的緩沖作用。隨著土壤pH 的降低，重金屬Cd 的有效性會(huì)增加，這也是施加檸檬酸和蘋果酸后，土壤有效態(tài)Cd 含量顯著增加的原因之一。

3.2 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天生物量與Cd 含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，添加5 mmol·kg的草酸、檸檬酸和蘋果酸顯著增加了Cd、Pb 污染土壤中籽粒莧的生物量。在本研究中，與對(duì)照組相比，施加檸檬酸和蘋果酸后，伴礦景天的生物量顯著提高，且檸檬酸處理的伴礦景天生物量高于蘋果酸處理，這可能得益于施加有機(jī)酸對(duì)土壤的改善作用。研究表明，施加檸檬酸后，土壤有效磷和堿解氮含量、細(xì)菌數(shù)量，土壤酶（酸性磷酸酶和脲酶）活性和細(xì)菌群落Cd 抗性均高于施加同濃度蘋果酸，這表明檸檬酸在活化土壤養(yǎng)分、增加細(xì)菌數(shù)量、提高酶活性和改善細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面的表現(xiàn)優(yōu)于蘋果酸，改善后的土壤有利于植物生長，增加植物生物量。微生物生物量和酶活性是衡量土壤微生態(tài)的重要生化指標(biāo)，施加檸檬酸和蘋果酸對(duì)改善土壤微生態(tài)也具有積極作用。TAO 等研究發(fā)現(xiàn)，25 μmol·LCdCl脅迫3 d 后，東南景天根系分泌物中的有機(jī)酸（草酸、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸）增加，根系分泌的有機(jī)酸可以用于緩解Cd的毒性。有機(jī)酸可通過與根系分泌物的絡(luò)合作用和與微生物生物量的協(xié)同作用來降低金屬離子對(duì)植物的毒性。有研究表明，游離Cd對(duì)作物的毒性比Cd-有機(jī)酸螯合態(tài)更大，與蘋果酸和草酸相比，檸檬酸在減輕Cd 的毒性作用方面效果更好。因此，有機(jī)酸與Cd 形成的金屬螯合物減輕了Cd 對(duì)植物的毒性，緩解了Cd 對(duì)植物生長的抑制作用，而與蘋果酸處理相比，檸檬酸能更好地緩解Cd 的毒性，這間接解釋了檸檬酸處理組伴礦景天生物量高于蘋果酸處理的原因（表2）。

已有研究表明，施加酒石酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸顯著增加了籽粒莧、龍葵、商陸、青葙和八寶景天根部與地上部的Cd 含量并提高了Cd 的富集系數(shù)，施加茶皂素和檸檬酸處理增加了伴礦景天根部和地上部Cd 含量，與蘋果酸和草酸相比，檸檬酸在增強(qiáng)商陸對(duì)Cd 的吸收方面效果更好。在本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸后的兩種伴礦景天苗的根、莖、葉部Cd 含量與對(duì)照組相比均有所增加，施加檸檬酸的伴礦景天各組織Cd 含量高于施加蘋果酸，這說明檸檬酸對(duì)提高伴礦景天吸收Cd的效果好于蘋果酸。早期的研究表明，當(dāng)植物暴露于重金屬脅迫時(shí)，植物細(xì)胞中可能會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸作為重金屬螯合的潛在配體，因此有機(jī)配體在植物的重金屬耐受和解毒中發(fā)揮重要作用。TAO 等研究發(fā)現(xiàn)，超積累型東南景天木質(zhì)部汁液中的主要Cd 存在形態(tài)是游離Cd（43.9%~44.5%），其次是Cd-蘋果酸（22.9%~24.7%）和Cd-檸檬酸（17.6%~18.9%），該結(jié)果表明 Cd 主要以Cd、Cd-蘋果酸或Cd-檸檬酸螯合物形式從根部轉(zhuǎn)移到地上部。施加同水平的檸檬酸和蘋果酸時(shí)，土壤中的Cd-檸檬酸螯合物含量高于Cd-蘋果酸螯合物，這些螯合物可能直接被根部吸收利用，也可能在Cd-有機(jī)酸螯合物與根區(qū)結(jié)合時(shí)，解離并釋放Cd，從而再被根部吸收，而Cd-有機(jī)酸螯合物含量越高，伴礦景天可吸收利用的Cd 越多，相應(yīng)的伴礦景天植株Cd 含量越高。

LU 等發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸可提高東南景天中Cd從根到地上部的遷移率。在本研究中，施加檸檬酸和蘋果酸顯著提高了伴礦景天對(duì)Cd 的富集系數(shù)，這表明檸檬酸和蘋果酸可增強(qiáng)伴礦景天的土壤Cd的富集能力，檸檬酸處理的Cd富集系數(shù)高于蘋果酸，這表明檸檬酸提高伴礦景天富集Cd的能力高于蘋果酸。

3.3 基施檸檬酸和蘋果酸對(duì)伴礦景天根系微區(qū)Cd2+流速的影響

研究發(fā)現(xiàn)，東南景天根尖0~10 mm 段中的Cd 濃度顯著高于10~20 mm 段，伴礦景天和東南景天根尖區(qū)域通常有很高的Cd吸收量，離根尖越遠(yuǎn)，凈Cd吸收量減少越多。在本研究中，不同處理伴礦景天根部Cd流速表現(xiàn)為伸長區(qū)>分生區(qū)>成熟區(qū)，且位于根尖伸長區(qū)的Cd流速遠(yuǎn)大于遠(yuǎn)離根尖的成熟區(qū)，這與前人的研究結(jié)果一致。在本研究中，與對(duì)照組相比，施加檸檬酸和蘋果酸均增加了伴礦景天根部各區(qū)域Cd流速，且檸檬酸處理的伴礦景天根部各區(qū)域Cd流速高于蘋果酸處理，這表明施加檸檬酸和蘋果酸均能增加伴礦景天根部對(duì)土壤Cd 的吸收速率，且檸檬酸的增加效果好于蘋果酸。

目前，對(duì)于Cd 在根表面進(jìn)行跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)姆绞街饕袃煞N看法：一個(gè)是，包含Cd超富集物種在內(nèi)的植物可以通過離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收Cd；另一個(gè)是，超富集植物對(duì)Cd 吸收可以通過高親和力傳輸系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)（如特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），雖然到目前為止，在植物的根細(xì)胞膜中還沒有發(fā)現(xiàn)高親和力的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，但生理學(xué)證據(jù)表明在超富集植物的根中存在特定的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。已有研究表明，根毛細(xì)胞質(zhì)膜中豐富的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道促進(jìn)了Cd的吸收，在擬南芥、在煙草和東南景天中過表達(dá)顯著增強(qiáng)了植物對(duì)Cd的耐受性和積累能力。施加的檸檬酸和蘋果酸與土壤中Cd 發(fā)生螯合反應(yīng)，產(chǎn)生的Cd-有機(jī)酸螯合物和解離的Cd可能會(huì)刺激伴礦景天根細(xì)胞中Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)Cd 的耐受性和積累能力，促使伴礦景天吸收更多的Cd。此外，還存在許多其他的Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)通道，例如Cd 和Zn 具有相同的價(jià)態(tài)和相似的離子半徑，Cd 可以借助Zn 的轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)入植物體內(nèi)。根尖分生區(qū)和伸長區(qū)主要進(jìn)行細(xì)胞分裂和生長，其有大量的ATP、較高的呼吸速率和基因表達(dá)水平，較高的細(xì)胞活性和某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)可能促進(jìn)了Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，而成熟區(qū)已經(jīng)完成細(xì)胞分化，主要進(jìn)行礦質(zhì)營養(yǎng)元素吸收，細(xì)胞膜中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道對(duì)Cd也有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收能力。

3.4 伴礦景天組培苗和扦插苗修復(fù)Cd污染土壤的差異

在本研究中，同處理的伴礦景天扦插苗根、莖、葉Cd 含量、各組織的生物量、根部微區(qū)的Cd流速和富集與轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 的能力均高于組培苗，這可能與所選苗的特性有關(guān)。研究采用的伴礦景天扦插苗為直徑在5 mm 左右、長度8~10 cm、帶全量葉的營養(yǎng)枝條，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)成為壯苗，具有生根快、生長迅速等特點(diǎn)，原生長區(qū)域歷經(jīng)云南和廣東Cd 污染土壤的馴化，且原生土壤環(huán)境（pH 5.87，總Cd含量4.22 mg·kg）與本試驗(yàn)移栽土壤有很高相似度，已形成高Cd 耐受性和低pH抗性，因此移栽后能快速適應(yīng)。組培苗直徑在3 mm左右、長度4~5 cm、帶全量葉，在無Cd 的培養(yǎng)基和無污染基質(zhì)（pH 為7.0 左右）中培養(yǎng)，沒有形成Cd 耐受性和低pH抗性，移栽后需要逐漸適應(yīng)新環(huán)境，因此其生根、生長速度低于扦插苗。本試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，組培苗基本已經(jīng)具有一定的Cd耐受性和低pH 抗性，如果對(duì)組培苗進(jìn)行二次扦插移栽，其在生物量和Cd 富集量等方面應(yīng)當(dāng)有所提高。扦插苗容易大量獲取和擴(kuò)繁，成活率高達(dá)93.1%，生物量和土壤Cd提取量遠(yuǎn)高于組培苗，有很高的工程應(yīng)用價(jià)值。組培苗的育苗成本較高，種植前期生物量和地上部Cd含量低于扦插苗，無法大規(guī)模應(yīng)用，但從長期來看，由于組培苗具有抗早衰特性，可進(jìn)行多次扦插移栽，延緩扦插苗的老化問題，因此有一定應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

（1）基施5 mmol·kg檸檬酸或蘋果酸可強(qiáng)化伴礦景天修復(fù)Cd 污染土壤，且基施檸檬酸的土壤Cd 修復(fù)效率高于基施蘋果酸。

（2）基施檸檬酸或蘋果酸可提高伴礦景天根系微區(qū)對(duì)土壤Cd的吸收。

（3）對(duì)于偏酸性重度Cd污染土壤，伴礦景天扦插苗的植物修復(fù)效率顯著高于組培苗。