蕓苔素內(nèi)酯對糜子苯唑·二甲鈉藥害的緩解作用

林瑞嫦，高玉萌，王可心，李鑫，楊思敏，高小麗

（西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100）

糜子（L.）具有抗旱耐瘠、耐鹽堿、生育期短等優(yōu)點，是我國北方干旱半干旱地區(qū)重要的糧食作物與經(jīng)濟作物。糜子籽粒富含蛋白質(zhì)、淀粉和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是新時期食物多元化的重要食物來源。

雜草是糜子減產(chǎn)的主要原因，查順清等指出糜子田雜草以闊葉雜草為主，每年陜西榆林地區(qū)因草害導致減產(chǎn)的糜子農(nóng)田占25%左右。糜子屬于直播密植作物，相比于傳統(tǒng)人工除草，使用化學除草劑可顯著減輕草害、降低生產(chǎn)成本、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，因此在糜子生產(chǎn)中除草劑的使用具有重要意義。苯唑·二甲鈉（WP）是一種由苯磺隆、唑草酮和2 甲4 氯鈉三元復配而成的新型復配除草劑。字雪靖研究發(fā)現(xiàn)，苯唑·二甲鈉對糜子田雜草防效較好，且能顯著提高糜子產(chǎn)量。但也有研究表明，除草劑在殺死雜草的同時也會對作物造成一定的藥害，抑制作物的生長發(fā)育，導致產(chǎn)量降低。

除草劑安全劑是一種可提升作物新陳代謝功能而又不影響除草劑除草效果的有機化合物。目前，利用安全劑來減輕除草劑藥害并擴大除草劑殺草范圍已成為研究熱點。蕓苔素內(nèi)酯（BR）是植物特異性甾體激素，可控制氣孔關(guān)閉進而提高作物的光合作用，廣泛參與其他生理過程并促進植株的生長發(fā)育，可有效提高作物在多種逆境（包括除草劑藥害）中的抗逆性。周小毛等發(fā)現(xiàn)，蕓苔素內(nèi)酯浸種可有效緩解除草劑胺苯磺隆對水稻幼苗的藥害。鐘楊等發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下噴施適宜濃度的蕓苔素內(nèi)酯可促進辣椒幼苗過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和葉綠素含量的增加，降低丙二醛（MDA）含量，減輕干旱對辣椒幼苗的傷害。適宜濃度的蕓苔素內(nèi)酯還可促進糜子葉片葉綠素含量、穗長和地上部生物量的增加，提高糜子產(chǎn)量，緩解闊世瑪對糜子的藥害作用。目前，未見到蕓苔素內(nèi)酯在緩解除草劑苯唑·二甲鈉藥害方面的相關(guān)報道，因此，本文通過在糜子幼苗期噴施除草劑苯唑·二甲鈉后，葉面噴施不同濃度的蕓苔素內(nèi)酯，研究其對苯唑·二甲鈉藥害的緩解作用和對雜草防效、糜子葉片葉綠素含量、抗氧化酶活性、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活性、MDA 含量、還原型谷胱甘肽（GSH）含量及產(chǎn)量的影響，旨在從糜子葉片生理代謝的角度闡明蕓苔素內(nèi)酯緩解苯唑·二甲鈉藥害的生理機制，以期為糜子生產(chǎn)中苯唑·二甲鈉的安全應用提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2020 年6—10 月在西北農(nóng)林科技大學榆林小雜糧綜合試驗示范站（37°56'N，109°21'E）進行，試驗地海拔1 229 m，年平均氣溫8.5 ℃，年平均日照數(shù)2 815.8 h，年平均降水量400 mm，降水主要集中在7—9月。

1.2 試驗設(shè)計

以“榆糜2 號”糜子品種為試驗材料，選用的莖葉型除草劑為55%苯唑·二甲鈉可濕性粉劑（美國富美實公司），安全劑為0.01%蕓苔素內(nèi)酯可溶性粉劑（河南東立信生物工程有限公司）。本課題組前期的除草劑篩選試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯唑·二甲鈉推薦濃度為0.6 kg·hm時對糜子田的雜草防效較好，且對糜子生長發(fā)育的負面影響較小，較清水不除草對照增產(chǎn)顯著，因此本試驗將苯唑·二甲鈉濃度設(shè)置為0.6 kg·hm。研究表明，在闊世瑪脅迫下噴施0.05~0.10 mg·L的蕓苔素內(nèi)酯可有效緩解闊世瑪對谷子的傷害，使谷子的株高、葉面積和生物量增大，促進其正常生長。因此本試驗將蕓苔素內(nèi)酯濃度設(shè)置為0.06、0.08、0.10 mg·L3個濃度。

試驗田間種植采取隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積為20 m（4 m×5 m），共設(shè)置6 個處理：人工除草（CK1）、噴施等量清水不除草（CK2）、0.6 kg·hm苯唑·二甲鈉（M1）、0.6 kg·hm苯唑·二甲鈉+0.06 mg·L蕓苔素內(nèi)酯（M1S1）、0.6 kg·hm苯唑·二甲鈉+0.08 mg·L蕓苔素內(nèi)酯（M1S2）、0.6 kg·hm苯唑·二甲鈉+0.10 mg·L蕓苔素內(nèi)酯（M1S3），每個處理4 次重復。待糜子幼苗長至3~4 葉期時，選擇晴朗、無風的下午噴施0.6 kg·hm的苯唑·二甲鈉。噴藥3 d 后，噴施不同濃度（0.06、0.08、0.10 mg·L）的蕓苔素內(nèi)酯緩解藥害，采用莖葉噴霧，藥液施用量為450 L·hm。

1.3 測定方法及指標

1.3.1 藥害指數(shù)調(diào)查

噴施安全劑蕓苔素內(nèi)酯7 d 后，統(tǒng)一在田間觀察并記錄糜子葉片的藥害及緩解情況，統(tǒng)計各處理重復小區(qū)的藥害級別及株數(shù)，計算藥害指數(shù)，見公式（1）。藥害等級參考字雪靖的藥害分級標準：植株正常生長發(fā)育、無明顯傷害為0 級藥害；0~20%的葉片枯黃或帶斑點為1 級藥害；20%~50%的葉片變黃且卷曲為2 級藥害；50%~70%的葉片卷曲枯黃為3 級藥害；70%~90%的葉片枯萎或20%死亡為4級藥害。

1.3.2 田間雜草防效調(diào)查

采用大小為0.25 m的鐵絲框隨機取樣，拔取各處理取樣框內(nèi)的雜草，對雜草鮮質(zhì)量進行稱量，藥后15 d 開始調(diào)查，之后以15 d 為間隔開展調(diào)查，直至糜子成熟，總計調(diào)查4 次，糜子田間雜草防效以鮮質(zhì)量防效表示。

式中：為鮮質(zhì)量防效，%；為對照 CK2 雜草鮮質(zhì)量，g；為處理（M1、M1S1、M1S2、M1S3）雜草鮮質(zhì)量，g。

1.3.3 糜子葉片葉綠素含量測定

噴施蕓苔素內(nèi)酯后，分別在糜子苗期（P1）、拔節(jié)期（P2）、抽穗期（P3）、灌漿前期（P4）及灌漿后期（P5）在各處理小區(qū)隨機選取3 株糜子植株，采用手持式SPAD-502 葉綠素測定儀測定糜子頂部展開葉片的葉綠素含量。

1.3.4 糜子葉片抗氧化酶、GST 活性和 MDA、GSH 含量測定

噴施蕓苔素內(nèi)酯后，分別在糜子苗期、拔節(jié)期、抽穗期、灌漿前期及灌漿后期采集糜子頂部展開葉片。每次所取葉片樣品放入液氮冷凍保存并儲存在-80 ℃冰箱中。POD、SOD、CAT、GST 活性和MDA、GSH 含量采用相應的檢測試劑盒測定，試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3.5 糜子農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量測定

糜子成熟后，各處理隨機選取5 株糜子植株進行考種，測量糜子株高、莖粗、穗長、穗質(zhì)量。各處理重復小區(qū)未取樣行進行單收計產(chǎn)。

1.4 統(tǒng)計與分析

利用Excel 2007 處理數(shù)據(jù)，Origin 2017 繪圖，SPSS 22 對數(shù)據(jù)進行分析，Duncan 新復極差法進行差異性分析。表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓苔素內(nèi)酯對除草劑藥害及雜草防效的影響

由表1 可知，M1 處理在糜子各生育時期的雜草鮮質(zhì)量平均防效均在80%以上（45 d除外），且隨著生育進程的推進呈先減弱后增強的趨勢。噴施蕓苔素內(nèi)酯處理（M1S1、M1S2、M1S3）較M1處理雜草防效略有降低，且隨著生育進程的推進呈逐漸降低的趨勢。M1S1、M1S2、M1S3處理的藥害指數(shù)均顯著低于M1處理，分別較 M1 處理下降了11.34、13.26、12.75 個百分點，說明噴施蕓苔素內(nèi)酯可以顯著減輕除草劑苯唑·二甲鈉對糜子的藥害。

表1 糜子田雜草鮮質(zhì)量防效和藥害指數(shù)Table 1 Broomcorn millet farmland weeds' fresh weight control effect and phytotoxicity index

2.2 除草劑及安全劑對糜子葉片葉綠素含量的影響

由表2 可知，隨著生育進程的推進，各處理的糜子葉片葉綠素含量呈先升高后降低的趨勢，且除M1S3 處理外，其余均在P4 期達到峰值。M1 處理糜子葉片的葉綠素含量較CK1 有所降低（P3 除外），噴施蕓苔素內(nèi)酯后（M1S1、M1S2、M1S3）的糜子葉片葉綠素含量均高于M1 處理，說明葉面噴施蕓苔素內(nèi)酯可提高糜子葉片葉綠素含量，進而提高糜子葉片光合作用，減輕苯唑·二甲鈉對葉片葉綠素的不利影響。

表2 糜子葉片葉綠素含量Table 2 Chlorophyll content of leaf of broomcorn millet

2.3 除草劑及安全劑對糜子葉片生理代謝的影響

2.3.1 糜子葉片活性氧代謝

由圖1a可知，各處理糜子葉片POD活性隨生育期推進呈先增加后減小的趨勢，在P4期POD活性達到最大值。M1 處理的POD 活性在 P1 期、P2 期有所上升，且高于CK2，在P3期緩慢上升但開始低于CK2；與M1處理相比，噴施蕓苔素內(nèi)酯處理的POD活性在各時期均有所提升。在P4期，M1S1、M1S2、M1S3處理的POD活性較M1處理分別提升了32.0%、40.1%、33.9%。

由圖1b 可知，各處理葉片SOD 活性隨生育進程推進呈先升高后降低的趨勢，在P4 期SOD 活性達到最大值。M1處理的SOD活性在各時期均為最低且大多時期顯著低于CK2；M1S1、M1S2、M1S3 處理的SOD活性均顯著高于M1處理且在P4期緩慢上升至峰值，較M1處理分別提高了10.8%、15.4%、8.7%，噴施中濃度蕓苔素內(nèi)酯的M1S2 處理的SOD 活性高于低濃度處理（M1S1）和高濃度處理（M1S3，<0.05）。

由圖1c 可知，各處理葉片CAT 活性隨生育進程推進呈先增加后減小的趨勢，在P4 期CAT 活性達到最大值。M1處理的CAT活性在各時期均最低且顯著低于CK2；M1S1、M1S2、M1S3處理的CAT活性在各時期均有所提高且顯著高于M1 處理（P1 期M1S1 除外）。在P4 期，M1S1、M1S2、M1S3 處理的CAT 活性較M1 處理分別提升了14.8%、33.3%、26.8%。除P2 期外，其余時期M1S2、M1S3 處理的CAT 活性均高于M1S1處理。

由圖1d 可知，各處理的糜子葉片MDA 含量隨生育進程推進呈逐漸增加的趨勢，在 P3 期、P4 期、P5 期上升迅速。M1 處理的葉片MDA 含量在各時期均顯著高于CK2，噴施蕓苔素內(nèi)酯處理的MDA 含量較M1處理均顯著下降，不同濃度蕓苔素內(nèi)酯處理間差異不顯著（P5 期除外）。M1S2 處理在 P2 期、P3 期及 P5 期的MDA 含量在3 個蕓苔素內(nèi)酯處理中最小，分別較M1 處理顯著下降了33.05%、28.48%、20.01%。說明苯唑·二甲鈉脅迫下噴施蕓苔素內(nèi)酯可顯著降低糜子葉片細胞內(nèi)的MDA 含量，緩解苯唑·二甲鈉脅迫造成的細胞膜脂過氧化，從而減小了苯唑·二甲鈉對糜子葉片細胞膜系統(tǒng)的傷害。

圖1 糜子葉片活性氧代謝Figure 1 Active oxygen metabolism in the leaves of broomcorn mille

2.3.2 糜子葉片GSH含量和GST活性

由圖2a 可知，隨著生育進程的推進，各處理葉片GSH 含量先升高后降低，在P4 期GSH 含量達到最大值。與CK2 相比，M1 處理在各時期的GSH 含量均顯著降低；M1S1、M1S2、M1S3 處理的 GSH 含量較 M1 處理均有不同程度的提高；M1S2、M1S3 處理的GSH 活性除P5 期外，其余時期均高于M1S1 處理。在P4 期，M1S1、M1S2、M1S3 處理較 M1 處理的 GSH 含量分別顯著提高了23.3%、30.8%、25.3%。

由圖2b 可知，各處理的糜子葉片GST 活性隨生育進程推進呈先升高后降低的趨勢，在P3 期GST 活性達到最大值。M1處理的GST活性在各時期均最低且大多時期顯著低于CK2；M1S1、M1S2、M1S3處理在各時期的GST 活性均顯著高于M1 處理；M1S2、M1S3處理在各時期的GST 活性均高于M1S1 處理。在P3期，M1S1、M1S2、M1S3 處理的 GST 活性較 M1 處理分別顯著升高了29.6%、52.4%、39.7%。

圖2 糜子葉片GSH含量和GST活性Figure 2 GSH content and GST activity of broomcorn millet leaves

2.4 除草劑及安全劑對糜子農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響

由表3 可知，M1 處理的株高、穗長顯著低于CK1，莖粗與CK1 無顯著差異。葉面噴施蕓苔素內(nèi)酯后，各處理的株高、莖粗均顯著高于M1 處理，穗長與M1處理無顯著差異，說明苯唑·二甲鈉脅迫顯著抑制了糜子的生長，葉面噴施不同濃度的蕓苔素內(nèi)酯能減輕除草劑對糜子株高和莖粗的不利影響。

由表3 還可以看出，CK1 的主穗質(zhì)量最大，達16.67 g；CK2 最小，僅為 8.49 g；M1 處理的主穗質(zhì)量小于 M1S1、M1S2、M1S3 處理，但無顯著差異。從產(chǎn)量來看，CK2產(chǎn)量最低，僅為962.50 kg·hm，CK1產(chǎn)量最高，達4 041.80 kg·hm，M1處理產(chǎn)量僅高于CK2，而低于噴施蕓苔素內(nèi)酯處理。M1S1、M1S2、M1S3 處理的產(chǎn)量均顯著高于CK2和M1處理，分別較M1處理增產(chǎn)8.5%、19.7%、11.4%。綜上可知，在苯唑·二甲鈉脅迫下，噴施不同濃度的蕓苔素內(nèi)酯均能使糜子株高、莖粗、穗長和主穗質(zhì)量增加，促進糜子正常生長發(fā)育，提高產(chǎn)量。

表3 糜子農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量Table 3 Agronomic traits and yield of broomcorn millet

3 討論

大量研究表明，植物在正常生長條件下活性氧（ROS）的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，脅迫可導致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，過多的ROS 打破了平衡狀態(tài)，使細胞膜質(zhì)過氧化作用增強，ROS 清除酶結(jié)構(gòu)受到破壞，導致細胞膜相對透性提高、生理代謝紊亂等不良反應。同時ROS 還會對葉綠體和線粒體等細胞器的功能造成損害，造成細胞凋亡，從而抑制作物正常的生長發(fā)育，此時植物可通過增加或激活抗氧化酶來防御ROS 對細胞造成的傷害。SOD 作為植物體內(nèi)ROS 清除系統(tǒng)中最有效的物質(zhì)，可使O轉(zhuǎn)化成HO，是抗氧化酶系統(tǒng)中的第一道防線，POD 和CAT則是細胞內(nèi)清除HO的關(guān)鍵酶。MDA 是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量可以反映膜脂的損傷。植物在受到脅迫時通常會提高抗氧化酶活性，增加MDA含量。本研究結(jié)果表明，苯唑·二甲鈉脅迫下糜子葉片在不同生育期的POD、SOD、CAT 活性均有所下降，MDA 含量顯著增加，說明藥害程度已經(jīng)超過了糜子本身的應激能力，糜子體內(nèi)的抗氧化酶（POD、SOD、CAT）不足以消除因脅迫產(chǎn)生的ROS，此時細胞中ROS 就會造成生物膜的過氧化損傷，細胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，細胞膜內(nèi)物質(zhì)外滲，導致MDA 含量增加，這與肖家昶等的研究結(jié)果相近。藥后噴施不同濃度的蕓苔素內(nèi)酯均提升了糜子葉片的POD、SOD、CAT 活性，同時顯著降低了MDA 含量，說明葉面噴施蕓苔素內(nèi)酯可提升糜子葉片細胞內(nèi)各抗氧化酶的合成能力，孫石昂等的研究也得出了類似結(jié)果。首先通過提高SOD 活性促進糜子葉綠體中水-水循環(huán)，使O轉(zhuǎn)化成 HO，接著提高 POD 和 CAT 活性，在過氧化物酶體中直接清除HO，三者協(xié)同運作，使自由基維持在一個較低的水平，維持苯唑·二甲鈉脅迫下糜子葉片細胞氧化還原的平衡，從而減輕苯唑·二甲鈉脅迫對糜子葉片細胞的傷害，維持細胞膜的穩(wěn)定性，進而降低了糜子葉片細胞內(nèi)的MDA 含量，有效緩解苯唑·二甲鈉脅迫對糜子葉片細胞膜的膜脂過氧化作用，提高糜子對苯唑·二甲鈉脅迫引起的氧化脅迫的抵抗能力。同時可減輕ROS 對糜子葉綠體與線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)的破壞，延緩葉綠素的分解，減輕苯唑·二甲鈉對糜子葉片光合作用及生長發(fā)育的抑制作用，有利于糜子葉片的生長及光合作用，最終促進了糜子產(chǎn)量的增加。

除草劑在植物體內(nèi)的一個重要降解途徑就是與GSH軛合，再通過體內(nèi)的運輸系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)運到細胞外或液泡內(nèi)，從而避免除草劑對作物的傷害。這一軛合反應在植物體內(nèi)是受GST催化完成的，因此作物體內(nèi)的GSH 含量和GST 活性在一定程度上決定著其對除草劑的解毒程度。本研究結(jié)果表明，苯唑·二甲鈉脅迫下糜子葉片在不同生育期的GSH 含量和GST 活性均顯著降低，藥后噴施蕓苔素內(nèi)酯可顯著提高糜子葉片的GSH 含量和GST 活性，有效緩解了苯唑·二甲鈉對糜子的藥害。說明蕓苔素內(nèi)酯緩解糜子苯唑·二甲鈉藥害的作用機理可能是通過促進糜子葉片細胞內(nèi)GSH 含量的增加及GST 酶活性的提高，從而催化并提升了苯唑·二甲鈉在糜子體內(nèi)的代謝速率，促進苯唑·二甲鈉與GSH 形成無毒性的軛合物排至細胞外或液泡內(nèi)，從而達到緩解苯唑·二甲鈉藥害的效果，這與趙穎楠的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

（1）在0.6 kg·hm苯唑·二甲鈉脅迫下噴施0.06~0.10 mg·L的蕓苔素內(nèi)酯可有效緩解苯唑·二甲鈉對糜子的傷害，使糜子葉片葉綠素含量、株高、莖粗、穗長和穗質(zhì)量增加，促進糜子的生長發(fā)育及葉片的光合作用，顯著提高糜子產(chǎn)量。

（2）蕓苔素內(nèi)酯緩解糜子苯唑·二甲鈉藥害的部分機理是通過提高糜子葉片抗氧化酶的酶活性來清除活性氧，維持苯唑·二甲鈉脅迫下糜子葉片細胞氧化還原的平衡；同時促進還原型谷胱甘肽含量的增加及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的提高，催化并加快苯唑·二甲鈉在糜子體內(nèi)的代謝速率，促進苯唑·二甲鈉與還原型谷胱甘肽形成無毒性的軛合物。