槲皮素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

林雪梅 王小林 唐春紅

[摘要]目的探討棚皮素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分成三組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+棚皮素組。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻斷局灶性腦缺血模型，缺血2 h，再灌注24 h;假手術(shù)組僅暴露左側(cè)頸總動脈后縫合。缺血再灌注+棚皮素組大鼠在缺血30 min后腹腔注射棚皮素50 mg/kg，假手術(shù)組及缺血再灌注組大鼠按相同方式給予等體積溶劑。再灌注24 h后評價大鼠神經(jīng)功能狀態(tài)、腦組織含水量，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，制備腦組織勻漿并測定腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。結(jié)果腹腔注射棚皮素后，大鼠神經(jīng)功能評分降低、腦組織含水量下降、腦組織內(nèi)SOD活性增加、MDA含量降低、腦組織損害減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論棚皮素可通過調(diào)節(jié)抗氧化途徑保護(hù)腦缺血再灌注引起的神經(jīng)損傷。

[關(guān)鍵詞]缺血再灌注;抗氧化;槲皮素;神經(jīng)保護(hù)

[中圖分類號]R285.5??? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0024-04

Protective effect of quercetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

LIN Xuemei1，2??? WANG Xiaolin1，2??? TANG Chunhong2

1. Section of Pathology Teaching and Research，North Sichuan Medical College，Sichuan，Nanchong 637000，China;2. Department of Pathology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Sichuan，Nanchong 637000，China

[Abstract]Objective To investigate the protective effect and mechanism of quercetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods A total of 54 male SD rats were randomly divided into 3 groups，which were the sham operation group，the ischemia-reperfusion group，and the ischemia-reperfusion plus quercetin group. The model of focal cerebral ischemia in rats with middle cerebral artery occlusion was made by suture method，and the model was ischemia for 2 h and reperfusion for 24 h. In the sham operation group，only common carotid artery was exposed and sutured. Rats in the ischemia-reperfusion plus quercetin group were injected with quercetin 50 mg/kg intraperitoneally after ischemia for 30 min，while rats in the sham operation group and the ischemia-reperfusion group were treated with the same volume of solvent in the same way. 24 h after reperfusion，the neurological function and water content of brain tissue were evaluated，the morphological changes of brain tissue were observed，the homogenate of brain tissue was prepared，and the activity of superoxide dismutase （SOD）and the contents of malondialdehyde （MDA）in brain tissue were detected. Results After intraperitoneal injection of quercetin，the neurological function score of rats decreased，the water content of brain tissue descended，the activity of SOD in brain tissue increased，the content of MDA decreased and the damage of brain tissue alleviated，with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Quercetin can protect neurological injury caused by cerebral ischemia-reperfusion by regulating antioxidant pathway.

[Key words]Ischemia-reperfusion;Antioxidant;Quercetin;Neuroprotection

缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷是指器官血流減少或中斷，隨后血流再灌注及細(xì)胞復(fù)氧，從而引起組織細(xì)胞損傷[1-2]，這一損傷過程涉及氧自由基的生成[3]、鈣離子內(nèi)流[4]、補(bǔ)體激活[5]、toll樣受體激活和炎癥反應(yīng)[6-9]等多種復(fù)雜機(jī)制。槲皮素作為一種強(qiáng)自由基清除劑[10]，不斷地被用于全身各器官缺血再灌注損傷模型保護(hù)性研究，包括心、肝、腎、睪丸、骨骼肌等[11]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過多種途徑發(fā)揮腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用，包括激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]、減少白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥遞質(zhì)抑制炎癥反應(yīng)[13]、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP-9）維持血腦屏障完整性[14]及以提高腦組織內(nèi)硫氧還蛋白含量發(fā)揮抗氧化應(yīng)激[15]等。雖然槲皮素已經(jīng)被運(yùn)用于腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究，但相關(guān)治療臨床前研究指南指出，在腦缺血性損傷的藥物研究中應(yīng)選擇多重指標(biāo)[16]。故本研究采用局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察槲皮素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1??? 材料與方法

1.1??? 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑

雄性SD大鼠由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，重量為250～300 g。槲皮素購自美國Sigma-Aldrich，純度≥98%。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2??? 藥物和實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備

雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分成三組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+槲皮素組，每組各18只。將槲皮素溶解于二甲基亞砜，配制藥物濃度50 mg/ml備用。按50 mg/kg劑量在缺血30 min后經(jīng)腹腔注射給予缺血再灌注+槲皮素組大鼠藥物，假手術(shù)組和缺血再灌注組則按相同方式給予等體積溶劑。

1.3??? 動物模型的制備

用線栓法制備動物模型。用石蠟包裹、頭端呈梭形的0.24 mm魚線做線栓。術(shù)前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射0.35%水合氯醛麻醉（0.1 ml/kg）大鼠，暴露左側(cè)頸總動脈，在頸總動脈壁剪一破口，線栓經(jīng)破口插入頸內(nèi)動脈，過頸動脈分叉處繼續(xù)進(jìn)線約2 cm時稍感阻力，提示線栓已經(jīng)到達(dá)左側(cè)大腦中動脈并阻斷大鼠左側(cè)大腦中動脈血流，造成大鼠左側(cè)腦組織缺血性損傷。隨即將線栓固定在頸總動脈，縫合傷口。栓塞缺血2 h后退出線栓再灌注24 h。假手術(shù)組大鼠僅暴露左側(cè)頸總動脈后縫合。

1.4??? 神經(jīng)功能評分

再灌注24 h后，根據(jù)Zea-longa評分標(biāo)準(zhǔn)[15]觀察大鼠行為學(xué)變化并評分：無神經(jīng)缺損癥狀為0分;不能伸展右側(cè)前爪為1分;行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分;行走時向右側(cè)傾倒為3分;不能自發(fā)行走，意識喪失為4分。1～3分為有效模型。

1.5??? 腦組織含水量測定

每組6只，大鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，去除腦表面的硬脊膜、小腦及腦干部分，立即用微量精密天平稱取大腦組織重量，然后放入烘箱，80℃烘72 h至恒重，稱取干重。腦含水量=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%。

1.6??? 大鼠腦皮質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察

每組6只，大鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，10%福爾馬林溶液固定24 h，取材、固定、脫水、包埋、3 μm切片后行蘇木素-尹紅染色。

1.7??? 腦組織內(nèi)SOD活性及MDA含量測定

每組6只，大鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，剪取少量顏色晦暗、腫脹區(qū)域（即梗死區(qū)）腦組織稱重，然后置于勻漿器中進(jìn)行手工勻漿，制備10%腦組織勻漿，2000 r/min離心15 min，取其上清液，參照南京建成生物技術(shù)有限公司試劑盒操作說明檢測腦組織勻漿中SOD活性及MDA含量。

1.8??? 統(tǒng)計學(xué)處理

2??? 結(jié)果

2.1??? 槲皮素對各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦組織含水量的影響

與缺血再灌注組比較，腹腔注射50 mg/kg槲皮素能顯著降低大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2??? 槲皮素對各組大鼠腦組織SOD活性及MDA含量的影響

與缺血再灌注組比較，腹腔注射50 mg/kg槲皮素能顯著提高腦組織內(nèi)SOD活性及降低MDA含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

2.3??? 槲皮素對各組大鼠腦皮質(zhì)形態(tài)學(xué)改變的影響

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞排列整齊、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、組織間質(zhì)均勻紅染無異常。缺血再灌注組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂、可見核固縮及細(xì)胞水腫、組織間質(zhì)內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松淡染、并見小空泡。與缺血再灌注組比較，腹腔注射50 mg/kg槲皮素后，大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多、密度增加，發(fā)生核固縮和水腫的細(xì)胞數(shù)量均減少，組織間質(zhì)水腫程度減輕。見圖1。

3??? 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于各種蔬菜水果中，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗感染、抗腫瘤、擴(kuò)張血管、治療代謝性和心血管疾病等多種藥用價值[17]。研究表明其對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，但根據(jù)相關(guān)治療臨床前研究指南，在腦缺血性損傷的藥物研究中除了選擇多重指標(biāo)外，其評價應(yīng)包括組織和行為學(xué)結(jié)果[16]。發(fā)生腦缺血再灌注時，血管通透性增強(qiáng)，血管源性腦水腫形成;隨著細(xì)胞復(fù)氧，線粒體功能受損，活性氧生成增加，從而誘導(dǎo)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞水腫、凋亡甚至梗死[18]，故而動物可出現(xiàn)一系列異常的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。因此，本研究量化統(tǒng)計大鼠神經(jīng)功能評分、評價腦組織含水量、觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，可以反映大鼠腦缺血再灌注的損傷程度。

與缺血再灌注組比較，腹腔注射槲皮素后，大鼠神經(jīng)功能評分和腦組織含水量均明顯下降。提示槲皮素能改善腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)功能損害及腦水腫。此外，發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，腦組織損傷體現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少、核固縮、細(xì)胞水腫，腦組織間質(zhì)內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松淡染及小空泡形成。而腹腔注射槲皮素后，腦皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多、密度增加、核固縮和水腫細(xì)胞數(shù)量均減少，腦組織間質(zhì)水腫程度減輕，這些形態(tài)學(xué)改變與大鼠的神經(jīng)功能評分及腦組織含水量改變趨勢是一致的，提示槲皮素可減輕腦缺血再灌注損傷引起的損傷。

腦缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，其中內(nèi)源性抗氧化因子減少、氧自由基增加以及隨后的氧化應(yīng)激被認(rèn)為在缺血再灌注中起著關(guān)鍵作用。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物，包括MDA、酮基、羥基等。因此，MDA含量高低可反映脂質(zhì)過氧化程度。而SOD可通過歧化反應(yīng)清除體內(nèi)生成的氧自由基、阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[19]，其活性高低可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。與缺血再灌注組比較，本研究結(jié)果提示，槲皮素能顯著提高SOD活性、降低MDA含量，提示槲皮素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制可能與其抗氧化特性有關(guān)。

綜上所述，槲皮素可改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后引起的神經(jīng)功能損害，減輕腦水腫及腦組織損害程度，提高內(nèi)源性抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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