奶牛乳房炎6種主要致病菌多重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

謝玉杰，高 瑞，繆西鵬，趙 輝，姜興佳，牛耀祖，許立華

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏威科嘉動(dòng)物科技有限公司，寧夏 銀川 750021）

自我國(guó)實(shí)施奶業(yè)振興戰(zhàn)略以來，在國(guó)家政策的大力支持下，奶產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出蓬勃發(fā)展的勢(shì)頭，2020年我國(guó)牛奶年產(chǎn)量達(dá)3440.1萬t[1]。伴隨著奶牛業(yè)的發(fā)展，奶牛乳房炎一直是影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)最常見的感染性疾病之一。奶牛乳房炎通常是指奶牛乳腺組織受到微生物感染、物理或化學(xué)刺激而引起的一種炎性病變，導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降與生產(chǎn)性能喪失等一系列問題，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。全球1/3的奶?；加腥榉垦?，我國(guó)奶牛乳房炎的發(fā)病率高于30%[3]。致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、牛支原體、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌等是引起乳房炎最主要的幾種病原菌[4-5]。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法具有操作相對(duì)繁瑣、檢測(cè)周期較長(zhǎng)、陽性檢測(cè)率低等問題，制約了對(duì)乳房炎致病菌的檢出率，從而影響了奶牛乳房炎的早期預(yù)防和治療[6]。為了及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷病原性奶牛乳房炎，減少奶牛乳房炎給奶牛養(yǎng)殖業(yè)上帶來的損失，本研究建立了奶牛乳房炎主要致病菌6重PCR檢測(cè)方法，用以檢測(cè)奶牛乳房炎的主要致病菌，并為其早期診斷治療及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株及乳樣 金黃色葡萄球菌（ATCC29313）、無乳鏈球菌（ATCC13813）、綠膿桿菌（CVCC3359）、停乳鏈球菌（ATCC12388）、致病性大腸桿菌（ATCC35150）、多殺性巴氏桿菌(CVCC447)、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）、糞腸球菌（ATCC29212）、白色念珠球菌（ATCC90028）、牛支原體均由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)試鑒定保存。所用檢測(cè)乳樣取自寧夏地區(qū)部分牧場(chǎng)乳房炎病例。

1.1.2主要設(shè)備及試劑 PCR擴(kuò)增儀為C1000Touch；凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)為Gel Doc XR+，均購自于BIORAD公司；DL2000 DNA MARKER購自于TaKaRa公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司；PerfectStart Taq DNA Polymerase（含2.5 mM dNTPs）購自于全式金公司；omega柱式E.Z.N.A. Food DNA Kit基因組DNA抽提試劑盒購自于OMEGA公司；PPLO Broth、PPLO Agar購自于BD Difco公司。伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基粉末、NAC瓊脂培養(yǎng)基粉末、NAC液體培養(yǎng)基粉末BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基粉末、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(第二代）、NB肉湯培養(yǎng)基粉末、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)、凍干兔血漿、精氨酸雙水解酶（綠膿桿菌）、氧化酶試紙片、均購自于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成 使用Primer Premier 5軟件，以GeneBack中已發(fā)布的金黃色葡萄球菌的nuc基因、無乳鏈球菌的ef-tu基因、綠膿桿菌的eta基因、停乳鏈球菌的16srRNA基因、致病性大腸桿菌的Phoa基因、牛支原體的oppD/F基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)6對(duì)引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列信息見表1。

表1 PCR引物序列信息

1.2.2核酸的提取 標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)后，使用天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取1mL菌液細(xì)菌的核酸，具體操作參照說明書。

1.2.3各病原菌單一PCR檢測(cè)方法的建立 分別以6種細(xì)菌的核酸作為模板，進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件（50μL）：DNA模板1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，Taq酶1μL，10×PerfectStartTMTaq Buffer 5μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4μL，ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58.3℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。

1.2.4多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 以6種細(xì)菌的核酸等體積混合液作為模板，對(duì)PCR反應(yīng)的退火溫度由50~60℃設(shè)定為8個(gè)梯度，分別為60、59.4、58.3、56.3、53.9、52、50.7和50℃；引物終濃度由0.2~1.0μmol/L每0.2μmol/L依次遞增，共設(shè)5個(gè)梯度；Mg2+濃度由2~5mmol/L每0.5 mmol/L依次遞增，共設(shè)7個(gè)梯度；酶濃度由0.5 U~2.5 U每次0.5 U依次遞增，共設(shè)5個(gè)梯度，利用矩陣法篩選以上反應(yīng)條件，以確定最佳反應(yīng)程序及體系。

1.2.5多重PCR特異性試驗(yàn) 分別用牛支原體、致病性大腸桿菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌及6種核酸等體積混合液作為特異性試驗(yàn)的模板，利用優(yōu)化后的多重PCR檢測(cè)方法對(duì)多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌、白色念珠球菌的核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，并用ddH2O作為陰性對(duì)照，以確定方法的特異性。

1.2.6多重PCR敏感性試驗(yàn) 使用微孔板分光光度計(jì)分別測(cè)定牛支原體、致病性大腸桿菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的核酸濃度，將各細(xì)菌核酸濃度統(tǒng)一稀釋到10ng/μL，再10倍倍比稀釋各細(xì)菌核酸，以各梯度核酸及6種核酸等體積混合液作為模板，分別用優(yōu)化后的單一PCR和多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行反應(yīng)，以檢測(cè)單一PCR方法和多重PCR方法的最低檢測(cè)限。

1.2.7多重PCR重復(fù)性試驗(yàn) 將一次提取好的6種細(xì)菌的核酸等體積混合液分為4份分別作為模板，用優(yōu)化后的多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)模板每隔1周進(jìn)行1次試驗(yàn)，重復(fù)檢測(cè)4次。

1.2.8多重PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 用omega柱式E.Z.N.A.Food DNA Kit基因組DNA抽提試劑盒對(duì)寧夏地區(qū)98份臨床乳房炎病例乳樣各0.5 mL進(jìn)行核酸的提取，用優(yōu)化后的多重PCR進(jìn)行檢測(cè)，并與單一PCR檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)照。此外，將檢測(cè)結(jié)果為陽性的乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離與純化并按照國(guó)標(biāo)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)β型溶血性鏈球菌檢驗(yàn)》、進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)《進(jìn)出口食品綠膿桿菌檢測(cè)方法》以及農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《牛支原體PCR檢測(cè)方法》中所描述的試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 單一PCR檢測(cè)方法的建立

分別以6種細(xì)菌的核酸為模板進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增后，牛支原體、致病性大腸桿菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌分別在相應(yīng)位置擴(kuò)增出與目的條帶大小相符的特異性條帶，ddH2O陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶。

2.2 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

以1.2.4中的條件進(jìn)行6重PCR優(yōu)化，結(jié)果顯示最佳退火溫度為58.3°C（圖1）、引物終濃度為金黃色葡萄球菌為和停乳鏈球菌0.6μmol/L、無乳鏈球菌和綠膿桿菌為0.2μmol/L、致病性大腸桿菌和牛支原體為1μmol/L（圖2）、酶濃度為2.5 U、Mg2+濃度3 mmol/L。反應(yīng)條件（50μL）：核酸混合液1μL，各病原上下游引物各1μL，Taq酶1μL，10×Perfect－StartTMTaq Buffer 5μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4μL，ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s,58.3℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。

圖1 6重PCR退火溫度優(yōu)化

2.3 單一PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)

單一PCR檢測(cè)方法均可擴(kuò)增出特異性的目的片段，對(duì)于殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌、白色念珠球菌的核酸和ddH2O作為模板均未擴(kuò)增出條帶，表明建立的單一PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性。

2.4 多重PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)

所建立的6重PCR檢測(cè)方法針對(duì)牛支原體、致病性大腸桿菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌能擴(kuò)增出特異性的目的片段，其他參考細(xì)菌都沒有擴(kuò)增出條帶（圖2），表明該6重PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性。

圖2 多重PCR特異性試驗(yàn)

2.5 單一PCR檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)

使用微孔板分光光度計(jì)分別測(cè)定6種細(xì)菌的核酸濃度分別為130.6、115.0、166.9、96.4、80.24、150.41 ng/μL，將各細(xì)菌核酸濃度統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL，再對(duì)每種病原菌的核酸進(jìn)行梯度稀釋，根據(jù)相關(guān)公式換算為拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，單一PCR檢測(cè)方法對(duì)牛支原體、致病性大腸桿菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的最低檢測(cè)限分別為6.6×103、8.5×105、1×103、1.8×105、2.3×103和4.38×104拷貝/μL。結(jié)果表明這6種PCR檢測(cè)方法有較好的敏感性。

2.6 多重PCR檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)

將各細(xì)菌核酸濃度統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL，再對(duì)6種核酸等體積混合液進(jìn)行梯度稀釋，根據(jù)相關(guān)公式將6種核酸等體積混合液換算為拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，多重PCR檢測(cè)方法最低檢測(cè)限分別為1.1×105、1.41×106、1.6×103、3×105、3.8×104和7.3×103拷貝/μL。結(jié)果表明該方法敏感性較高。

2.7 多重PCR重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的多重PCR檢測(cè)方法，每隔1周分別對(duì)提取好的6種細(xì)菌的核酸等體積混合液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：4次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，都能擴(kuò)增出相應(yīng)特異性片段（圖3）。表明此方法具有較好的重復(fù)性。

圖3 多重PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

2.8 多重PCR臨床檢測(cè)試驗(yàn)

用建立的多重PCR檢測(cè)方法對(duì)98份臨床乳房炎乳樣進(jìn)行檢測(cè)。其中多重檢測(cè)牛支原體、致病性大腸桿菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的檢出率分別為10.2%（10/98）、14.2%（14/98）、14.2%（14/98）、12.2%（12/98）、18.3%（18/98）、18.3%（18/98）。其中有20份樣品檢測(cè)出1種病原菌感染（檢出率為20.4%），16份樣品檢測(cè)出2種病原菌感染（檢出率為16.3%），6份樣品檢測(cè)出3種病原菌感染（檢出率為6.1%），4份樣品檢測(cè)出4種病原菌感染（檢出率為4%）。與單一PCR結(jié)果進(jìn)行對(duì)比符合率分別為100%、100%、92%、91.6%、88%、94%（表2）。此外經(jīng)典試驗(yàn)方法對(duì)多重PCR結(jié)果陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果與多重PCR結(jié)果一致。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

奶牛乳房炎是世界奶業(yè)最常見和最具有挑戰(zhàn)性的奶牛疾病之一。其病因是易感動(dòng)物、病原微生物、環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。長(zhǎng)久以來，奶牛乳房炎給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，世界各國(guó)都力圖找到有效控制乳房炎的方法和措施。Oliveira[7-8]等人利用分子印跡技術(shù)檢測(cè)乳房炎中的葡萄球菌、致病性大腸桿菌、鏈球菌等致病菌。由于奶牛乳房炎病因復(fù)雜，傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法可獲得當(dāng)?shù)亓餍芯?，并且具有高穩(wěn)定性、成本低和可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)[9]。但乳房病原菌種類繁多，分離培養(yǎng)過程繁瑣、周期性長(zhǎng)，通常需要數(shù)周時(shí)間才能確診，并不適用于臨床快速診斷。相比之下，使用PCR診斷可確?？焖佾@得結(jié)果，并提高靈敏度，是公認(rèn)的可以有效檢測(cè)臨床奶牛乳房炎中無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌等病原菌的方法之一[10]。有研究指出乳房炎病例的早期發(fā)現(xiàn)可提高60%的治愈率[11]。

本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確鑒定出乳房炎病牛牛奶中的這6種病原菌。在特異性方面，采用該方法檢測(cè)乳房炎中多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌、白色念珠球菌，結(jié)果呈陰性。證明該多重PCR方法具有較好的特異性。在敏感性方面，牛支原體、致病性大腸桿菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌在單一PCR敏感性試驗(yàn)中，最低終濃度分別為6.6×103、8.5×105、1×103、1.8×105、2.3×103和4.38×104拷貝/μL，在多重PCR敏感性試驗(yàn)中最低終濃度分別為1.1×105、1.41×106、1.6×103、3×105、3.8×104和7.3×103拷貝/μL。與夏穎[12]建立的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、綠膿桿菌的三重PCR和陳亞明[13]建立的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的三重PCR的診斷方法相比，本研究所建立的方法檢測(cè)的細(xì)菌種類更多，在敏感性方面比夏穎建立的多重PCR最低模板終濃度10-3mg/L略低；與陳亞明多重PCR最低模板終濃度10 pg/μL相比，敏感性基本一致。Ashraf等人[14]建立了9種乳房炎病原菌的多重PCR方法，該方法雖然特異性強(qiáng)，敏感性達(dá)到50 pg/μL，但操作難度高且不易推廣。多重PCR敏感性相比于單一PCR有所下降，這可能是多重PCR引物之間形成了二聚體,影響了模板DNA與引物的有效結(jié)合,導(dǎo)致多重PCR擴(kuò)增效率下降。

本研究建立的多重PCR臨床檢測(cè)結(jié)果顯示，98份臨床樣品中有46份乳樣檢測(cè)到病原菌，其中多重感染的乳樣為26份，占臨床樣品的56.5%，表明寧夏地區(qū)奶牛乳房炎感染病例中多重感染占大多數(shù)，證明了該方法具有臨床應(yīng)用意義。該方法為奶牛乳房炎主要病原菌的診斷提供了有力技術(shù)支撐,對(duì)奶牛乳房炎的綜合防治產(chǎn)生積極作用。