應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對豬肉中3種β-受體激動(dòng)劑殘留檢測與分析

曹忠君 盛常哲

摘要：本文建立了高效、準(zhǔn)確的測定豬肉樣品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法。應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對來自市場中120批次豬肉樣品進(jìn)行3種β-受體激動(dòng)劑殘留的檢測。結(jié)果顯示，3種β-受體激動(dòng)劑殘留在豬肉中的平均回收率均為76.3%～94.5%。體現(xiàn)該方法具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，符合獸藥殘留分析檢測的要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法；β-受體激動(dòng)劑；豬肉

β-受體激動(dòng)劑是一類能夠和腎上腺素β受體相結(jié)合、并能夠激動(dòng)受體產(chǎn)生分泌腎上腺素樣作用的藥物。常用的藥物有克倫特羅、多巴酚丁胺、萊克多巴胺、沙美特羅、沙丁胺醇、福莫特羅等藥物，這些藥物通過作用β受體，從而有舒張支氣管的作用，常用來治療緩解慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等引起的支氣管痙攣或收縮，緩解呼吸困難、胸悶氣喘等病癥。β-受體激動(dòng)劑其化學(xué)性質(zhì)不易變化。醫(yī)學(xué)研究表明，β-受體激動(dòng)劑吸收快，人食用了含其藥物的內(nèi)臟或肉，會造成群體性的惡性食物中毒事故。人食用后15～20分鐘起作用，2～3小時(shí)血漿的濃度將達(dá)到峰值，體內(nèi)存留時(shí)間較長。一般攝入20微克就可以出現(xiàn)心慌、嘔吐、震顫等臨床表現(xiàn)，中毒嚴(yán)重的可致人死亡。但近些年來，由于人們發(fā)現(xiàn)將其應(yīng)用在畜牧生產(chǎn)中，提高瘦肉率，特別是改進(jìn)脂肪型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的肌肉與脂肪的比例（據(jù)有關(guān)報(bào)道可增加瘦肉率10%～20%）。因此，為降低飼養(yǎng)成本以達(dá)到謀取暴利的目的，國內(nèi)一些牛、豬、羊飼養(yǎng)戶在飼料中任意濫喂“瘦肉精”（β-受體激動(dòng)劑），促使育肥的家畜提高瘦肉率。因此，β-受體激動(dòng)劑常常殘留在經(jīng)濟(jì)動(dòng)物體內(nèi)，從而影響人們身體健康。

目前測定食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的檢測方法眾多，而液相—色譜質(zhì)譜法具有靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前最有說服力的確證方法。本研究旨在驗(yàn)證液相—色譜質(zhì)譜法檢測豬肉中最常見的克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺3種β-受體激動(dòng)劑殘留的可行性。同時(shí)了解、調(diào)查了解某城市市場中豬肉中β-受體激動(dòng)劑殘留的實(shí)際現(xiàn)狀，為農(nóng)業(yè)和市場管理部門治理食品安全等現(xiàn)象提供參考。

1.1 儀器和設(shè)備

TQD型液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源；HY-4型調(diào)速振蕩器；高速冷凍離心機(jī)；DKZ-3型恒溫振蕩水槽；ReekoMP-48型全自動(dòng)固相萃取裝置；MCX固相萃取柱（60毫克/3毫升）；CM-36型全自動(dòng)水浴加熱氮吹儀，連接純度99.9%以上的高純氮?dú)?；KQ-250DB型全自動(dòng)數(shù)控超聲波清洗器；CP225D型高精度電子分析天平（感量：0.00001克）；waters C18（2.1毫米×100毫米，1.7微米）超高效色譜柱；普蘭德公司生產(chǎn)的移液器（10毫升、1000微升、250微升、50微升4種規(guī)格）。

1.2 試劑和材料

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol Hydrochloride，濃度值：98.0%，規(guī)格：100毫克/瓶）（壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate，濃度值：98.0%，規(guī)格：100毫克/瓶）（壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），鹽酸萊克多巴胺（Ractopamine hydrochloride，濃度值：95.4%，規(guī)格：100毫克/瓶）（壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），分析純乙酸銨、高氯酸（濃度：70%～72%）、叔丁基甲醚（分析純）、乙酸乙酯（分析純），分析純氫氧化鈉，色譜純乙腈，色譜級甲酸（濃度≥99%），β-鹽酸葡萄糖醛苷酶（β-克lucuronidase，2毫升，Merck 克ermany），色譜純甲醇，優(yōu)級純氫氧化鈉，水為二次蒸餾水，50毫升聚乙烯離心管、0.2微米微孔濾膜（可應(yīng)用于無機(jī)相）。120批次豬肉樣品，分別于2018～2021年在多個(gè)市場隨機(jī)抽取，樣品編號為，PM/ SY001～PM/SY120。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品及溶液配置 使用感量為0.00001克的天平精確稱量克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺各0.01000克，用甲醇溶解定容至100毫升容量瓶中，使其濃度分別為，100微克/毫升的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存在-20℃的冰箱中，有效期為6個(gè)月。應(yīng)用移液器分別準(zhǔn)確吸取1000微升的克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液至同一100毫升容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，使其濃度為1微克/毫升的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存在-20℃的冰箱中，有效期為6個(gè)月。

乙酸銨緩沖液（0.2摩爾/升）：稱取15.4克乙酸銨，溶解于1升水中，用乙酸調(diào)pH至5.2即得。10摩爾/升氫氧化鈉溶液：稱取400.0克氫氧化鈉加水溶解稀釋至1000毫升即得。0.1摩爾/升高氯酸溶液：量取8.50毫升高氯酸加水溶解稀釋至1000毫升即得。2%甲酸水溶液：準(zhǔn)確量取2毫升甲酸加水定容至100毫升即得。3%氨水甲醇溶液：準(zhǔn)確量取3毫升氨水應(yīng)用甲醇定容至100毫升即得。甲醇0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）：分別準(zhǔn)確量取10毫升甲醇和90毫升0.1%甲酸溶液混合均勻即得。

1.3.2 樣品處理及提取應(yīng)用絞肉機(jī)將約200克豬肉樣品全部充分絞碎成肉泥狀，精密量取兩份2±0.05克平行肉樣分別至50毫升聚乙烯離心管中，同法另取空白樣品兩份，其中一份為空白對照樣品，另一份為添加3種β-受體激動(dòng)劑的質(zhì)控樣品。每個(gè)離心管添加8.0毫升乙酸銨溶液（0.2摩爾/升），再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶40微升，混合均勻，于37℃下避光恒溫水浴振蕩16小時(shí)以上。

酶解后恢復(fù)至室溫，充分渦旋混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心10分鐘以上，傾出上清液導(dǎo)入至另一50毫升離心管內(nèi)，加入0.1摩爾/升高氯酸溶液5毫升，充分渦旋混勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH至1.0，10000轉(zhuǎn)/分鐘以上高速離心10分鐘后，將上清液移取至另一50毫升離心管中。用10摩爾/升氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.5±0.2，加入15毫升乙酸乙酯，充分渦旋混勻后，再混合10分鐘以上，10000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心5分鐘以上，移取上層有機(jī)相到另一個(gè)50毫升離心管中。再在下層水相中精準(zhǔn)加入叔丁基甲醚10毫升，充分渦旋混勻后，再振蕩10分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心5分鐘，合并有機(jī)相，55℃氮?dú)獯蹈?，用甲酸水溶液?%）5毫升充分溶解，備用。

1.3.3 凈化 MCX固相萃取柱（60毫克/3毫升）按說明書活化，取所有備用液過柱，再淋洗，徹底抽干，用3.0毫升3%氨化甲醇溶液洗脫；洗脫液在55℃下用氮吹儀吹干。殘余物用0.5毫升甲醇0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）溶解，充分混合混勻，過0.22微米水相微孔濾膜，供上機(jī)檢測。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：waters C18（1.7微米，2.1毫米×100毫米）色譜柱或相當(dāng)者；流動(dòng)相：A通道為0.1%甲酸水溶液，B通道使用100%乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1；流速：0.40毫升/分鐘；進(jìn)樣體積：5～10微升。

1.3.5 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件不同型號儀器略有差別，應(yīng)調(diào)試到最佳狀態(tài)再進(jìn)行檢測，定量離子對、定性離子對和對應(yīng)儀器條件參考值見表2。

2.1 計(jì)算公式

試樣中β-受體激動(dòng)劑含量X，單位為微克/公斤，按如下公式計(jì)算。

X=A×Cs/V/As/M/1000

式中：A—試樣溶液中β-受體激動(dòng)劑的峰面積；As—標(biāo)準(zhǔn)溶液中β-受體激動(dòng)劑的峰面積；Cs—標(biāo)準(zhǔn)工作液β-受體激動(dòng)劑的濃度（微克/毫升）；V—最終殘留物洗脫液體積（毫升）；M—樣品的重量（克）。

2.2 方法回收率

每次實(shí)驗(yàn)做1批次空白樣及1批次質(zhì)控樣。

其回收率公式如下：

RC=質(zhì)控樣測定值/質(zhì)控樣添加值×100%

應(yīng)用本方法β-受體激動(dòng)劑在豬肉中的檢出限為0.25微克/公斤，定量限為0.5微克/公斤，本研究共進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)10批次樣品，空白添加三種β-受體激動(dòng)劑濃度為：10.0納克/克，其回收率均在76.3%～94.5%，說明其樣品處理科學(xué)合理、凈化效率高，待測組分損失小。

2.3 色譜圖分析

由圖1、圖2可以看出沙丁胺醇、克倫特羅和萊克多巴胺分離完全，峰型良好，出峰時(shí)間合適，信噪比理想。說明該方法色譜柱效能高，色譜條件合適，流動(dòng)相選擇配比合理，能夠很好的分離檢測待測組分。

2.4 樣品結(jié)果分析

從表3可以看出，100批次豬肉樣品共有10批次檢出有β-受體激動(dòng)劑殘留，檢出率8.3%。其中克倫特羅被檢測出6批次，檢出率最高，使用最多，萊克多巴胺被檢出1批次，檢出率最低，使用最少，但均未達(dá)到定量限，說明待售動(dòng)物都執(zhí)行了休藥期的規(guī)定，但存在濫用β-受體激動(dòng)劑現(xiàn)象。我國農(nóng)業(yè)部于2019年12月27日發(fā)布了第250號公告，其中，β-興奮劑（β-a克onists）類及其鹽、酯在清單之列，故針對“瘦肉精”問題進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管勢在必行。

作者簡介：曹忠君（1979-），男，碩士，高級畜牧師。主要從事畜產(chǎn)品藥物殘留檢驗(yàn)檢測工作。