基于代謝組學(xué)的南方菟絲子和金燈藤質(zhì)量比較研究

韓 穎，徐金娣，孔 銘，朱 賀，周姍姍，周桂榮，李松林，毛 茜*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥質(zhì)量研究室，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院/中國中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院中藥代謝組研究室，江蘇 南京 210028；3.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點實驗室，天津 300410）

菟絲子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，其性甘、溫，歸腎、肝、經(jīng)，具有滋補腎肝、固精縮尿、安胎、明目、止瀉之功效［1］。臨床用于治療肝腎不足，腰膝酸軟，陽痿遺精等癥。2020版《中國藥典》中規(guī)定菟絲子的法定基原為南方菟絲子（Cuscuta austra?lisR.Br.）或菟絲子（Cuscuta chinensisLam.）的干燥成熟種子。除藥典的收載品種外，同屬植物金燈藤（Cuscuta japonicaChoisy）的成熟干燥種子也作為菟絲子在我國南方地區(qū)使用［2-3］，并收載于《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》和《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》［4-5］中?，F(xiàn)代植化研究表明，南方菟絲子和菟絲子中含有黃酮類、有機酸類等化合物［6-8］，而金燈藤中含有豐富的有機酸［9］。相關(guān)文獻表明菟絲子具有保肝活性、抗骨質(zhì)疏松、免疫［6］等作用，金燈藤具有改善學(xué)習(xí)和記憶［10］、抑制黑色素形成［11］、抗流感病毒［12］等作用。然而，當(dāng)前對菟絲子和其地方習(xí)用品種金燈藤缺少系統(tǒng)的化學(xué)成分比較研究。藥典以金絲桃苷的含量作為菟絲子的質(zhì)控指標(biāo)，難以對不同基原的菟絲子進行全面的質(zhì)量評價；同時菟絲子的法定品種及金燈藤還缺乏系統(tǒng)的全成分表征研究。

代謝組學(xué)能全面表征動植物組織的次生代謝物輪廓，結(jié)合多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，可快速發(fā)現(xiàn)樣本之間的差異代謝物，目前已廣泛運用于不同基原中藥材的鑒別［13-15］。本研究采用基于UPLC-QTOFMS/MS的代謝組學(xué)策略并整合定量分析方法，對購于全國主要藥材市場的45批2個基原的菟絲子藥材—南方菟絲子和金燈藤的小分子化學(xué)輪廓進行比較研究，以期為菟絲子藥材的質(zhì)量檢控和菟絲子藥材資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與材料

液質(zhì)聯(lián)用儀（QTOF SYNAPT G2-S，美國Wa?ters公司），工作站（Empower，美國Waters公司）；高效液相色譜儀-紫外檢測器（2695-2996、美國Wa?ters公司）；超純水制備儀（Milli-Q，美國Millipore公司）；粉碎機（FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9053A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；十萬分之一電子天平（AT201，瑞士METTLER公司）；超聲波清洗器（KQ-250E，昆山超聲儀器有限公司）。

咖 啡 酸（批 號20110501）、山 奈 酚（批 號20082105）、蘆?。ㄅ?8122901）購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。金絲桃苷（批號70102）、紫云英苷（批號72622）、異槲皮苷（批號32142）、3，4-二咖啡酰奎寧酸（批號88488）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?5976）、綠原酸（批號M60618068）均購于上?？凭S化學(xué)技術(shù)有限公司；以上對照品純度≥98%。乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；甲醇（色譜級，江蘇漢邦科技有限公司）；甲酸（質(zhì)譜級，德國Sigma-Aldrich公司），其余試劑均為分析純。實驗用水為Millipore超純水。

1.2 藥材收集

市售45批菟絲子藥材分別于2018年和2020年購于全國主流藥材市場，每批次不少于50 g。全部樣品經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林研究員依據(jù)2020年版《中國藥典》及文獻［16-17］鑒別為南方菟絲子（C.australis）和金燈藤（C.japonica）的干燥成熟種子。具體信息見表1。

表1 菟絲子商品收集情況Tab.1 Collection information of Cuscutae Semen

2 方法

2.1 UPLC-QTOF-MS/MS樣品制備及分析條件

2.1.1 對照品溶液制備

精密稱定綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、異槲皮苷、山奈酚、蘆丁對照品各1 mg，加1 mL甲醇分別制備成1 mg/mL的對照品溶液。再各取100μL對照品溶液，加甲醇補足至1 mL，依次逐級稀釋成1μg/mL的對照品溶液，用于進樣。

2.1.2 供試品溶液制備

精密稱定過30目篩子的菟絲子粉末0.2 g，加入8 mL 80%甲醇于具塞試管中，超聲（功率為250 W，頻率40 kHz）提取1 h，用80%甲醇補足損失的質(zhì)量。離心（13 000 r/min、10 min），保存上清液，備用。取上清液20μL稀釋至1 mL，0.45μm微孔濾膜濾過后進樣。每批藥材平行制備3份樣品。

2.1.3 UPLC-QTOF-MS/MS分析

色譜條件：Waters ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)（美國Waters公司）；色譜柱：BEH C18柱（2.1×100 mm內(nèi)徑，1.7μm）；柱溫：35℃；進樣量：2μL；流動相：0.05%甲酸水溶液（A）-0.05%甲酸乙腈（B）；流速：0.4 mL/min；洗脫條件：0～1 min，95～95%A；1～2min，95～85%A；2～7 min，85～55%A；7～12 min，55%～5%A；12～14 min，5～5%A；14～15 min，5%～95%A，15～17 min，95%～95%A。質(zhì)譜條件：Wa?ters Synapt G2-SQ-TOF質(zhì)譜儀（美國Waters公司）電噴霧離子源，正負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5 KV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣體流速：800 L/h；質(zhì)量掃描范圍為：m/z50～1 200 Da；掃描時間：0.5 s。采用MassLynx 4.1軟件（版本4.1，美國Waters公司）進行采集，參考相關(guān)文獻［5］，建立包括化合物名稱、分子式、分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)和相關(guān)參考文獻的菟絲子化合物數(shù)據(jù)庫，結(jié)合對照品和質(zhì)量精度小于5 ppm的經(jīng)驗分子式比對兩種方法，進行小分子化合物的全成分表征。使用Progenesis QI軟件（版本2.3，美國Waters公司）進行峰提取、峰匹配及歸一化等處理，信息導(dǎo)入EZinfo 3.0軟件進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。

2.2 特征性成分定量分析

2.2.1 對照品溶液制備

取綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、山奈酚、3，4-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸對照品適量，精密稱定，用80%甲醇溶解，用倍半稀釋法制成綠原酸292.50μg/mL、咖啡酸38.44μg/mL、金絲桃苷127.50μg/mL、異槲皮苷40.63μg/mL、紫云英苷74.38μg/mL、山奈酚32.19μg/mL、3，4-二咖啡?？鼘幩?4.69μg/mL和4，5-二咖啡?？鼘幩?4.38μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

精密移取2.1.2項下上清液1mL，離心（13000r/min、10 min），0.45μm微孔濾膜濾過后進樣。

2.2.3 色譜條件

色譜 柱：Alltima TM C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；柱溫：30℃；檢測波長：360 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10μL。洗脫梯度：洗脫條件：0～16 min，15～15%A；16～23 min，15～23%A；23～30 min，23%～23%A；30～35 min，23～28%A；35～38 min，28%～35%A；38～58 min，35～95%A；58～60 min，95%～15%A；60～70 min，15%～15%A。

2.3 方法學(xué)驗證

線性關(guān)系與靈敏度：分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，分別按適當(dāng)?shù)谋壤蛹状枷♂尦芍辽?個不同濃度的混合對照品溶液，按上述色譜條件進行測定，以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），各對照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線評價方法的線性；以檢測限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantitation，LOQ）評價靈敏度。（LOD：S/N=3和LOQ：S/N=10）。8種成分在線性范圍內(nèi)顯示良好的線性（R2＞0.999），見表3。

表3 HPLC-PDA定量方法學(xué)驗證Tab.3 Validation of HPLC-PDA

精密度：精密稱取南方菟絲子（JSPACM-67-38）和金燈藤粉末（JSPACM-67-2），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。日內(nèi)精密度：于一天內(nèi)連續(xù)進樣該供試品溶液6次，記錄峰面積，計算RSD值。日間精密度：供試品溶液連續(xù)測定3天，每天重復(fù)測定3次，記錄峰面積，計算RSD值。經(jīng)計算，8種成分日內(nèi)和日間精密度RSD分別不超過3.27%、3.63%。

穩(wěn)定性：精密稱取南方菟絲子（JSPACM-67-38）和金燈藤粉末（JSPACM-67-2），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測定，計算峰面積的RSD值。穩(wěn)定性RSD均不超過3.73%，表明方法重復(fù)性良好。

重復(fù)性：精密稱取同一批次藥材粉末6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算RSD值。8種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD均不超過3.18%。

加樣回收率：精密稱取已測定各成分含量的菟絲子粉末9份（JSPACM-67-38和JSPACM-67-2），分別加入50%、100%、150%量的各對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。8種成分的加樣回收率在100.8～104.7%。

3 結(jié)果與分析

3.1 南方菟絲子和金燈藤的全成分表征

分別比較了兩個基原樣品在正負(fù)離子下的基峰離子流圖（Base peak intensity，BPI），發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下，可獲得較強的化合物響應(yīng)和更為豐富的化合物信息，故采用負(fù)離子模式進行檢測。南方菟絲子、金燈藤及對照品BPI圖如圖1所示。依據(jù)化合物的精確分子量、碎片離子，結(jié)合對照品標(biāo)準(zhǔn)圖譜及自建化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，從南方菟絲子中共鑒定到13種成分，包括11個類黃酮和2個有機酸。11個黃酮類成分分別為咖啡酰-二糖苷、6-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷、Lignan-O-coumaroylglucoside、槲皮素-3-O-半乳糖苷-7-O-葡萄糖苷、Coumaroyl caffeoylgly?coside、槲皮素-3-O-芹菜糖-（1→2）-半乳糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚。2個有機酸類成分為3，5-二咖啡?？鼘幩岬耐之悩?gòu)體和綠原酸。金燈藤中共鑒定到13種成分，包括6個黃酮和7個有機酸。其中6個黃酮類成分分別為咖啡酰-二糖苷、6-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷、咖啡酰-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-芹菜糖-（1→2）-己糖苷、蘆丁、山奈酚。7個有機酸類成分分別為綠原酸、3-O-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、香豆酮-咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩峒?，5-二咖啡?？鼘幩帷?/p>

圖1 對照品（A）、南方菟絲子（B）和金燈藤（C）醇提液在負(fù)離子模式下的BPI圖Fig.1 BPIchromatogramsof reference substance（A），C.australis（B）and C.japonica（C）in negative ion mode

3.2 特征性成分的篩選和鑒定

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI進行峰提取及歸一化等處理后運用EZinfo 3.0軟件進行主成分分析（Principal component analysis，PCA），比較2個基原菟絲子樣品的整體質(zhì)量差異。再通過正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares dis?crimination analysis，OPLS-DA）的VIP-plot和SPLOT篩選特征性差異成分。PCA分析結(jié)果如圖2（A）所示，南方菟絲子和金燈藤可明顯聚為2大類，說明其小分子次生代謝產(chǎn)物化學(xué)輪廓存在明顯差異。采用OPLS-DA進行分析，如圖2（B）、（C）和（D）所示，選用VIP值>2以及S-PLOT中遠離原點（P（corr）［1］>0.4或者P（corr）［1］<-0.4）為篩選條件，根據(jù)保留時間、準(zhǔn)分子離子峰、加和離子峰和特征碎片離子峰與對照品數(shù)據(jù)比對，篩選鑒定出8個特征性差異化合物，離子強度在各批次樣本中的Trend-plot如圖3所示?；衔镄畔⒁姳?。

圖3 8個特征標(biāo)志物的trends-plot圖Fig.3 The trends-plot of eight characteristic markers

表2 南方菟絲子和金燈藤化學(xué)成分鑒定結(jié)果Tab.2 Components identified from C.australis and C.japonica

圖2 南方菟絲子和金燈藤在負(fù)離子模式下的PCA圖（A）、OPLS-DA圖（B）、S-plot圖（C）和Conefficients-VIP圖（D）Fig.2 PCA score plot（A），OPLS-DA score plot（B），S-plot（C）and Conefficients-VIPscore plot（D）of C.australis and C.ja?ponica in negative ion mode

續(xù)表

3.3 8個特征性差異成分的定量分析

南方菟絲子和金燈藤的色譜圖見圖4。34批南方菟絲子中金絲桃苷、紫云英苷、異槲皮苷和山奈酚的平均含量為2289.28、810.73、395.95、159.40μg/g；綠原酸平均含量為2 102.84μg/g。11批金燈藤中有機酸類成分含量較高，綠原酸、4，5-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡?？鼘幩?、咖啡酸的平均含量分別為3 512.07、1 213.15、994.32、112.22μg/g。而三種黃酮類成分含量較低：異槲皮苷、金絲桃苷、山奈酚的平均含量分別為144.35、97.68、25.53μg/g。如圖5所示，南方菟絲子中特征性黃酮的總含量為金燈藤的21.5倍，金燈藤中特征性有機酸的總含量為南方菟絲子的2.8倍。在2020版《中國藥典》中，規(guī)定菟絲子的質(zhì)控指標(biāo)—金絲桃苷含量標(biāo)準(zhǔn)為“按干燥品計算，含金絲桃苷（C21H20O12）不得少于0.1%”。本研究中，金絲桃苷在南方菟絲子中平均含量為0.15%～0.38%，而金燈藤中平均含量僅為0.009 5%～0.010 0%（均未達藥典標(biāo)準(zhǔn)），南方菟絲子中金絲桃苷的平均含量為金燈藤的23.4倍。

圖4 混合對照品和2種基原菟絲子小分子HPLC-PAD圖Fig.4 HPLC-PADchromatograms of reference substance（A），small molecules in C.australis（B）and C.japonica（C）

圖5 8種差異性成分含量測定結(jié)果Fig.5 Contents determination results of 8 characteristic markers in C.australis and C.japonica

4 討論與結(jié)論

調(diào)查表明，南方菟絲子藥材蘊藏量大，是菟絲子藥材市場的主流品種［3］?，F(xiàn)代植化研究表明南方菟絲子富含黃酮類成分［2，6］，而金燈藤含有豐富的有機酸成分［9］，但目前尚未有對南方菟絲子和金燈藤的化學(xué)輪廓、特征性成分及其含量進行系統(tǒng)比較研究的報道。同時，金燈藤的物質(zhì)基礎(chǔ)與南方菟絲子是否相似，其作為南方菟絲子的替代品種是否合理仍然是亟待解決的科學(xué)問題。

本研究基于UPLC-QTOF-MS/MS的代謝組學(xué)策略研究發(fā)現(xiàn)：南方菟絲子和金燈藤的次生代謝產(chǎn)物化學(xué)輪廓有明顯的差異。結(jié)合定性分析和多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，篩選、鑒定到南方菟絲子的4種特征性成分：山奈酚、異槲皮苷、紫云英苷和金絲桃苷；金燈藤的4種特征性成分：咖啡酸、3，4-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩岷途G原酸。定量分析結(jié)果更進一步表明南方菟絲子中黃酮類成分的平均含量約為金燈藤21.5倍，而金燈藤中有機酸平均含量是南方菟絲子的2.8倍。2020版藥典規(guī)定菟絲子中金絲桃苷含量不得低于0.10%［1］，本研究中34批南方菟絲子中金絲桃苷含量均達到2020版藥典標(biāo)準(zhǔn)，11批金燈藤中金絲桃苷的含量均未達到藥典標(biāo)準(zhǔn)，可見金燈藤的化學(xué)成分在種類和含量上都與南方菟絲子存在明顯的差異。在藥理研究中，南方菟絲子的黃酮類成分具有改善腎虛模型大鼠的相關(guān)作用及保肝、抗骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)免疫等活性［6，18-19］。而金燈藤中的有機酸類成分［20］，如咖啡酸具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等藥理作用［21］；綠原酸具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤［22-23］等活性。兩者主要成分的藥理作用也存在較大差異。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)南方菟絲子和金燈藤在化學(xué)輪廓、特征性成分及其含量上存在顯著差異。且文獻報道過的兩個基原藥材的主要成分的藥理作用也各不同。因此，金燈藤作為我國藥典中菟絲子法定品種的替代品種使用的合理性仍需藥效學(xué)等更進一步的研究。