海參體腔液提取物對(duì)南美白對(duì)蝦自溶的抑制作用

聶 斌 李傲婷 崔小凡 杜椅楠 閻佳楠 吳海濤,2

(1. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2. 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034)

南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)是全球最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖三大蝦種之一，占全球年產(chǎn)量的近80%[1]，是中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)種類。2020年，中國(guó)南美白對(duì)蝦產(chǎn)量高達(dá)120萬(wàn)t，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是，由于蝦類自身酶系豐富，捕撈后內(nèi)源酶導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，嚴(yán)重影響蝦類的品質(zhì)，導(dǎo)致蝦類肉質(zhì)變軟甚至自溶[2-3]。據(jù)報(bào)道，天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶是引起蝦肉蛋白質(zhì)降解的主要因素[4-5]，來(lái)自蝦頭的蛋白酶對(duì)蝦的肌肉組織有顯著的降解作用，并與蝦的質(zhì)地有關(guān)[6-8]。為了減緩由蝦類自溶引起的質(zhì)量損失，通常在蝦糜制品中加入蛋白酶抑制劑[9]等來(lái)抑制其蛋白質(zhì)的降解。

許多動(dòng)物體液都具有蛋白酶抑制劑的作用。在牛、豬和雞的血漿中發(fā)現(xiàn)的抑制劑具有蛋白酶抑制活性，可作為抑制原料自溶的基料使用[10-12]，但因瘋牛病及宗教和習(xí)俗等原因，畜牧蛋白酶抑制劑的應(yīng)用受到限制。因此，開(kāi)發(fā)利用水生動(dòng)物蛋白酶抑制劑越來(lái)越重要。研究表明，蛋白酶抑制劑廣泛存在于水生動(dòng)物體液中，如斑馬魚(yú)和泥鰍[13]、鯉魚(yú)[14]。海參(Stichopusjaponicus)是一種重要的水生生物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和滋補(bǔ)價(jià)值[15]，其體腔液是海參加工中的主要副產(chǎn)品，占海參總重量的5%～10%。因此，以海參體腔液作為原料，開(kāi)發(fā)食源性天然蛋白酶抑制劑，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

研究擬探究南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的適宜條件。并在該基礎(chǔ)上，以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、三氯乙酸(TCA)可溶性寡肽釋放量為指標(biāo)研究海參體腔液及其提取物對(duì)蝦肉自溶中蛋白質(zhì)降解的抑制作用，以期為海參體腔液的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮海參(Stichopusjaponicus)和南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)：大連當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；

所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

垂直電泳儀：AE-6450型，日本ATTO公司；

微量臺(tái)式離心機(jī)：Micro 17R型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

往復(fù)式脫色搖床：TS.B-108型，其林貝爾儀器制造有限公司；

凝膠成像儀：MF-ChemiBIS 2.0型，以色列DNR Bio-imaging公司；

真空冷凍干燥機(jī)：2KBTES-55型，美國(guó)Virtis公司；

酶標(biāo)定量測(cè)定儀：Infinite200 NANO型，瑞士TECAN公司；

精密pH計(jì)：PHS-3型，上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 新鮮南美白對(duì)蝦去頭，去皮，放入勻漿機(jī)中充分?jǐn)囁椋梦r糜備用。

1.2.2 海參體腔液提取物的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[16]略作修改，取鮮活海參，切頭去尾，收集其體腔液，立刻在4 ℃，3 000×g條件下進(jìn)行離心15 min。取適量離心后的上清液于-80 ℃保存，作為海參體腔液樣品備用。其余上清液進(jìn)一步經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)于4 ℃下透析(3.5 kDa)處理20 h，透析后樣品經(jīng)凍干，回收凍干粉，作為海參體腔液提取物樣本備用。

1.2.3 南美白對(duì)蝦蝦糜自溶的適宜條件

(1) pH的影響：取0.1 g南美白對(duì)蝦蝦糜樣品與0.1 mL 磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液進(jìn)行混合，用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。在50 ℃孵育2 h后，獲得南美白對(duì)蝦蝦糜樣品。

(2) 溫度的影響：根據(jù)1.2.3(1)的方法，在pH 3.0的條件下，將孵育溫度分別設(shè)置為30，40，50，60，70 ℃，孵育2 h，獲得南美白對(duì)蝦蝦糜樣品。

(3) 時(shí)間的影響：根據(jù)1.2.3(1)和1.2.3(2)的方法，在pH 3.0和溫度50 ℃的條件下，將孵育時(shí)間分別設(shè)置為1，2，3，4，5，6 h，獲得南美白對(duì)蝦蝦糜樣品。

1.2.4 海參體腔液及其提取物對(duì)蝦肉糜自溶的影響 根據(jù)文獻(xiàn)[17]31所述，將南美白對(duì)蝦蝦糜與一定濃度的海參體腔液及其提取物進(jìn)行復(fù)配，于磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖體系下，在pH 3.0和50 ℃條件下處理樣品。針對(duì)海參體腔液，添加海參體腔液含量為80%，自溶組條件為水50 ℃孵育2 h，以冰上孵育2 h樣品作為對(duì)照組。針對(duì)海參體腔液提取物，蝦靡和體腔液提取物混合樣品與緩沖液體系的料液比為1∶5 (g/mL)，海參體腔液提取物添加量分別為3.13，6.25，12.50，25.00 g/100 g蝦糜。

1.2.5 SDS-PAGE電泳分析 根據(jù)文獻(xiàn)[18]所述，待南美白對(duì)蝦蝦糜孵育結(jié)束后，按m南美白對(duì)蝦蝦糜∶V上樣緩沖液=1∶3 (g/mL) 加入5×上樣緩沖液使其反應(yīng)終止。將樣液混合震蕩12 h后，取10 μL樣品進(jìn)行上樣，采用5%分離膠和10%濃縮膠，在15 mA電流下進(jìn)行電泳。利用考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色，通過(guò)凝膠成像儀拍照成像。

1.2.6 TCA可溶性寡肽含量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[19]略作修改，南美白對(duì)蝦蝦糜孵育結(jié)束后，以m南美白對(duì)蝦蝦糜∶VTCA=1∶2 (g/mL)比例添加預(yù)冷的20 g/100 mL TCA使其反應(yīng)終止，待測(cè)樣液在室溫條件下靜置20 min后離心15 min，所得上清液采用Folin-酚法進(jìn)行肽含量的測(cè)定。以新鮮蝦靡樣液為對(duì)照，設(shè)置數(shù)值為1，計(jì)算TCA可溶性寡肽相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用Student’st軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05的水平表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)南美白對(duì)蝦蝦糜自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的影響

SDS-PAGE電泳可以按分子量分離蛋白質(zhì)組分，如圖1所示，南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì)組成較為清晰，在200 kDa左右處可觀察到肌球蛋白重鏈，在44.3 kDa左右處觀察到肌動(dòng)蛋白條帶。與對(duì)照組新鮮蝦糜相比，當(dāng)pH值為3.0時(shí)，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶灰度最低，隨著pH逐漸升高至8.0時(shí)，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶灰度逐漸回升，結(jié)果表明，當(dāng)pH為3.0時(shí)，對(duì)南美白對(duì)蝦蝦糜蛋白的降解程度最顯著。因此，確定了南美白對(duì)蝦蝦糜自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的適宜pH條件為3.0。

HM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker (高) LM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker(低) R. 新鮮南美白對(duì)蝦蝦糜圖1 pH對(duì)南美白對(duì)蝦蝦糜自溶中蛋白質(zhì)降解的影響Figure 1 The effects of pH on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.2 溫度對(duì)南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的影響

隨著孵育溫度變化，蛋白質(zhì)的降解程度也有所不同。如圖2所示，當(dāng)孵育溫度由30 ℃逐漸升高時(shí)，蛋白質(zhì)的降解程度逐漸增強(qiáng)，溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)的降解程度最為顯著，表現(xiàn)為肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶灰度最低，表明南美白對(duì)蝦蝦糜蛋白質(zhì)降解的適宜溫度為50 ℃。當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃后，隨著溫度的升高，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶灰度逐漸增強(qiáng)，表明蛋白質(zhì)降解程度逐漸降低。胡玲萍等[20]在探究南極磷蝦自溶前后氨基酸和胰蛋白酶降解產(chǎn)物的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦自溶酶最適溫度為55 ℃，與試驗(yàn)結(jié)論相類似。Sriket等[21]、Buarque等[22]也得到了較為相似的結(jié)果。

HM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker (高) LM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker(低) R. 新鮮南美白對(duì)蝦蝦糜圖2 溫度對(duì)南美白對(duì)蝦自溶中蛋白質(zhì)降解的影響Figure 2 The effects of temperature on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.3 時(shí)間對(duì)南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的影響

如圖3所示，在溫度為50 ℃、pH值為3.0的條件下，孵育時(shí)間越長(zhǎng)，南美白對(duì)蝦蝦糜蛋白質(zhì)的降解程度則越強(qiáng)，當(dāng)孵育時(shí)間超過(guò)2 h后，肌球蛋白重鏈降解程度很強(qiáng)，表現(xiàn)為200 kDa左右處的蛋白條帶灰度較低。而44.3 kDa 左右處的肌動(dòng)蛋白條帶隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，降解程度與對(duì)照組相比有所提高，1～4 h內(nèi)變化不大。

HM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker (高) LM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker(低) R. 新鮮南美白對(duì)蝦蝦糜圖3 孵育時(shí)間對(duì)南美白對(duì)蝦自溶中蛋白質(zhì)降解的影響Figure 3 The effects of incubation time on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

綜上可知，南美白對(duì)蝦蝦糜自溶中蛋白質(zhì)降解的適宜條件為pH值為3、孵育溫度50 ℃、孵育時(shí)間2 h。

2.4 海參體腔液對(duì)南美白對(duì)蝦自溶中蛋白質(zhì)降解的影響

前期研究[17]19發(fā)現(xiàn)，新鮮海參體腔液中粗蛋白質(zhì)量濃度約為(296.98±1.41) μg/mL，總糖質(zhì)量濃度約為(71.45±1.23) μg/mL。經(jīng)透析、凍干處理后得到的海參體腔液提取物中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)(9.05±0.17) g/100 g。在南美白對(duì)蝦蝦糜中添加新鮮海參體腔液，使體腔液終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80 g/100 g，在上述確定的適宜條件下誘導(dǎo)蝦糜自溶，進(jìn)一步通過(guò)TCA可溶性寡肽含量的變化，探究海參體腔液對(duì)南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的影響。

如圖4所示，經(jīng)自溶誘導(dǎo)，蝦糜中TCA可溶性寡肽顯著釋放，與未添加海參體腔液的自溶樣品相比，海參體腔液可以顯著抑制TCA可溶性寡肽的釋放，說(shuō)明海參體腔液具有抑制南美白對(duì)蝦蝦糜自溶的作用。

不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)圖4 海參體腔液對(duì)南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的影響Figure 4 The effects of coelomic fluid of sea cucumber on protein degradation during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.5 海參體腔液提取物對(duì)南美白對(duì)蝦自溶中蛋白質(zhì)降解的影響

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將新鮮海參體腔液進(jìn)行透析、凍干，從而得到海參體腔液提取物，并利用SDS-PAGE分析海參體腔液提取物對(duì)南美白對(duì)蝦自溶中蛋白質(zhì)降解的影響。

海參體腔液提取物對(duì)南美白對(duì)蝦自溶中蛋白質(zhì)降解的影響如圖5所示，海參體腔液提取物主要抑制蝦糜肌動(dòng)蛋白的降解，表現(xiàn)為44.3 kDa左右處的肌動(dòng)蛋白條帶與自溶組相比灰度較高，且隨著海參體腔液提取物添加量增加至6.25 g/100 g蝦糜以上，抑制能力有所提高，且添加6.25～25.00 g/100 g蝦糜提取物的南美白對(duì)蝦蝦靡自溶作用差別不大。

HM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker (高) R. 新鮮南美白對(duì)蝦蝦靡 C. 未添加提取物的南美白對(duì)蝦自溶樣品 1～4. 添加3.13，6.25，12.50，25.00 g/100 g蝦糜海參體腔提取物的樣品 S. 25.00 g/100 g的海參體腔液的提取物 LM. 標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker(低)圖5 海參體腔液提取物對(duì)南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的影響Figure 5 The effects of coelomic fluid isolaton extracts of sea cucumbers on protein degradation during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.6 海參體腔液提取物對(duì)南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中TCA可溶性寡肽釋放的影響

當(dāng)海參體腔液提取物添加量為12.50 g/100 g蝦糜時(shí)，TCA可溶性寡肽釋放量被顯著抑制(P<0.05)，當(dāng)海參體腔液提取物添加量為25.00 g/100 g蝦糜時(shí)，抑制率可達(dá)39.0%(見(jiàn)圖6)。綜上，海參體腔液提取物能有效抑制南美白對(duì)蝦蝦糜自溶中蛋白質(zhì)的降解程度。

不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)R. 新鮮南美白對(duì)蝦樣液 C. 未添加提取物的南美白對(duì)蝦自溶樣品圖6 海參體腔液提取物對(duì)南美白對(duì)蝦自溶過(guò)程中TCA可溶性寡肽釋放的影響Figure 6 The effects of coelomic fluid isolaton extracts of sea cucumbers on TCA-soluble oligopeptide release during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

3 結(jié)論

南美白對(duì)蝦是中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)種類，為了降低由蝦類自溶引起的質(zhì)量損失，試驗(yàn)在蝦糜制品中加入海參體腔液提取物來(lái)抑制其蛋白質(zhì)的降解。南美白對(duì)蝦蝦糜自溶中蛋白質(zhì)發(fā)生顯著降解的條件為孵育溫度50 ℃、pH值3.0、孵育時(shí)間2 h。海參體腔液及其提取物能有效地抑制南美白對(duì)蝦蝦糜蛋白質(zhì)的降解。