解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的抑菌活性及抗氧化作用

王小娟，任 莉，張鈴玉，李潔明，周 波，王惠民,4，蘇文金，吳達(dá)仁

(1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；4.臺(tái)灣中興大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所，臺(tái)灣 臺(tái)中 402)

0 引言

黃瓜(CucumissativusL.)在世界各地都有種植[1]。除碳水化合物和膳食纖維外，黃瓜中還含有豐富的維生素和礦物質(zhì)，具有清熱解毒、健腦安神等功效[2]。近年來(lái)，黃瓜的種植面積以及集約化種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，而常年的黃瓜連作種植也導(dǎo)致了土傳枯萎病害的泛濫[3]。黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢鸬囊环N危害性極強(qiáng)的世界性土傳病害[4]，黃瓜的整個(gè)生長(zhǎng)期都有可能感染尖孢鐮刀菌。由于尖孢鐮刀菌的生命力極強(qiáng)，可存活于土壤長(zhǎng)達(dá)10 a以上，并隨著作物種植時(shí)間的增長(zhǎng)不斷累積，這也導(dǎo)致黃瓜枯萎病成為黃瓜種植過(guò)程中難以防治的病害之一。有研究表明，當(dāng)黃瓜枯萎病嚴(yán)重時(shí)，黃瓜減產(chǎn)率高達(dá)50%以上甚至絕產(chǎn)，更嚴(yán)重時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致致病土壤不適宜黃瓜栽種[3]，給世界各國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

目前，黃瓜枯萎病的防治手段主要為化學(xué)防治、物理防治和生物防治等[6]。這些防治方法對(duì)黃瓜枯萎病都具有一定的防治效果，但是每種方法各有優(yōu)劣。使用化學(xué)農(nóng)藥是防治黃瓜枯萎病最常見(jiàn)的方法，且在一定程度上能夠快速地抑制黃瓜枯萎病，但其長(zhǎng)期施用會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染，危害人體及牲畜健康[7]，也會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥性增強(qiáng)，防治效果差[8]。物理防治主要從栽培期間的管理、土壤的殺菌[9]及酸堿處理[10]入手?；瘜W(xué)和物理的方法防治效果比較顯著，但要及時(shí)對(duì)植物的根部進(jìn)行保護(hù)，對(duì)種植土壤的酸堿性、透氣性進(jìn)行調(diào)節(jié)，否則極易受品種、天氣、土壤以及操作技術(shù)等因素的影響而導(dǎo)致該方法無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模地推廣。近年來(lái)，人們?nèi)找孀非笫卟说钠焚|(zhì)和食用安全性，綠色、安全、環(huán)境友好型的防治方法應(yīng)運(yùn)而生。生物防治由于具有無(wú)污染、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，日益成為國(guó)內(nèi)外研究者的研究熱點(diǎn)。生物防治可通過(guò)拮抗微生物自身或其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌產(chǎn)生抑制作用，削弱病原菌的致病力來(lái)達(dá)到防治的目的[11]。目前，研究天然高效的生物類抗菌物質(zhì)來(lái)防治黃瓜枯萎病已成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有廣譜抗菌的特性，能產(chǎn)生多種具有抑菌作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是研究較多的一類生防細(xì)菌[12]。已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物多為脂肽、多肽、聚酮類和抗菌蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，在防治植物病害中起著至關(guān)重要的作用，如番茄青枯病[13]、玉米耐鹽性[14]、西瓜枯萎病[15]、黃瓜枯萎病[16]、黃瓜灰霉病[17]等。此外，解淀粉芽孢桿菌還能提高植物本身對(duì)非生物脅迫的耐受性，如高濃度鹽的威脅[14,18]。在種植業(yè)中，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以作為蔬菜水果的綠色保鮮劑，能夠有效地抑制霉菌[19]。在養(yǎng)殖業(yè)中，解淀粉芽孢桿菌可作為飼料添加劑，在動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)并保持腸道內(nèi)的有益菌群的平衡與穩(wěn)定，從而改善動(dòng)物的腸道健康[20]，幫助動(dòng)物消化吸收，提高飼料養(yǎng)分的利用率。此外，解淀粉芽孢桿菌在凈化水源、防治水體富營(yíng)養(yǎng)化等方面也發(fā)揮著積極的作用[19]。

本文以解淀粉芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究其對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢霓卓棺饔?，并對(duì)解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件、理化穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為后續(xù)開發(fā)生防菌劑提供理論依據(jù)。此外，本實(shí)驗(yàn)還探究了解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的抗氧化活性，以期進(jìn)一步拓寬解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

生防菌解淀粉芽孢桿菌SJ100001、病原菌尖孢鐮刀菌SJ300024均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基，海博生物有限公司；馬鈴薯葡萄糖液體(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，pH=7.0±0.2；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，pH=7.0±0.2；NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，pH=7.3±0.1。

1.1.3 主要試劑

溶菌酶(Lysozyme)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、鹽酸，西隴化工股份有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶，上海麥克林生化科技有限公司；DPPH，Sigma Aldrich；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQZY-AF8型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Synergy H1MF型多功能酶標(biāo)儀，BioTek公司；KT-30L型高壓蒸汽滅菌鍋，日本ALP儀器生產(chǎn)廠家；5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份有限公司；DK-8D型恒溫水浴鍋，金壇區(qū)金城海瀾儀器制造廠；DENVER UB-7型pH計(jì)，北京賽多麗絲科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢桿菌SJ100001對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌活性的測(cè)定

1.3.1.1 菌種活化

1)病原真菌活化。挑取真菌菌苔，接種到PDA固體培養(yǎng)基中心，28 ℃培養(yǎng)5 d。

2)生防細(xì)菌活化。挑取解淀粉芽孢桿菌SJ100001，三區(qū)劃線法于LB固體培養(yǎng)基劃線活化，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3.1.2 抑菌活性的測(cè)定

采用平板對(duì)峙法測(cè)定抑菌活性，具體過(guò)程為：取尖孢鐮刀菌菌塊(直徑為0.7 cm)接種于PDA培養(yǎng)皿(直徑為9.0 cm)中心，在菌塊兩側(cè)1.5 cm處接種解淀粉芽孢桿菌。以尖孢鐮刀菌為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察菌落的生長(zhǎng)和生防菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制情況。待對(duì)照菌株菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)測(cè)量處理尖孢鐮刀菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率[21-22],抑菌率計(jì)算公式為：

抑菌率/%=((對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-0.7))×100。

(1)

1.3.2 解淀粉芽孢桿菌SJ100001抑菌成分來(lái)源的測(cè)定

1.3.2.1 發(fā)酵液的制備

將活化的生防菌挑取1個(gè)單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱(37 ℃、180 r/min)發(fā)酵12 h，制得發(fā)酵種子液。取 1 mL種子液接種于250 mL的LB培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、180 r/min)培養(yǎng)48 h，4 ℃、12 000 r/min下離心10 min去除菌體沉淀，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，獲得無(wú)菌濾液備用[23]。

1.3.2.2 菌體胞內(nèi)可溶物溶液的制備

收集1.3.2.1的菌體沉淀，加入適量生理鹽水重懸，4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，重復(fù)洗滌2～3次，收集菌體。使用25 mL生理鹽水將菌體重懸，得到菌體懸液，向菌體懸液中加入500 μL溶菌酶(100 mg/L)，于37 ℃水浴1 h。然后超聲破碎1 h，90 ℃加熱處理10 min，4 ℃、12 000 r/min下離心15 min，收集上清液，獲得菌體胞內(nèi)可溶物溶液備用[24]。

1.3.2.3 發(fā)酵液和菌體胞內(nèi)可溶物溶液抑菌活性的測(cè)定

參考牛津杯法[25]，并稍作修改。在PDA(直徑為9.0 cm)培養(yǎng)皿中心接種尖孢鐮刀菌菌塊(直徑為0.7 cm)，在菌塊兩側(cè)1.5 cm處放置牛津杯，在牛津杯中緩慢加入200 μL的發(fā)酵液或菌體胞內(nèi)可溶物溶液，以無(wú)菌水為對(duì)照[26]，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)72 h后觀察發(fā)酵液或菌體胞內(nèi)可溶物溶液對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果，計(jì)算抑菌率，從而確定活性物質(zhì)的來(lái)源。抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.3 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

分別以5%接種量接種種子液于LB、NA和PDB培養(yǎng)基中，恒溫振蕩(37 ℃、180 r/min)培養(yǎng)48 h，得到LB、NA與PDB的發(fā)酵液。分別離心(4 ℃、12000 r/min)15 min，去除菌體沉淀，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，獲得無(wú)菌濾液。測(cè)定不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌活性，計(jì)算抑菌率，抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

以1%接種量接種種子液于PDB培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、180 r/min)，分別培養(yǎng)0，1，2，3，4，5，6，7 d，獲得各個(gè)時(shí)間段的發(fā)酵液，并測(cè)定抑菌活性，計(jì)算抑制率，抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.3.3 發(fā)酵液最佳抑菌時(shí)間的測(cè)定

采用皿內(nèi)涂布法[27]測(cè)定抑菌活性，具體過(guò)程為：PDA培養(yǎng)皿內(nèi)加入200 μL無(wú)菌發(fā)酵液并快速涂干，在培養(yǎng)皿的中心放置尖孢鐮刀菌塊(直徑為0.7 cm)，以無(wú)菌水為對(duì)照組[28]，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24 h觀察測(cè)量菌落直徑，用十字交叉法測(cè)量記錄菌落的直徑變化。待對(duì)照菌株菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)停止觀察，計(jì)算抑菌率，抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.4 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性

1.3.4.1 pH值對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

取7組潔凈的玻璃試管，每組分別加入5 mL的發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)組用0.2 moL/L的HCl和NaOH分別將發(fā)酵液調(diào)成pH=2～3，5～6，8～9，10～11，12～13。靜置24 h后調(diào)回原pH值[29]。對(duì)照組pH=7，加入無(wú)菌水為溶劑組[28]。參照1.3.1.2的抑菌方法計(jì)算抑制率，抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.4.2 溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

取7組潔凈的玻璃試管，每組分別加入5 mL的發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)組分別置于恒溫水浴鍋或高溫高壓滅菌鍋保持40，60，80，100，121 ℃恒溫處理30，60 min。對(duì)照組放置室溫(25 ℃)，加入無(wú)菌水為溶劑組。參照1.3.1.2的抑菌方法計(jì)算抑制率，抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.4.3 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

取7組潔凈的玻璃試管，每組分別加入5 mL的發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)組分別加入中性蛋白酶(50 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、酸性蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(3000 U/mg)、木瓜蛋白酶(200 U/mg)，且使酶的終質(zhì)量濃度為1 g/L。把各個(gè)反應(yīng)混合液調(diào)到其酶最適的pH值與溫度，酶解4 h。處理完畢后，將每組置于沸水浴中滅活處理10 min。不加入任何蛋白酶為對(duì)照組，加入無(wú)菌水為溶劑組。參考1.3.2.3的牛津杯法對(duì)峙實(shí)驗(yàn)計(jì)算抑制率，抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.4.4 紫外照射對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

在潔凈的石英管中加入5 mL的發(fā)酵液，將其置于功率為15 W的紫外燈下分別照射1，2，3，4，24 h。以不做任何處理的發(fā)酵液為對(duì)照[30]，加入無(wú)菌水為溶劑組。參照1.3.1.2的抑菌方法計(jì)算抑制率，以考察紫外照射時(shí)間對(duì)活性物質(zhì)的影響，抑菌率計(jì)算參照式(1)。

1.3.5 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液的抗氧化能力測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取4 mg DPPH溶解在體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液中，配制成0.1 mmol/L的DPPH工作液。取不同濃度的發(fā)酵液100 μL分別加入到100 μL的DPPH工作液中，振蕩混勻后避光反應(yīng)30 min，以Vc(1 g/L)作為陽(yáng)性對(duì)照，在517 nm處測(cè)定吸光度值(A1)；空白對(duì)照以超純水代替樣品測(cè)定吸光度值(A0)；樣品對(duì)照以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替DPPH溶液，測(cè)定吸光度值(A2)[31]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

DPPH自由基清除率/%=(1-(A2-A1)/A0)×100。

(2)

1.3.5.2 鐵離子還原能力測(cè)定

取100 μL的發(fā)酵液與250 μL的0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)、250 μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液混合，振蕩搖勻，置于50 ℃的恒溫水浴鍋中水浴30 min。水浴結(jié)束后，加入250 μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸，將混合物3 000 r/min離心10 min。取250 μL上清液與250 μL的蒸餾水、50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%三氯化鐵混合，避光反應(yīng)10 min，在700 nm處測(cè)定溶液的吸光度值[32]，以Vc(1 g/L)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所有測(cè)定的數(shù)據(jù)均做3個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SPSS 26.0軟件分析并處理數(shù)據(jù)，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行圖像處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 解淀粉芽孢桿菌SJ100001對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性

解淀粉芽孢桿菌SJ100001的抑菌效果如圖1、表1所示。在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中，接種解淀粉芽孢桿菌SJ100001的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯透明抑菌帶，抑菌率為62.80%，抑菌效果顯著，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌SJ100001可分泌抑制尖孢鐮刀菌的物質(zhì)。

表1 解淀粉芽孢桿菌SJ100001的抑菌結(jié)果

2.2 解淀粉芽孢桿菌SJ100001抑菌成分的來(lái)源

為進(jìn)一步探究抑菌活性物質(zhì)的真正來(lái)源，采用牛津杯法檢測(cè)SJ100001菌體的發(fā)酵液和菌株懸液的抑菌活性，結(jié)果如圖2、表2所示?？梢?jiàn)，與對(duì)照組相比，菌體懸液組無(wú)透明抑菌帶出現(xiàn)，尖孢鐮刀菌圈呈圓形生長(zhǎng)，抑制率僅0.61%；實(shí)驗(yàn)組能看到尖孢鐮刀菌圈產(chǎn)生明顯形變，且抑菌活性達(dá)到了38.11%，提示發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌有明顯的抑菌作用，且產(chǎn)生抑菌活性的是SJ100001菌株的胞外次級(jí)代謝產(chǎn)物。

表2 抑菌活性物質(zhì)的抑菌活性(72 h)

2.3 解淀粉芽孢桿菌SJ100001的最佳發(fā)酵條件

2.3.1 培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

SJ100001菌株在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，抑菌活性也不同。已有實(shí)驗(yàn)表明[33]，培養(yǎng)基中的碳源、氮源和原始的pH值均會(huì)對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn)生影響。由表3可知，利用NA、LB、PDB 3種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)SJ100001菌株，其發(fā)酵液中均會(huì)產(chǎn)生抑制尖孢鐮刀菌的活性物質(zhì)，但PDB培養(yǎng)基中SJ100001菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，其抑菌率高于其他2種培養(yǎng)基的。推測(cè)PDB培養(yǎng)基培養(yǎng)SJ100001菌株可產(chǎn)生更多的抑菌物質(zhì)，后期可將其作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以富集更多活性物質(zhì)。

表3 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌活性(72 h)

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

SJ100001菌株發(fā)酵液的抑菌活性隨著發(fā)酵時(shí)間而變化，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液的抑菌活性先升高后趨于平緩，在第3天時(shí)發(fā)酵液達(dá)到最大抑菌活性59.57%。推測(cè)菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物在發(fā)酵液中隨著時(shí)間逐漸累積，使發(fā)酵液的抑菌活性增強(qiáng)，在發(fā)酵3 d達(dá)到飽和，抑菌活性不再發(fā)生變化。

2.3.3 發(fā)酵液最佳抑菌時(shí)間

如圖4所示，SJ100001菌株發(fā)酵液在抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第2天時(shí)，其抑菌效果最佳，抑制率為54.65%。隨著抑菌實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，發(fā)酵液的抑菌效果降低，在第7天時(shí)其抑制率僅26.45%。推測(cè)3～4 d后尖孢鐮刀菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，導(dǎo)致后期SJ100001菌株發(fā)酵液的抑菌活性相對(duì)降低。

2.4 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液抑菌活性的穩(wěn)定性

2.4.1 pH值對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

如圖5所示，SJ100001菌株發(fā)酵液經(jīng)不同的酸堿處理后，抑菌活性與對(duì)照組相比有顯著差異。在pH=2～11時(shí)，抑菌活性均在52.00%以上，相比于對(duì)照組顯著上升(P<0.05)；在pH=12～13時(shí)，發(fā)酵液的抑菌活性僅0.41%，與對(duì)照組相比顯著下降了49.69%(P<0.01)。表明發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)對(duì)酸堿具有一定的耐受性，但在強(qiáng)堿的條件下會(huì)失活。

2.4.2 溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

如圖6所示，發(fā)酵液經(jīng)40，60，80，100，121 ℃分別處理30與60 min后，依然具有較高的抑菌活性，并且活性保持在45%以上，與對(duì)照組(25 ℃)相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。經(jīng)121 ℃高溫高壓處理60 min的發(fā)酵液，抑菌活性略低于對(duì)照組，但仍保持在44%以上。提示發(fā)酵液中的活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 紫外照射對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

如圖7所示，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的紫外線照射，發(fā)酵液的抑菌活性依然保持在30%以上，與未經(jīng)紫外照射處理的對(duì)照組相比沒(méi)有顯著下降(P>0.05)。此外，紫外照射24 h后，發(fā)酵液抑菌活性依舊沒(méi)有顯著下降。上述結(jié)果表明，SJ100001菌株發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)具有紫外穩(wěn)定性。

2.4.4 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

在不同的蛋白酶酶解處理4 h后，SJ100001菌株發(fā)酵液對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖8所示。由圖8可見(jiàn)，中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶的處理使發(fā)酵液的抑菌活性與對(duì)照組相比略微降低，但抑制率均在51%；而木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶的處理，相比于對(duì)照組的抑菌活性降低至49%左右。

不同蛋白酶特異性酶切位點(diǎn)不同，造成酶解后抑菌活性有差異，但抑菌活性均保持在49%以上，說(shuō)明發(fā)酵液中的活性成分絕大部分沒(méi)有被蛋白酶破壞，依然具有一定的穩(wěn)定性。可初步推斷，SJ100001菌株產(chǎn)生的具有抑制尖孢鐮刀菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物可能為非蛋白類化合物。

2.5 解淀粉芽孢桿菌SJ100001發(fā)酵液的抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力

如圖9所示，發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)，隨著濃度的不斷提高，發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力從29.33%上升至87.26%，其抗氧化能力顯著提高(P<0.05)，表明發(fā)酵液具有一定的抗氧化活性。

2.5.2 鐵離子還原力測(cè)定

抗氧化物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與三氯化鐵發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成了藍(lán)色物質(zhì)，從而在700 nm下有強(qiáng)吸收峰，即抗氧化能力與吸收峰強(qiáng)度呈正比。

如圖10所示，鐵離子的還原力隨著發(fā)酵液濃度的增加而增加(P<0.05)，再次證明了發(fā)酵液具有抗氧化活性。

3 討論

已有研究結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物如抗菌蛋白[34]、脂肽[35]、多肽類[36-37]等均具有抑菌效果[38-39]。Wong等[40]從解淀粉芽孢桿菌中分離得到相對(duì)分子質(zhì)量為50 ku的抗菌蛋白，該抗菌蛋白通過(guò)增加病原菌細(xì)胞膜的通透性而起到抑菌效果。Kaewklom等[41]從一株解淀粉芽孢桿菌SP-1-13LM中分離得到一種新型的多肽PPB，該多肽具有廣譜抑菌性，可有效抑制包括沙門氏菌在內(nèi)的多種病原菌的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌SJ100001的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢哂修卓棺饔?。

解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌活性受諸多因素的影響，實(shí)驗(yàn)表明，SJ100001菌株在PDB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72 h時(shí)抑菌率最高，且抑菌活性物質(zhì)在第2 d時(shí)抑菌率最高，說(shuō)明PDB培養(yǎng)基發(fā)酵可獲得濃度相對(duì)較高的抑菌物質(zhì)，并且僅需較短的時(shí)間就達(dá)到較好的抑菌效果，有利于后期分離純化抑菌物質(zhì)。該培養(yǎng)方法與解淀粉芽孢桿菌H15[42]、解淀粉芽孢桿菌CQN-2[43]和解淀粉芽孢桿菌K6[44]存在一定的差異，這種差異可能與菌株及其來(lái)源有關(guān)。

次級(jí)代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性影響其提取與開發(fā)。夏京津等[45]研究表明，解淀粉芽孢桿菌HE發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)對(duì)高溫、酸、堿和蛋白酶具有一定的耐受性。劉昆昂等[46]研究表明，解淀粉芽孢桿菌BA-KA4的胞外抑菌活性物質(zhì)能夠有效抑制灰霉病菌生長(zhǎng)，且對(duì)溫度、pH值和紫外線的穩(wěn)定性較高。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SJ100001發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)同樣具有良好的耐酸堿性、熱穩(wěn)定性、紫外線以及蛋白酶穩(wěn)定性。解淀粉芽孢桿菌SJ100001產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不僅具有抑菌作用，還具有良好的抗氧化能力。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究解淀粉芽孢桿菌SJ100001對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢囊志饔?，結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌SJ100001對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜?；筒≡婢哂懈咝У霓卓棺饔茫乙志镔|(zhì)是菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物。采用平板對(duì)峙法和牛津杯法，確定了SJ100001菌株最佳抑菌效果的發(fā)酵條件，即：37 ℃ 180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)72 h，且通過(guò)紫外、溫度、酸堿、蛋白酶等穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了菌株發(fā)酵液具有較好的抑菌穩(wěn)定性和抗氧化性。