龍牙百合多糖的理化性質(zhì)研究及結(jié)構(gòu)表征

陳小蒙 劉成梅

摘? 要|采用水提醇沉法從新鮮龍牙百合中提取出粗多糖，經(jīng) DEAE-Sepharose Fast Flow 分離純化出兩種多糖 LLP1、LLP2，再進行理化性質(zhì)分析，并用多種色譜手段對兩種多糖進行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明：LLP1、LLP2 均易吸潮，溶于熱水和二甲亞砜，不溶于有機溶劑，糖醛酸含量分別為 4.02%、77.13%，不含淀粉;氣相色譜分析顯示 LLP1 單糖組成為甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖，摩爾比為18.60 ∶ 25.14 ∶ 1.00，LLP2 單糖組成為半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，摩爾比為 3.58 ∶ 1.00 ∶ 1.09;紅外光譜掃描、核磁共振分析共同表明 LLP1 為吡喃糖環(huán)，含有α 型和β 型糖苷鍵，含有少量糖醛酸，LLP2 為吡喃糖環(huán)，含有α 型糖苷鍵，且為糖蛋白復(fù)合物;高碘酸氧化和 Smith 降解反應(yīng)結(jié)果顯示 LLP1 主鏈含有大量 1 → 2 或 1 → 6 糖苷鍵和非還原末端糖基，葡萄糖存在 1 → 3 糖苷鍵， LLP2 主鏈含有大量 1 → 2 糖苷鍵，半乳糖以 1 → 3 糖苷鍵為主，鼠李糖、阿拉伯糖不存在 1 → 3 糖苷鍵。

關(guān)鍵詞|龍牙百合;多糖;理化性質(zhì);結(jié)構(gòu)表征

龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）是衛(wèi)計委審批通過的首批藥食兩用品，含有豐富的多糖、多酚等功能成分。近年來百合多糖的保健功能引起了學(xué)者們的關(guān)注，劉成梅[1]等發(fā)現(xiàn)百合多糖對四氧嘧啶引起的糖尿病模型小白鼠有明顯的降血糖作用;李玉萍[2]等發(fā)現(xiàn)百合多糖的抗糖尿病作用與促進胰島 β -細胞增殖和胰島素分泌功能有關(guān);Hou R 等[3]研究發(fā)現(xiàn)百合多糖可明顯提高小鼠機體固有細胞免疫和適應(yīng)性細胞免疫的功能。

目前對于百合多糖的研究大多集中在提取、分離純化和生物活性方面， 結(jié)構(gòu)的研究集中在單糖組成和分子量上，而對于構(gòu)效關(guān)系研究非常有限。本文以龍牙百合多糖的兩種純化物 LLP1、LLP2 為原料，研究了百合多糖的基本理化性質(zhì)，用高碘酸氧化、Smith 降解、氣相色譜（GC）、紅外光譜（IR）、1H-NMR 和 13C-NMR 光譜對純化組分進行結(jié)構(gòu)解析，為從分子水平上闡明龍牙百合多糖組分與生物活性之間的關(guān)系、藥理功能和作用機制提供重要的理論依據(jù)。

1???? 材料與方法

1.1?? 材料與試劑

龍牙百合多糖的兩種純化物 LLP1、LLP2，由南昌大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室提供;鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸，Pharmacia。濃硫酸、鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐、 咔唑、蒽酮等，國產(chǎn)分析純。

1.2?? 儀器與設(shè)備

VIS-7200 紫外可見分光光度儀，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司; Milli-Q 超純水儀， 美國 Millipore 公司;Labconco Free Zone 2L 凍干機， 美國 LABCONCO;Nicolet FT-IR 5700 型 傅 立 葉 紅 外 光 譜 儀，Thermo Electron Corporation;Agilent 6890 氣相色譜儀，美國 Agilent 公司;Bruke-DMX-400MHz 核磁共振儀，Bruker 公司。

1.3?? 試驗方法

1.3.1?????? 理化性質(zhì)分析

溶解性：用水、乙醇、丙酮、正丁醇、二甲亞砜考察百合多糖溶解性。

I2-KI 反應(yīng)：稱取百合多糖凍干品 2 mg，溶于 2 mL 蒸餾水，加入 1.2 mL 碘試劑（含 0. 02% I2 的 0.2% KI 溶液），充分混勻后用紫外可見記錄光譜儀于 200-700 nm 掃描[4]。

糖醛酸含量測定：硫酸—咔唑法。取 7 支具塞比色管，依次加入 1 mL 濃度為 0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL 的半乳糖醛酸標(biāo)準溶液，在冰水浴中向各管加入 6 mL 濃硫酸、搖勻， 于 85 ℃水浴中加熱 20 min，取出后立即冷至室溫，加 0.1% 咔唑無水乙醇溶液0.2 mL、搖勻，于室溫暗處保持 2 h，測定吸光度 A530 nm，建立線性回歸方程，取樣品液 1 mL，用同樣方法測定，通過線性計算糖醛酸含量。

1.3.2?????? 單糖組成分析

（1）氣相色譜條件

分離柱，DB-1701 彈性石英毛細管柱（30 m×Φ 0.32 mm）; 升溫程序160 ℃ 保持 2 min， 以 10 ℃ /min 升溫至 240 ℃， 保持 15 min; 載氣 N2 流速2.1 mL/min，進樣量 1 μL;分流比 1 ∶ 20。

（2）單糖糖腈乙酸酯衍生物的制備[5]

取 8 種標(biāo)準單糖加入鹽酸羥胺 10 mg、內(nèi)標(biāo)物肌醇六乙酰酯 7 mg、無水吡啶1 mL，90 ℃水浴中振蕩加熱 30 min，取出后冷至室溫，加入 1 mL 無水醋酸酐，90 ℃下繼續(xù)反應(yīng) 30 min 進行乙?；?，冷卻后加入 1 mL 超純水?dāng)嚢?，然后分別用 1 mL、0.5 mL 氯仿萃取 2 次，合并氯仿層，減壓抽干后加入 1 mL 氯仿溶解， 產(chǎn)物過 0.45 μm 微濾膜，濾液進行 GC 分析。LLP1、LLP2 的硫酸水解產(chǎn)物按同樣方法制備、分析。

1.3.3?????? 高碘酸氧化

高碘酸鈉消耗量標(biāo)準曲線的繪 制[6]： 分別配制 0.015 mol/L NaIO4 和0.015 mol/L NaIO3 溶液，分別取適量 NaIO4 和 NaIO3 溶液以5∶ 0、4∶ 1、3∶ 2、2 ∶ 3、1 ∶ 4 和 0 ∶ 5（V/V）混合，取混合液 0.4 mL 用水定容至 100 mL，測吸光值A(chǔ)223nm，以混合液中 NaIO4 的濃度（mol/L）為橫坐標(biāo)，以A223nm 為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準曲線。

分別取 LLP1 和 LLP2 各 10 mg 溶于 20 mL 的 0.015 mol/L 高碘酸鈉中， 置4 ℃冰箱，間或振搖，于 24 h 間隔取樣，每次 0.4 mL，用水定容至 100 mL，測定吸光度 A223nm，直至吸光度基本穩(wěn)定。通過標(biāo)準曲線計算得每摩爾糖基（以單糖殘基數(shù)為基準）消耗 IO4- 的量（mol）。

同時取樣 4.0 mL，加 2 滴乙二醇，放置 20 min，以酚酞為指示劑，用0.01 mol/L NaOH 溶液滴定甲酸生成量， 測定 0.015 mol/L NaIO3 溶液的吸光值A(chǔ)223nm，將吸光度值與原 NaIO4 溶液相比較，根據(jù) NaIO4 濃度下降的數(shù)值，推算出平均每個糖基所消耗 NaIO4 的量。

1.3.4?????? Smith 降解及氣相色譜分析

上述經(jīng)高碘酸鈉氧化的剩余樣品溶液，加 2 mL 乙二醇攪拌 30 min，室溫放置 2 h，流水透析 48 h、蒸餾水透析 24 h，濃縮后加入 40 mg KBH4，室溫暗處攪拌 24 h，用 0.1 mol/L 的醋酸調(diào) pH 值至 5.0，流水透析 48 h、蒸餾水透析24 h，減壓蒸干。加入 2 mol/L 三氟乙酸 3 mL，真空封管后 100 ℃水解 8 h，

減壓蒸干，加入 3 mL 甲醇，減壓蒸干 3 次，置真空干燥箱減壓干燥過夜。加入 1 mL 吡啶、1 mL 醋酸酐，真空封管后 100 ℃反應(yīng) 1 h，過 0.45 μm 微濾膜，減壓蒸干。加 0.5 mL 氯仿溶解，進行氣相色譜分析，同時取 8 種標(biāo)準單糖、赤蘚醇、甘油各 3 mg 作為標(biāo)準品，同樣處理后進行氣相色譜分析，色譜條件同單糖分析。

1.3.5?????? 紅外光譜分析

稱取干燥的多糖樣品 1 ～ 2 mg，KBr 研磨后壓 片，用紅外光譜儀在 400 ～ 4000 cm-1 區(qū)內(nèi)進行掃描，初步分析多糖的構(gòu)型[7]。

1.3.6?????? 1H NMR 和 13C NMR 光譜分析[8]

取樣品 30 mg， 冷凍干燥 72 h， 溶于 0.5 mL D2O 中，測定其 1H NMR 和13C NMR 譜。

2???? 結(jié)果與討論

2.1?? 百合多糖的理化性質(zhì)

2.1.1?????? 溶解性

LLP1 為白色絮狀固體，極易吸潮。溶于水和二甲亞砜，尤易溶于熱水，不溶于高濃度乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑，水溶液呈透明黏稠狀。LLP2 為淡黃色絮狀固體，易吸潮，溶于熱水和二甲亞砜，不溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑。

2.1.2?????? I2-KI 反應(yīng)

兩種百合多糖的I2-KI 反應(yīng)結(jié)果見圖 1，反應(yīng)物在 565 nm 處均無最大吸收， 說明兩種多糖存在較長的側(cè)鏈和較多的分枝。LLP1、LLP2 的 I2-KI 反應(yīng)均呈陰性， 說明不含淀粉。

2.1.3?????? 糖醛酸含量

由半乳糖醛酸標(biāo)準曲線得回歸方程：

A530nm=4.6817C -0.0586，相關(guān)系數(shù) R2=0.9912??? （1）

式中：A530nm 為反應(yīng)物吸光度值;C 為半乳糖醛酸濃度，μg/mL。

用同樣方法測定 LLP1、LLP2 半乳糖醛酸濃度，計算得 LLP1、LLP2 的糖醛酸含量分別為 4.02%、77.13%。

2.2?? 單糖組分分析

標(biāo)準單糖GC 分析結(jié)果見圖 2，LLP1、LLP2 單糖組成的GC 分析結(jié)果分別見圖 3、4。通過保留時間定性分析，LLP1 中主要含有甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖， 其摩爾比為 18.60 ∶ 25.14 ∶ 1.00;LLP2 主要含半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，其摩爾比為 3.58 ∶ 1.00 ∶ 1.09。

2.3?? 高碘酸氧化 -Smith 降解及氣相色譜分析

2.3.1?????? 高碘酸氧化

由高碘酸鈉消耗量標(biāo)準曲線得回歸方程：

y=0.0079x+0.0946，相關(guān)系數(shù) R2=0.9992 （2）

式中：y 為反應(yīng)體系吸光度值;x 為高碘酸鈉的濃度，mol/L。

多糖樣品經(jīng)高碘酸氧化完全后，根據(jù)標(biāo)準曲線算出每摩爾糖基消耗的高碘酸鈉摩爾數(shù)，并用 NaOH 滴定、算出每摩爾糖基產(chǎn)生的甲酸數(shù)，結(jié)果見表 1。

由表1 看出，LLP1 有甲酸生成，而 LLP2 沒有，說明 LLP1 存在1→6 位鍵合的糖基或非還原末端糖基，LLP2 沒有該類型糖基;兩種多糖的高碘酸消耗量大于甲酸生成量的二倍，說明含有只消耗高碘酸不產(chǎn)生甲酸的 1 → 2 糖苷鍵或1 → 4 糖苷鍵;兩種多糖的高碘酸消耗量減去甲酸生成量均小于1，說明都含有不能被高碘酸氧化的 1 → 3 糖苷鍵。

2.3.2?????? Smith 降解及氣相色譜分析

圖5 顯示，LLP1 的 Smith 降解產(chǎn)物檢出大量甘油，說明主鏈含有大量 1 → 2或 1 → 6 鍵型;葡萄糖的檢出，說明該單糖存在不被高碘酸氧化的 1 → 3 鍵型;未檢出赤蘚醇說明不存在 1 → 4 糖苷鍵。

圖6 顯示，LLP2 的 Smith 降解產(chǎn)物檢出大量甘油，說明主鏈以 1 → 2 或 1 → 6 鍵型為主，但高碘酸氧化結(jié)果顯示 LLP2 無甲酸生成，因此判斷 LLP2 主鏈以 1 → 2 鍵型為主。與未經(jīng)氧化的樣品相比，半乳糖的檢出說明該糖中的半乳糖以不被高碘酸氧化的 1 → 3 鍵型為主;未檢出赤蘚醇說明不存在 1 → 4 糖苷鍵。

2.4?? 紅外光譜分析

4000 cm-1 ～ 1300 cm-1 的頻區(qū)是官能團區(qū)， 用于鑒別官能團的存在。LLP1、LLP2 分別在 3417.3 cm-1 和 3422.9 cm-1 處有強且寬的吸收峰，系多糖上的 O-H 形成分子間、內(nèi)氫鍵;2924.4 cm-1 和 2926.5 cm-1 附近的肩峰為飽和 C-H 伸縮振動的信號，中等強度。3400 cm-1 和 2900 cm-1 左右的吸收峰為多糖類物質(zhì)的特征峰。LLP1 在 1735.2 cm-1 和 1637.7 cm-1 處有較弱的吸收峰， LLP2 在 1743.5 和 1618 cm-1 有很強的吸收峰， 均為 C=O 鍵的伸縮振動峰， 推斷 LLP1 中含有少量糖醛酸，而 LLP2 含有大量糖醛酸，與硫酸—咔唑法測定結(jié)果一致。

LLP1、LLP2 在 1200 ～ l000 cm-1 之間出現(xiàn) 3 個強吸收峰，此為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，說明兩種多糖屬于吡喃糖。1060 cm-1 附近出現(xiàn)的峰是常見的羥基和吡喃糖環(huán)內(nèi)酯吸收產(chǎn)生的吸收峰，是由于糖環(huán) C-O-H 和 C-O-C 伸縮振動形成， 構(gòu)成了糖類的特征吸收峰。

1300 cm-1 以下頻區(qū)是用于整個分子特征分析的指紋區(qū)。LLP1 在 890 cm-1 和 810 cm-1 附近有吸收峰，表明其含有α 型和β 型糖苷鍵。LLP2 在 840 cm-1 附近有明顯的吸收峰表明其含有α 型糖苷鍵;LLP2 在638.3 cm-1 附近有吸收峰， 說明 LLP2 存在酰胺鍵;LLP2 在 950 cm-1 有吸收峰，表明存在鼠李糖。

2.5?? 核磁光譜分析結(jié)果

2.5.1?????? LLP 和 LLP 的 1H NMR 光譜結(jié)果分析

在異頭質(zhì)子區(qū)（δ4.7-5.5 ppm），LLP1 在 δ4.71 處有明顯的信號峰，表明 LLP1 主要含有β 型糖苷鍵，同時在 δ5.37 和 δ5.45 處有微弱的信號峰，說明 LLP1 含有少量α 型糖苷鍵;LLP2 在 δ5.04 和 δ5.11 處有較強的信號峰，說明LLP2 主要含有α 型糖苷鍵。

2.5.2?????? LLP1 和 LLP2 的 13C NMR 光譜結(jié)果分析

LLP1 的 13C NMR 譜中，異頭碳出現(xiàn) 3 個主要的譜峰（100.12 ppm、100.27 ppm、102.63 ppm），說明含有α 型和β 型糖苷鍵;77-81 ppm 之間組峰為 C3、C4 位被取代后形成的峰，70-77 ppm 之間組峰為C2、C3、C4 或C5 位未被取代后形成的峰，60.27 ppm 為 C6 位未被取代后形成的峰。

LLP2 的 13C NMR 譜中，異頭碳的化學(xué)位移小于 103 ppm，說明含有α 型糖苷鍵;譜圖中出現(xiàn)羰基吸收峰（170.95 ppm），為糖醛酸羧基的特征信號，進一步證實了 LLP2 存在糖醛酸;δ52.99 ppm 處強烈的譜峰是蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的化學(xué)位移信號，說明 LLP2 中存在蛋白質(zhì);δ20.5 ppm 處見碳信號，說明 LLP2 中含甲基糖。

3 結(jié)論

根據(jù)文獻報道[9]，多糖中糖醛酸的含量、有無結(jié)合蛋白、糖苷鍵的結(jié)合形 式等與其生物活性密切相關(guān)，分子結(jié)構(gòu)的微小變化都會影響活性。經(jīng)過一系列 的化學(xué)及色譜分析方法，發(fā)現(xiàn)兩種百合多糖在結(jié)構(gòu)上有較大區(qū)別。LLP1 含有少量糖醛酸，由甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖組成，主鏈含有大量1 → 2 或1 → 6 鍵型、非還原末端糖基，且含有α 和β 兩種類型的糖苷鍵;LLP2 含有大量糖醛酸， 且為糖蛋白復(fù)合物，由半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖組成，主鏈含有大量1 → 2 鍵型， 含有α 型糖苷鍵。本次研究結(jié)果為分析龍牙百合多糖組分與生物活性之間的關(guān)系、藥理功能和作用機制提供重要的理論依據(jù)。

參考文獻

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[2]李玉萍，皮小芳，劉成梅，等.百合多糖降糖作用機理的體外研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2012，23（8）：1964-1966.

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[9]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，1999.

Study on Physicochemical Properties and Structural Characterization of Polysaccharides from Lilium Longya

Chen Xiaomeng1??? Liu Chengmei2

1.??? Shanghai Trade School， Shanghai;

2.??? State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang

Abstract： Crude polysaccharides were extracted from fresh Lilium longya by water extraction and alcohol precipitation. Two polysaccharides LLP1 and LLP2， were isolated and purified by DEAE-Sepharose Fast Flow， and their physicochemical properties were analyzed， and the structures of the two polysaccharides were characterized by various chromatographic methods. The results showed that both LLP1 and LLP2 were easy to absorb moisture， soluble in hot water and dimethyl sulfoxide， but insoluble in organic solvents， and the uronic acid content was 4.02% and 77.13% respectively， without starch. Gas chromatographic analysis showed that LLP1 monosaccharides were composed of mannose， glucose and arabinose， with a molar ratio of 18.60， 25.14， and 1.00， LLP2 monosaccharides were galactose， rhamnose and arabinose， with a molar ratio of 3.58 to 1.00 and 1.09. Infrared scanning and nuclear magnetic resonance analysis show that LLP1 is a glucopyranose ring， contains α-type and β-type glycosidic bonds， contains a small amount of uronic acid， LLP2 is a glucopyranose ring， contains α-type glycosidic bonds， and is a glycoprotein complex. The results of periodate oxidation and Smith degradation showed that there were a large number of 1' 2 or 1' 6 glycosidic bonds and non-reducing terminal glycosidic bonds in LLP1 main chain， 1' 3 glycosidic bonds in glucose， 1' 2 glycosidic bonds in LLP2 main chain， 1' 3 glycosidic bonds in galactose， and no 1' 3 glycosidic bonds in rhamnose and arabinose.

Key words： Lilium longya; Polysaccharides; Physicochemical properties; Structural characterization