環(huán)境壓力對益生菌沖劑活性的影響

莫景康 黎紹基

摘 要：為了解益生菌沖劑中的益生菌對環(huán)境壓力的耐受性，本研究測定了市面上3種不同品牌的益生菌沖劑（A、B、C）所含益生菌在不同膽鹽濃度、不同鹽酸pH值、不同H2O2濃度下的耐受能力。結(jié)果表明，12 h內(nèi)3個產(chǎn)品在最高膽鹽濃度（0.4%）中的活性均表現(xiàn)優(yōu)秀；在pH＜6.5時，隨著pH值的升高3個產(chǎn)品的活性均呈現(xiàn)遞增趨勢；在H2O2濃度低于0.013 3%時，隨著H2O2濃度的升高A、B、C產(chǎn)品活性均呈現(xiàn)遞減趨勢。并在0.01% H2O2濃度下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)C產(chǎn)品對H2O2有較強的適應能力，能在該濃度下成功生長繁殖。本研究的結(jié)果可為進一步推進相關標準的建立提供依據(jù)，也為開發(fā)更好的益生菌產(chǎn)品提供參考。

關鍵詞：益生菌；耐受性；存活率

Effect of Environmental Stresses on the Activity of Probiotic Granule Products

MO Jingkang， LI Shaoji*

（Guangzhou College of Technology and Business， Guangzhou 510000， China）

Abstract： In order to evaluate the tolerance of probiotic granule products against different environmental stresses， viability of three commercial probiotic granule products （designated as A， B and C） exposed to bile salt， HCl and H2O2 were measured as salt， acid and oxidative stresses， respectively. Within 12 h， the activities of products A， B and C under the highest bile salt concentration of 0.4% were not affected. At pH＜6.5， the activities of all the three products showed an increasing trend with the increase of pH. When the concentration of H2O2 was lower than 0.013 3%， the activities of all the three products decreased with the increase of H2O2 concentration. During 48 h of continuous culture at the concentration of 0.01% H2O2， product C showed strong adaptability to H2O2 and could grow and reproduce successfully at this concentration. The results can provide a valuable reference for future establishment of relevant food standards and development of even better probiotic products.

Keywords： probiotics; tolerance; survival rate

益生菌是指寄生在人體內(nèi)，與人體形成共生關系并對人體健康有利的微生物。常見的益生菌有乳桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌以及球菌等[1]。益生菌能在宿主腸道內(nèi)定植并產(chǎn)生乳酸、細菌素和過氧化氫等物質(zhì)，抑制腸道內(nèi)的有害微生物，促進宿主腸道健康。目前，它們被廣泛應用于食品和醫(yī)藥領域[2-3]。

益生菌在食品生產(chǎn)過程中和進入消化道后都可能經(jīng)歷各種環(huán)境壓力，因此良好的環(huán)境壓力耐受性對益生菌至關重要。靳志強等[4]采用MRS培養(yǎng)基模擬胃酸環(huán)境以及膽鹽環(huán)境，分離提取出一種可以承受pH=3的環(huán)境以及膽鹽濃度為0.3%的環(huán)境的植物乳桿菌。李利等[5]從酸奶中分離出的2株乳桿菌具有優(yōu)良的抗酸性以及抗膽鹽能力。李一娟等[6]發(fā)現(xiàn)從健康家禽新鮮糞便中分離出來的羅伊氏乳桿菌在經(jīng)過pH=2.5、1.5 g·L-1膽鹽以及1 mmol·L-1 H2O2接種處理6 h后，活菌數(shù)基本能維持初始濃度。

為了解市面上的益生菌沖劑所含的益生菌在不同環(huán)境壓力下的活性，本研究以市場上在售的3種益生菌沖劑產(chǎn)品為研究對象，檢驗其中的益生菌對酸、膽鹽以及抗氧化性壓力的耐受性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將有效期內(nèi)的3種益生菌沖劑產(chǎn)品（表1）接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)活化，每24 h傳代。實驗時將OD在0.5～1.0的3種細菌培養(yǎng)液在

4 000 r·min-1離心10 min，離心后去掉上清液，用生理鹽水懸浮，重復以上離心、懸浮、離心，然后將菌體懸浮于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，使OD≈1.0待用。

MRS固體培養(yǎng)基和豬膽鹽購自北京奧博星生物技術有限公司，過氧化氫溶液購自廈門安永博科技有限公司，MRS液體培養(yǎng)基購自杭州百思生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對環(huán)境壓力條件篩選

借鑒袁琨等[7]實驗方法，將OD≈1.0的3種產(chǎn)品的益生菌用膽鹽、酸和過氧化氫處理，具體濃度如下，每個處理重復3次。A：膽鹽濃度0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%（w/v）；B：pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和6.5；C：H2O2濃度0%、0.003 3%、0.006 7%、0.010 0%、0.0133%（v/v）；37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，測量3種益生菌產(chǎn)品在600 nm的OD值。

1.2.2 環(huán)境壓力耐受能力測定

借鑒袁琨等[7]實驗方法，將OD=0.5～1.0的3種產(chǎn)品培養(yǎng)液按上述方法清洗并懸浮于MRS中，使OD≈1.0，立刻對菌液進行以下4種處理，每個處理重復3次。A：0.3%膽鹽作為膽鹽壓力；B：pH值為2作為酸性壓力；C：0.01% H2O2作為氧化壓力；D：無壓力的對照。菌液在37 ℃培養(yǎng)，在第4 h、8 h、12 h、24 h和48 h測OD。以時間為橫坐標，以OD為縱坐標作各壓力組和對照組的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 無環(huán)境壓力下生長情況

由圖1知，在無壓力環(huán)境中，A、C產(chǎn)品益生菌在24 h時菌落達到穩(wěn)定期并持續(xù)到48 h。而B產(chǎn)品益生菌在24 h時正處于穩(wěn)定期，在48 h時進入衰亡期。

2.2 耐膽鹽能力

在12 h內(nèi)，3種產(chǎn)品對不同膽鹽濃度的適應能力都較強，在0.4%膽鹽濃度下3種產(chǎn)品都能成功繁殖生長。其中在0.1%膽鹽濃度下A、C產(chǎn)品益生菌耐受能力優(yōu)于無膽鹽對照組，在0.4%膽鹽濃度下B產(chǎn)品益生菌耐受能力優(yōu)于無膽鹽組（圖2）。依據(jù)此結(jié)果，選取0.3%膽鹽濃度用于動態(tài)活性研究。

3種產(chǎn)品在0.3%膽鹽濃度下培養(yǎng)48 h的動態(tài)活性如圖3所示。3種產(chǎn)品在4 h測定時菌落總數(shù)已經(jīng)達到頂峰，往后開始進入衰亡期。與無壓力對照組相比可以看出，0.3%濃度膽鹽對3種產(chǎn)品的菌株都具有較強的促進生長能力。

2.3 耐酸能力

在pH值為1.5～3.0培養(yǎng)12 h時，3種產(chǎn)品的益生菌均處于抑制狀態(tài)，而在pH值為3.5時A、C產(chǎn)品益生菌能進行少量繁殖且C產(chǎn)品益生菌比A產(chǎn)品益生菌繁殖稍強，而B產(chǎn)品益生菌仍被抑制，無法繁殖。說明A、C產(chǎn)品益生菌的耐酸能力比B產(chǎn)品好（圖4）。依據(jù)此結(jié)果，選取pH=2.0用于動態(tài)活性研究。

在pH值為2.0下，在培養(yǎng)的48 h內(nèi)，A、B產(chǎn)品益生菌被全程抑制，C產(chǎn)品益生菌能進行少量繁殖。說明在胃酸強度的pH下（pH=2.0），3種產(chǎn)品益生菌的耐受能力一般（圖5）。

2.4 抗氧化能力

在H2O2濃度為0.003 3%時培養(yǎng)12 h，對3種產(chǎn)品的益生菌抑制作用不明顯，H2O2濃度高于0.006 7%時，3種產(chǎn)品益生菌生長受限?？梢哉f明3種益生菌具有一定的抗氧化能力（圖6）。依據(jù)此結(jié)果，選取0.010 0% H2O2濃度用于動態(tài)活性研究。

在0.010 0% H2O2中的動態(tài)生長情況如圖7所示。3種益生菌沖劑所含益生菌在0.010 0%固定濃度的H2O2中培養(yǎng)48 h，A、B產(chǎn)品的益生菌全程被抑制，無生長。而C產(chǎn)品益生菌在48 h監(jiān)測時，發(fā)現(xiàn)成功繁殖并達到最高菌落濃度。

3 結(jié)論

3種益生菌產(chǎn)品在膽鹽濃度為0.1%、0.2%、0.3%和0.4%下均能保持活性，且A和C產(chǎn)品在0.1%的濃度下出現(xiàn)益生菌生長速度超過無壓力對照組的情況，說明低濃度膽鹽能促進部分益生菌產(chǎn)品的生長繁殖。在pH值低于3.5時，3種產(chǎn)品的益生菌生長活性受限，無法大量繁殖，說明3種益生菌產(chǎn)品耐酸性一般。使用低濃度的H2O2處理后，發(fā)現(xiàn)3種益生菌在低濃度的H2O2（0.003 3%）濃度下能進行生長繁殖，可以說明3種益生菌產(chǎn)品都有一定的抗氧化性能。如何提高產(chǎn)品益生菌的耐消化活性，是各個廠家研發(fā)人員需要重點解決的問題。對益生菌沖劑產(chǎn)品的探究，能為市場監(jiān)管部門提供數(shù)據(jù)支撐，幫助研發(fā)人員更好地開發(fā)該類產(chǎn)品。

參考文獻

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[3]許寧寧，余梓涵，刁世童，等.益生菌在代謝綜合征中的潛在作用及研究進展[J].重慶醫(yī)學，2019，48（13）：2297-2300.

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[7]袁琨，沈昊陽，賈東芬，等.基于生長時間光譜法的大腸菌群快速檢測儀器的設計[J].中國計量大學學報，2018，29（3）：345-350.