黃芪多糖通過調節(jié)腸道菌群抑制高脂飲食小鼠腸道炎癥反應

張競男， 苑 紅， 馬春麗， 李 麗， 徐宋瑤，張俊鋒， 霍 達， 任貴強， 扈瑞平*

（1. 內蒙古醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院， 內蒙古 呼和浩特 010110；2. 內蒙古醫(yī)科大學 護理學院， 內蒙古 呼和浩特 010110）

進入互聯(lián)網時代，伴隨人們生活方式的改變和不良飲食習慣的影響，肥胖、糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化等代謝性疾病的發(fā)病率逐漸上升，已經成為威脅大眾健康的普遍公共衛(wèi)生問題。 代謝性疾病的主要發(fā)病原因是營養(yǎng)物質代謝過剩誘發(fā)的慢性炎癥反應[1]。 近年來許多研究證實腸道菌群與代謝、炎癥反應、免疫功能等密切相關，并參與脂代謝等生理過程[2-4]。

植物多糖的膳食干預可通過調節(jié)腸道菌群結構或多樣性，發(fā)揮減輕炎癥反應、調節(jié)血脂代謝等作用[5]。 黃芪多糖（APS）是黃芪主要活性成分之一，作為免疫增強劑在抗腫瘤、抗病毒等方面具有免疫調節(jié)作用[6-7]；能夠有效調節(jié)血脂水平并改善胰島素抵抗，發(fā)揮控制血糖、改善心血管功能的作用[8-9]。 作者給高脂飲食小鼠自由飲用黃芪多糖溶液，通過考察小鼠血清炎癥因子和腸道菌群的變化，探究黃芪多糖是否可通過調節(jié)腸道菌群改善其腸道炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

黃芪多糖（質量分數(shù)70%）：上海易恩化學技術有限公司產品；30 只C57BL/6J 雄性小鼠：北京斯貝福生物技術有限公司提供；總膽固醇（TC）含量測定試劑盒、甘油三酯（TG）含量檢測試劑盒、小鼠脂多糖 （LPS）ELISA 試劑盒、 小鼠免疫球蛋白A（IgA）ELISA 試劑盒、小鼠免疫球蛋白M（IgM）ELISA 試劑盒、小鼠免疫球蛋白G（IgG）ELISA 試劑盒、小鼠白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒、小鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒：江蘇酶免實業(yè)有限公司產品；正庚烷、異丙醇（均為分析純）：西隴科學股份有限公司產品。

1.2 儀器與設備

Forma 900 series 超低溫冰箱、Multiskan FC 酶標儀： 賽默飛世爾科技有限公司產品；DNP 型恒溫培養(yǎng)箱：精宏科技有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及分組 將C57BL/6J 小鼠適應性喂養(yǎng)7 d，隨機分為對照組（C） 、模型組（M）、黃芪多糖處理組（D），每組10 只。 對照組喂標準飼料和飲用水，模型組喂高脂飼料和飲用水，黃芪多糖處理組喂高脂飼料和2 g/dL 黃芪多糖溶液。 連續(xù)喂養(yǎng)11 周后采樣。

1.3.2 樣本采集和處理 取樣前12 h 禁食，收集小鼠糞便于離心管中用于高通量測序，記錄小鼠體質量。 采用斷頭法取血于離心管中，靜置30 min，于4℃、3000 r/min 離心15 min，分離血清。 迅速剝離脾臟、腎臟周圍脂肪組織，并稱質量。

1.3.3 血脂、LPS、炎癥因子、免疫球蛋白指標的測定根據(jù)試劑盒說明測定血清樣本中的TC 濃度、TG 質量濃度， 根據(jù)ELISA 試劑盒說明測定血清樣本中LPS 水平，根據(jù)ELISA 試劑盒說明測定血清樣本中IL-1β、IL-6、TNF-α 質量濃度， 根據(jù)ELISA 試劑盒說明測定血清樣本中IgA、 IgG、IgM 質量濃度。

1.3.4 腸道菌群分析 采用CTAB/SDS 方法提取總細菌基因組DNA。 選用上游引物515F（5′-GTGCC AGCMGCCGCGGTAA-3′）和下游引物806R（5′-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴增細菌16S rRNA的V3～V4 區(qū)。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗結果以均值±標準差的形式表示， 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 進行處理， 用Bonferroni 法進行方差分析，分析組間差異，認為P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。 高通量測序結果采用OTUs 聚類分析法，進行物種注釋及豐度分析。

2 結果與分析

2.1 APS 對體質量、脂肪質量、脾臟指數(shù)的影響

表1 為飼喂APS 后小鼠體質量、 脂肪質量、脾臟指數(shù)的變化。 與對照組比較，模型組小鼠體質量增加9.69%，脂肪質量增加（P＜0.01），脾臟指數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪多糖干預后小鼠體質量增加，脂肪質量減少，脾臟指數(shù)升高接近對照組小鼠，但均無明顯差異。

表1 各組小鼠的體質量、脂肪質量、脾臟指數(shù)比較Table 1 Comparison of the weight，the weight of fat and spleen index among the three groups

2.2 APS 對血脂水平的影響

APS 對實驗小鼠血脂水平的影響如圖1 所示。由圖可知，與對照組相比，模型組總膽固醇、甘油三酯水平明顯升高（P＜0.01），說明高脂飲食喂養(yǎng)后小鼠脂質代謝發(fā)生異常；與模型組相比，黃芪多糖處理組血清總膽固醇濃度明顯降低（P＜0.01）。 這說明APS 顯著改善了高脂飲食小鼠的總膽固醇異常狀態(tài)。

圖1 APS 對血脂水平的影響Fig. 1 Effect of APS on plasma indexes

2.3 APS 對血清中LPS 水平的影響

APS 對實驗小鼠血清LPS 水平的影響如圖2所示。與對照組相比，模型組LPS 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪多糖處理組LPS 水平顯著降低（P＜0.01）。 說明APS 能夠降低因高脂飲食引起的LPS 水平升高。

圖2 APS 對內毒素LPS 水平的影響Fig. 2 Effect of APS on LPS

2.4 APS 對血清免疫球蛋白質量濃度的影響

APS 對實驗小鼠血清免疫球蛋白質量濃度的影響如圖3 所示。 與對照組相比，模型組IgA、IgG、IgM 質量濃度降低，其中IgA、IgG 有顯著性差異（P＜0.05）。 與模型組相比， 黃芪多糖處理組小鼠血清IgA、IgG、IgM 質量濃度升高，但無統(tǒng)計學意義。高脂飲食影響血清中免疫球蛋白的質量濃度，攝入APS能夠增加血清中免疫球蛋白質量濃度。

圖3 APS 對血清免疫球蛋白質量濃度的影響Fig. 3 Effect of APS on serum immunoglobulin level

2.5 APS 對炎癥因子質量濃度的影響

APS 對實驗小鼠血清炎癥因子質量濃度的影響如圖4 所示。 與對照組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 質量濃度均升高， 其中IL-1β、IL-6 差異明顯（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪多糖處理組的IL-1β、IL-6、TNF-α 質量濃度均降低，其中IL-1β 質量濃度有顯著性差異（P＜0.01）。 高脂飲食導致血清炎癥因子增多，而APS 可以降低血清中炎癥因子質量濃度，尤其是IL-1β 的質量濃度。

圖4 APS 對炎癥因子質量濃度的影響Fig. 4 Effect of APS on the level of inflammatory factors

2.6 APS 對腸道菌群的影響

如圖5 和表2 所示，與對照組比較，模型組小鼠腸道內的有益菌擬桿菌門（Bacteroidota）相對豐度下降（P＜0.05），有害菌厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度增加，且擬桿菌門與厚壁菌門比值減小，但差異不明顯。 與模型組小鼠相比，黃芪多糖干預后，擬桿菌門相對豐度有所增加，厚壁菌門相對豐度有下降趨勢，擬桿菌門與厚壁菌門比值升高，但差異不顯著。 說明長期高脂膳食會破壞小鼠腸道門水平上的菌群比例， 引起小鼠腸道菌群紊亂，APS 可調節(jié)高脂膳食導致的菌群結構失調。

圖5 門水平上各組小鼠含量前10 的菌群物種相對豐度Fig. 5 Relative abundance of top 10 bacterial species of mice in each group at phylum level

表2 黃芪多糖對肥胖小鼠腸道擬桿菌門、 厚壁菌門相對豐度的影響Table 2 Effect of APS on relative abundance of Bacteroidota and Firmicutes in the obese mice

如圖6所示，在屬水平，對照組以Jeotgalicoccus、Desulfovibrio、Dubosiella 為主， 其中Jeotgalicoccus、Dubosiella 屬于厚壁菌門，Desulfovibrio屬于Desulfobacterota； 模型組以Lachnospiraceae_NK4A136_group、 Lactobacillus 、 Colidextribacter 、Intestinimonas 為主，均屬于厚壁菌門；黃芪多糖處理 組 以Ileibacterium、Bifidobacterium、Psychrobacter為主、其中Ileibacterium 屬于厚壁菌門，Bifidobacterium屬于放線菌門（Actinobacteriota），Psychrobacter 屬于變形菌門（Proteobacteria）。 與對照組相比，模型組小鼠以厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，說明高脂飲食改變腸道菌群結構；黃芪多糖干預后，可改善因高脂飲食導致的菌群失調， 而且增加有益菌雙歧桿菌（Bifidobacterium）相對豐度。

圖6 屬水平上各組小鼠腸道菌群比例的三元圖Fig. 6 Ternary plot of the proportion of intestinal flora in each group at genus level

2.7 討論

研究表明，長期高脂飲食可以持續(xù)改變腸道微生態(tài)[10]，腸道菌群結構失衡，引起致病菌數(shù)量增加，增加內毒素產生， 影響腸上皮細胞的基因表達，使腸黏膜通透性增加[11-12]，內毒素進入血液循環(huán)，激活TLRs（Toll 樣受體）家族中TLR4，觸發(fā)炎癥信號通路[13]。 除此之外，脂肪組織中的NLRs（NOD 樣受體）信號通路通常處于激活狀態(tài)[14]，其中NLRP3 以炎性小體的形式，促進內源性和外源性危險信號轉化為IL-1。 大量研究提示巨噬細胞是脂肪組織中最主要的炎癥細胞[15]，脂代謝異常時巨噬細胞向M1 型巨噬細胞極化[16]，分泌IL-6、TNF-α 等炎癥因子，誘發(fā)持續(xù)的慢性炎癥反應，導致機體代謝紊亂[17-18]。 本實驗中黃芪多糖能夠在門水平上增加擬桿菌門相對豐度，降低厚壁菌門相對豐度，升高擬桿菌門與厚壁菌門比值。 增加的擬桿菌門可以將植物中的糖類物質分解為益生元，減輕炎癥[19]；擬桿菌門與厚壁菌門比值的上升直接影響腸道菌群對膳食纖維的代謝，使短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid，SCFAs）濃度升高，SCFAs 可以誘導腸道中調節(jié)性T 細胞產生和分化，從而促進抑炎因子IL-10 的產生，發(fā)揮抗炎作用[20-21]。 在屬水平上有益菌雙歧桿菌屬增多，能夠改善小鼠內毒素血癥[22]，并對腸黏膜屏障具有保護作用[23]，降低LPS 負荷，降低LPS 增多觸發(fā)的炎癥信號通路，減少血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α質量濃度。 表明黃芪多糖可以調節(jié)菌群結構，增加有益菌生長，對腸道慢性炎癥起到抑制作用。

小鼠由于長期高脂飲食，造成能量過剩，這部分能量轉化為脂肪儲存在體內[24]。 當血漿中膽固醇濃度增高時， 細胞膜膽固醇合成受抑制， 從而使B淋巴細胞增殖和對抗原信息的識別功能受到限制，進而導致免疫球蛋白分泌減少[25]。 黃芪多糖作為中藥黃芪的活性成分，既可以在免疫低下時提高機體免疫力，又可以在炎癥持續(xù)時，降低炎性水平[26]。 本研究中黃芪多糖可通過提高免疫器官脾臟指數(shù)，促進免疫球蛋白分泌，增強小鼠免疫功能，降低炎癥因子水平。 已有文獻報道，臨床常用藥物二甲雙胍可以降低血清炎癥因子IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平[27]，抑制炎癥發(fā)展[28-30]。

3 結語

黃芪多糖能夠調節(jié)高脂飲食小鼠腸道菌群結構，增強小鼠免疫功能，抑制LPS 引起的腸道炎癥，改善脂代謝異常。 黃芪多糖與二甲雙胍在抑制腸道炎癥方面具有相似功效，為將其開發(fā)作為預防或治療代謝性疾病的保健品或藥物提供實驗依據(jù)。