γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠氧化還原狀態(tài)及免疫功能的影響

陳巍文， 朱建津*， 黃建平， 李浙烽， 蔡平梨

（1. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 杭州康德權(quán)飼料有限公司，浙江 杭州 311107；3. 徐州市銅山區(qū)家禽技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 徐州 221100）

社會(huì)壓力、不良情緒和環(huán)境污染等都會(huì)使人體產(chǎn)生應(yīng)激， 在應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體對(duì)能量的需求增加，機(jī)體積極分解以提供應(yīng)激所需的能量，而此時(shí)就伴隨著活性氧[1]（Reactive oxygen species，ROS）等高活性分子產(chǎn)生增多。 當(dāng)應(yīng)激持續(xù)存在或過(guò)于強(qiáng)烈時(shí)，過(guò)量自由基產(chǎn)生，體內(nèi)氧化和抗氧化動(dòng)態(tài)平衡被打破，從而導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激[2]。 應(yīng)激會(huì)通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺 （Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)等對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[3]，另外體內(nèi)過(guò)量ROS 會(huì)對(duì)免疫細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成破壞，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)功能障礙[4]。 因此，尋找安全、高效、經(jīng)濟(jì)的抗氧化劑對(duì)于緩解氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成的損傷具有重要意義。

已有研究表明[5-8]，γ-谷維素和半胱胺都能夠在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力， 對(duì)抗氧化應(yīng)激， 主要通過(guò)直接捕捉和清除體內(nèi)過(guò)多自由基，間接增強(qiáng)各種抗氧化酶的活力及提高體內(nèi)非酶性抗氧化物質(zhì)的含量等來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，提高機(jī)體的總抗氧化能力。Zhu 等發(fā)現(xiàn)γ-谷維素通過(guò)提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶 （Catalase，CAT） 和 谷 胱 甘 肽 過(guò) 氧 化 物 酶（Glutathione peroxidase ，GSH-Px）活性，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)改善抗氧化防御系統(tǒng)，減輕乙醇誘導(dǎo)的肝損傷[9]。 Zhou 等發(fā)現(xiàn)在育肥豬的日糧中添加半胱胺可顯著提高空腸黏膜中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量和GSH-Px 活性，并降低了丙二醛（Malondialdehyde ，MDA）的濃度，同時(shí)增加了分泌型免疫球蛋白A（Secretory immunoglobulin A，SIgA）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）和免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）的濃度，表明半胱胺可以改善育肥豬的抗氧化能力和免疫功能[10]。 但是高劑量半胱胺具有毒性[11]，反而會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的過(guò)氧化物和自由基，使機(jī)體抗氧化能力降低。

作為細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場(chǎng)所，線粒體[12]不僅是體內(nèi)ROS 的主要來(lái)源， 更是ROS 攻擊的首要靶點(diǎn)。 過(guò)量ROS 的攻擊造成線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損， 氧化磷酸化過(guò)程發(fā)生障礙， 同時(shí)進(jìn)一步造成ROS 的積累[13]，形成惡性循環(huán)。 此外，線粒體功能障礙會(huì)對(duì)細(xì)胞、組織和器官的功能造成破壞，從而引發(fā)一系列疾病如肥胖、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病[14]等。如果抗氧化劑可以進(jìn)入線粒體內(nèi)部，就可以直接從源頭上捕獲和清除自由基，從而有效發(fā)揮抗氧化作用。 考慮到γ-谷維素[15]脂溶性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，而半胱胺[16]主要存在于細(xì)胞漿中，因此作者將探討γ-谷維素和半胱胺是否可以分別在線粒體內(nèi)外發(fā)揮作用，從而在對(duì)抗氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能上起到協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為90 只5 周齡SPF 級(jí)別ICR 雄性小鼠，許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0003，初始體質(zhì)量為（25.49±0.75） g，購(gòu)自上海斯萊克生物科技有限公司。

γ-谷維素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；包膜半胱胺（質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%）：杭州康德權(quán)飼料有限公司產(chǎn)品；強(qiáng)的松：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；過(guò)氧化氫酶（CAT)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD)試劑盒、錳-SOD 試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒：南京建成生物工程研究所提供； 總蛋白質(zhì)定量（BCA法）試劑盒、線粒體提取試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、ATP 含量測(cè)定試劑盒： 上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；小鼠乙酰輔酶A（Acetyl coenzyme A，A-CoA）ELISA 試 劑 盒、 小 鼠 免 疫 球 蛋 白A（Immunoglobulin A，IgA）ELISA 試劑盒、免疫球蛋白M （IgM）ELISA 試劑盒、 免疫球蛋白G（IgG）ELISA試劑盒、 小鼠腫瘤壞死因子α （Tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試 劑 盒、 白 細(xì) 胞 介 素6（Interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒、白細(xì)胞介素10（Interleukin-10，IL-10）ELISA 試劑盒： 江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Sceintz-48 型高通量組織研磨器： 寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；5804R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；電熱壓力蒸汽滅菌器： 上海申安醫(yī)療儀器儀表廠制造；Epoch 酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek 公司產(chǎn)品；R686VLT 超低溫冷凍冰箱：美國(guó)INVETRO 公司產(chǎn)品；Mettle Toledo AB204-N電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；XB70 制冰機(jī)：美國(guó)GRANT 公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋：精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng) 將90 只5 周齡雄性ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6 組：正常組、模型組、谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組，每組15 只，每3 d 進(jìn)行一次皮下注射，正常組注射生理鹽水，其他組注射40 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)）的強(qiáng)的松進(jìn)行造模。 正常組和模型組飼喂正常飼料，其他4 組每kg 飼料中γ-谷維素和半胱胺的添加質(zhì)量分別為40 mg＋0 mg、0 mg＋60 mg、20 mg＋30 mg、40 mg＋60 mg。 飼養(yǎng)時(shí)間為8 周。

1.3.2 血漿和組織中生化指標(biāo)的測(cè)定 小鼠飼養(yǎng)8周后， 眼球取血至抗凝管中，4 ℃、4000 r/min 離心10 min，取上層血漿于-80 ℃保存，用于后續(xù)氧化還原指標(biāo)和免疫指標(biāo)的測(cè)定。 取適量心臟、肝臟、空腸加入預(yù)冷的生理鹽水， 勻漿離心制得10 g/dL 的組織勻漿， 用于蛋白質(zhì)含量和氧化還原指標(biāo)的測(cè)定，并于-80 ℃保存。另取適量心臟、肝臟和空腸在小鼠處死2 h 內(nèi)進(jìn)行線粒體的提取， 并加入儲(chǔ)存液進(jìn)行重懸，用于線粒體蛋白質(zhì)含量、抗氧化指標(biāo)的測(cè)定以及線粒體功能的評(píng)價(jià)。其余組織于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 胸腺、脾臟大小的測(cè)定 在處死小鼠前記錄小鼠體質(zhì)量，處死后分別稱量小鼠胸腺和脾臟的質(zhì)量，以胸腺和脾臟的質(zhì)量（mg）與體質(zhì)量（g）的比值計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM)表示，多組均值采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，多重比較采用Duncan’s 法，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)總SOD 活力的影響見圖1。 由圖中可以看出，模型組在心臟、肝臟和空腸中的總SOD 活力均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組在心臟、 肝臟和空腸中的總SOD 活力均顯著高于模型組（P＜0.05），其中在心臟和肝臟中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 谷維素組在心臟和空腸中的總SOD 活力顯著高于模型組（P＜0.05），在肝臟中無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。半胱胺組和聯(lián)用2 組在心臟、肝臟和空腸中的總SOD 活力較模型組高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠組織總SOD 活力的影響Fig. 1 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on total SOD activity in tissues of stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)GSH-Px 活力的影響見圖2。 由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟、空腸和血漿GSH-Px活力均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟、空腸和血漿GSHPx 活力相對(duì)于模型組均有顯著提高（P＜0.05），其中在心臟、 肝臟和空腸中GSH-Px 活力與正常組無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）。 半胱胺組心臟、 肝臟和血漿GSH-Px 活力均顯著高于模型組（P＜0.05），但均低于聯(lián)用1 組， 空腸GSH-Px 活力與模型組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 谷維素組和聯(lián)用2 組心臟、肝臟、空腸和血漿GSH-Px 活力高于模型組， 但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)GSH-Px 活力的影響Fig. 2 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on GSH-Px activity in stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)總抗氧化能力 （Total antioxidant capacity，T-AOC）的影響見圖3。 由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟、空腸和血漿中T-AOC 均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟、空腸和血漿中T-AOC 相對(duì)于模型組均有顯著提高（P＜0.05），其中在心臟、肝臟和血漿中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 谷維素組肝臟中T-AOC 顯著高于模型組（P＜0.05），心臟、空腸和血漿中T-AOC 與模型組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。半胱胺組和聯(lián)用2 組心臟、肝臟、空腸和血漿中TAOC 相較于模型組有所提高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)總抗氧化能力的影響Fig. 3 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on T-AOC in stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)MDA 水平的影響見圖4。由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟、空腸和血漿MDA 水平均顯著高于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的降低。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟、空腸和血漿中MDA 水平相對(duì)于模型組均有顯著降低（P＜0.05），其中在心臟、肝臟和血漿中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。谷維素組心臟和肝臟中MDA 水平顯著低于模型組（P＜0.05）， 但在空腸和血漿中MDA 水平與模型組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 半胱胺組結(jié)果與谷維素組類似。聯(lián)用2 組肝臟MDA 水平顯著低于模型組（P＜0.05），在心臟、空腸和血漿中MDA 水平相對(duì)于模型組略有降低，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠體內(nèi)MDA 水平的影響Fig. 4 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on MDA content in stressed mice

2.2 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體氧化還原狀態(tài)和功能的影響

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體Mn-SOD 活力的影響見圖5。 由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟和空腸線粒體Mn-SOD 活力均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟和空腸線粒體Mn-SOD 活力均顯著高于模型組（P＜0.05），其中在肝臟中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 谷維素組肝臟和空腸線粒體Mn-SOD 活力顯著高于模型組（P＜0.05），在心臟中無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。半胱胺組和聯(lián)用2 組心臟、肝臟和空腸線粒體Mn-SOD 活力較模型組高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖5 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體Mn-SOD 活力的影響Fig. 5 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on mitochondrial Mn-SOD activity in stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體MDA 質(zhì)量摩爾濃度的影響見圖6。由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟和空腸線粒體MDA 質(zhì)量摩爾濃度均顯著高于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的降低。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟和空腸線粒體MDA 質(zhì)量摩爾濃度相對(duì)于模型組均有顯著降低（P＜0.05），其中在肝臟和空腸中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。谷維素組心臟、肝臟和空腸線粒體MDA 質(zhì)量摩爾濃度均顯著低于模型組 （P＜0.05），但也均顯著高于聯(lián)用1 組（P＜0.05）。 半胱胺組空腸線粒體MDA 質(zhì)量摩爾濃度顯著低于模型組（P＜0.05）， 但在心臟和肝臟中線粒體MDA 質(zhì)量摩爾濃度相對(duì)于模型組略有降低，但差異不顯著（P＞0.05）。 聯(lián)用2 組結(jié)果與半胱胺組類似。

圖6 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體MDA 質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig. 6 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on mitochondrial MDA content in stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體膜電位的影響見圖7。 由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟和空腸線粒體膜電位均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟和空腸線粒體膜電位均顯著高于模型組（P＜0.05），其中在空腸中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。谷維素組心臟、肝臟和空腸線粒體膜電位均顯著高于模型組（P＜0.05），但均低于聯(lián)用1 組。 半胱胺組和聯(lián)用2 組心臟、肝臟和空腸線粒體膜電位較模型組略高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖7 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體膜電位的影響Fig. 7 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on mitochondrial membrane potential in stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體乙酰輔酶A 質(zhì)量摩爾濃度的影響見圖8。 由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟和空腸線粒體乙酰輔酶A 質(zhì)量摩爾濃度均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟和空腸線粒體乙酰輔酶A 質(zhì)量摩爾濃度均顯著高于模型組（P＜0.05），其中在肝臟中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 谷維素組肝臟和空腸線粒體乙酰輔酶A 質(zhì)量摩爾濃度均顯著高于模型組（P＜0.05），但在心臟中與模型組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。半胱胺組和聯(lián)用2 組空腸線粒體乙酰輔酶A質(zhì)量摩爾濃度顯著高于模型組（P＜0.05），心臟和肝臟線粒體乙酰輔酶A 質(zhì)量摩爾濃度較模型組略高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖8 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體乙酰輔酶A 質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig. 8 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on A-CoA content in mitochondria of stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度的影響見圖9。由圖中可以看出，模型組心臟、肝臟和空腸線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組心臟、肝臟和空腸線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度均顯著高于模型組（P＜0.05）， 其中在心臟和肝臟中與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 谷維素組心臟、肝臟和空腸線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度均顯著高于模型組（P＜0.05），但均低于聯(lián)用1 組。聯(lián)用2 組肝臟線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度顯著高于模型組（P＜0.05），心臟和空腸線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度與模型組無(wú)顯著性差異。半胱胺組心臟、肝臟和空腸線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度較模型組略高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖9 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠線粒體ATP 質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig. 9 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on ATP level in mitochondria of stressed mice

2.3 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠免疫功能的影響

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠臟器指數(shù)的影響見圖10。 由圖中可以看出，模型組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著高于模型組（P＜0.05），且胸腺指數(shù)與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 谷維素組胸腺指數(shù)顯著高于模型組（P＜0.05），脾臟指數(shù)比模型組略高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。半胱胺組和聯(lián)用2 組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)相對(duì)于模型組略高，但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖10 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠臟器指數(shù)的影響Fig. 10 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on spleen and thymus index in stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠血漿中免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響見圖11。 由圖中可以看出，模型組血漿中免疫球蛋白質(zhì)量濃度均顯著低于正常組（P＜0.05），谷維素組、半胱胺組、聯(lián)用1 組和聯(lián)用2 組相對(duì)于模型組均有一定程度的提高。 聯(lián)用1 組血漿中免疫球蛋白質(zhì)量濃度均顯著高于模型組（P＜0.05），其中IgM 和IgG 質(zhì)量濃度與正常組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 谷維素組和聯(lián)用2 組血漿中IgG 質(zhì)量濃度均顯著高于模型組（P＜0.05），IgA 和IgM 質(zhì)量濃度比模型組略高， 但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。 半胱胺組血漿中IgA、IgM 和IgG 質(zhì)量濃度與模型組相比略高， 但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖11 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠血漿中免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig. 11 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on the content of immunoglobulin in plasma of stressed mice

飼料中添加不同劑量的γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠血漿中細(xì)胞因子水平的影響見圖12。由圖中可以看出， 模型組血漿中促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）質(zhì)量濃度均顯著高于正常組（P＜0.05），抑炎因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）質(zhì)量濃度顯著低于正常組（P＜0.05）。 聯(lián)用1組TNF-α 和IL-6 質(zhì)量濃度均顯著低于模型組（P＜0.05），且與正常組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），IL-10 質(zhì)量濃度顯著高于模型組（P＜0.05）。 谷維素組和聯(lián)用2 組TNF-α 和IL-6 質(zhì)量濃度均顯著低于模型組（P＜0.05），但均高于聯(lián)用1 組，IL-10 質(zhì)量濃度比模型組略有提高，但差異不顯著（P＞0.05）。 半胱胺組IL-6 質(zhì)量濃度顯著低于模型組（P＜0.05），TNF-α 和IL-10 質(zhì)量濃度與模型組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖12 γ-谷維素和半胱胺對(duì)應(yīng)激小鼠血漿中TNF-α、IL-6 和IL-10 質(zhì)量濃度的影響Fig. 12 Effect of γ-oryzanol and cysteamine on plasma TNF-α、IL-6 and IL-10 in stressed mice

2.4 討論

超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中的兩種關(guān)鍵酶[17]，可以有效清除自由基。T-AOC 是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激水平和抗氧化能力的重要指標(biāo)[18]。MDA 是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，也用于衡量機(jī)體氧化應(yīng)激水平。 研究表明，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化酶的活性和含量大幅下降， 同時(shí)MDA水平顯著升高[19]，而抗氧化劑的補(bǔ)充可緩解這一狀況。 半胱胺可以通過(guò)發(fā)揮抗氧化作用來(lái)緩解應(yīng)激，劉智通過(guò)在仔豬飼料中添加半胱胺顯著提高了血漿中GSH-Px 的活力[20]。 γ-谷維素由于其結(jié)構(gòu)中的阿魏酸基團(tuán)可以在生物體內(nèi)發(fā)揮較好的抗氧化作用， 研究表明，γ-谷維素可以提高小鼠肝臟和血清中CAT、SOD、GSH-Px 和GSH 的活性，同時(shí)顯著降低MDA 的含量[21-22]。 本研究結(jié)果表明，模型組體內(nèi)總SOD 活力、GSH-Px 活力和T-AOC 顯著低于正常組，且MDA 水平顯著高于正常組，表明成功建立了氧化應(yīng)激模型；γ-谷維素和半胱胺單用時(shí)均可以在一定程度上提高機(jī)體的抗氧化能力，緩解應(yīng)激，與前人研究結(jié)果一致；聯(lián)用1 組體內(nèi)的抗氧化酶活力及T-AOC 相對(duì)于模型組均有顯著提高，MDA 水平顯著降低，在4 組用藥組中對(duì)抗氧化應(yīng)激的效果最明顯，說(shuō)明低劑量γ-谷維素與半胱胺聯(lián)用顯著改善了機(jī)體的氧化損傷，考慮可能是由于γ-谷維素因其脂溶性結(jié)構(gòu)可以進(jìn)入線粒體內(nèi)清除自由基[23]，而半胱胺在胞漿中發(fā)揮作用[16]，并使GSH-Px 活力顯著提高，二者在體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用；但是當(dāng)二者以較高劑量聯(lián)用時(shí)， 并沒(méi)有表現(xiàn)出這種作用，可能是由于高劑量的半胱胺具有細(xì)胞毒性[24]，反而加重了氧化應(yīng)激。

過(guò)量ROS 對(duì)線粒體膜、 蛋白質(zhì)及DNA 進(jìn)行攻擊造成氧化損傷， 從而引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，表現(xiàn)為線粒體膜電位降低[25]、氧化磷酸化等能量代謝過(guò)程紊亂、ATP 合成減少[12，26]等。 線粒體Mn-SOD 活力及MDA 含量是衡量線粒體抗氧化能力及其內(nèi)部氧化還原狀態(tài)的重要指標(biāo)。線粒體膜電位[27]、乙酰輔酶A[28]和ATP 含量常被用來(lái)作為衡量線粒體功能的重要指標(biāo)。 研究表明，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)抗氧化酶活性降低，線粒體結(jié)構(gòu)和功能被破壞，最終引起細(xì)胞凋亡[29]。 本研究結(jié)果顯示，模型組線粒體Mn-SOD 活力相對(duì)于正常組顯著降低，MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，且膜電位、能量代謝中間物A-CoA 和ATP 質(zhì)量摩爾濃度顯著降低， 表明模型組小鼠線粒體內(nèi)部氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，受到氧化損傷，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，與前人研究結(jié)果一致；谷維素組總體上可以緩解氧化應(yīng)激造成的線粒體功能受損，類似的，蔣維維表示γ-谷維素作為抗氧化劑可有效對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體膜電位的降低，減輕細(xì)胞損傷[13]；但是本研究結(jié)果中半胱胺組對(duì)線粒體功能的調(diào)節(jié)作用不明顯， 而聯(lián)用1組的效果在4 組用藥組中最為顯著，可明顯提高應(yīng)激小鼠體線粒體內(nèi)Mn-SOD 活力， 降低MDA 質(zhì)量摩爾濃度， 顯著改善了線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化程度，且使線粒體膜電位、A-CoA 和ATP 水平得到顯著提升， 有效緩解了應(yīng)激條件下造成的線粒體損傷，推測(cè)可能是一方面γ-谷維素進(jìn)入線粒體直接有效地中和了過(guò)多的ROS，另一方面半胱胺和γ-谷維素間接作用于內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，提高線粒體內(nèi)抗氧化酶的活性，來(lái)共同抵御線粒體氧化損傷和功能受損。

脾臟和胸腺是機(jī)體發(fā)揮免疫作用的重要場(chǎng)所，其大小可以在一定程度上反映機(jī)體的免疫功能強(qiáng)弱[30]。 研究表明，機(jī)體在應(yīng)激條件下會(huì)發(fā)生免疫抑制，出現(xiàn)免疫器官萎縮，細(xì)胞因子異常釋放，血液中免疫球蛋白水平降低等。 本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于正常組，模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)、血漿中IgA、IgM 和IgG 質(zhì)量濃度和抑炎因子IL-10 質(zhì)量濃度顯著降低， 促炎因子TNF-α 和IL-6 質(zhì)量濃度顯著升高，表明應(yīng)激小鼠體內(nèi)免疫功能受損，與前人結(jié)論一致。 田媛媛表示谷維素可能通過(guò)下調(diào)TNF-α 和IL-6 相關(guān)基因表達(dá)來(lái)抑制促炎因子的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用[31]，與本研究谷維素組結(jié)果一致。 王建峰等發(fā)現(xiàn)，半胱胺可以通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)的抗氧化能力來(lái)提高機(jī)體的免疫能力[32]，但本研究結(jié)果中半胱胺組的作用效果沒(méi)有那么顯著，可能是實(shí)驗(yàn)條件造成的差異。 本研究中聯(lián)用1 組對(duì)應(yīng)激小鼠的免疫功能起到明顯的調(diào)節(jié)作用，在4 組用藥組中效果最顯著，與上面的研究結(jié)果一致，表明當(dāng)γ-谷維素與半胱胺以較低劑量聯(lián)用時(shí)可能通過(guò)緩解小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激來(lái)有效調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答功能。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究結(jié)果表明，γ-谷維素和半胱胺單獨(dú)使用對(duì)應(yīng)激小鼠的氧化還原狀態(tài)和免疫功能均有一定程度的改善作用，但是當(dāng)二者以較低劑量聯(lián)用時(shí)的作用效果比較高劑量的單用和聯(lián)用都顯著，表明當(dāng)γ-谷維素和半胱胺以較低劑量聯(lián)用時(shí)可以起到協(xié)同作用，在體內(nèi)充分發(fā)揮抗氧化功效，進(jìn)而調(diào)整機(jī)體免疫系統(tǒng)。 究其原因，可能是γ-谷維素直接進(jìn)入到線粒體內(nèi)部清除自由基，而半胱胺在線粒體外的細(xì)胞漿內(nèi)發(fā)揮作用，二者共同幫助機(jī)體增強(qiáng)抗氧化防御體系，但其作用部位及具體的作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究。