一例蛋雞沙門氏菌和大腸桿菌混合感染的實驗室診斷

張應(yīng)斌

（濟(jì)南市鋼城區(qū)艾山街道辦事處畜牧獸醫(yī)站，濟(jì)南 271104）

蛋雞沙門氏菌是一種可通過水平接觸或種蛋垂直傳播的細(xì)菌性傳染病，可感染雛雞、育成雞和成年雞等不同年齡段雞只，2～3周齡雛雞易感性高，并出現(xiàn)生長遲緩[1]，而成年雞感染后會影響生殖系統(tǒng)，母雞輸卵管膨大、阻塞，卵巢萎縮、變性，公雞睪丸變小、變硬。家雞、火雞是家禽中發(fā)病率較高的品種，尤其在當(dāng)今規(guī)?；⒓s化生產(chǎn)下，蛋雞沙門氏菌病在我國乃至世界各地均有流行，嚴(yán)重威脅蛋雞的健康生產(chǎn)[2]。蛋雞大腸桿菌病是一種可通過呼吸道或消化道途徑傳播的細(xì)菌性傳染病，容易因氣候驟變、長途運輸、養(yǎng)殖密度過高、驚嚇等造成蛋雞免疫功能下降，進(jìn)而感染不同日齡家禽[3]。由于不同地區(qū)蛋雞大腸桿菌致病性血清型不同，并可通過接觸進(jìn)行不同血清型交叉感染，給蛋雞生產(chǎn)造成巨大威脅。由于上述兩種細(xì)菌性傳染病具有發(fā)病率高、傳播途徑廣、易產(chǎn)生耐藥性等特點，會增加蛋雞的死淘率，養(yǎng)殖戶必須做好該病的防控?，F(xiàn)將山東省濟(jì)南市一例蛋雞大腸桿菌與沙門氏菌混合感染病例的診斷過程報道如下。

1 病例基本情況

山東省濟(jì)南市鋼城區(qū)金谷源養(yǎng)殖場共飼養(yǎng)蛋雞100 多只，2022 年11 月有14 只蛋雞發(fā)病，診斷前已有3只死亡。對發(fā)病蛋雞進(jìn)行臨床癥狀診斷，發(fā)現(xiàn)病雞精神不振，離群呆立，病雞食欲銳減，部分病雞腹瀉，排泄稀糞，糞便顏色為白色，病雞肛門附近的羽毛也有糞便污染。對病死雞進(jìn)行病理解剖，發(fā)現(xiàn)2只病死雞的血液凝固不良，病死雞的心包腔內(nèi)有許多淡黃色液體，心包膜及外膜表面有淡黃色的纖維膜附著，肝臟體積明顯增大，肝臟表面有許多白色或灰白色的病灶，病雞肺臟腫脹、出血。結(jié)合病雞的臨床癥狀、解剖結(jié)果初步鑒定病雞有病原菌感染的可能，然后通過實驗室檢測的方法對蛋雞感染的病原菌進(jìn)行鑒定。

2 實驗室診斷

2.1 主要試劑

M.H.瓊脂培養(yǎng)基，采購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，采購于默克有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、SS 瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液試劑盒、細(xì)菌試驗所用的藥敏紙片，采購于北京索萊寶科技有限公司；膽硫乳瓊脂、生化鑒定試驗試劑，采購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

2.2 病原分離培養(yǎng)

采集病死雞的肺臟、肝臟，加入適量的生理鹽水（已滅菌）勻漿制成懸液，將懸液分別接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（固體平板）、SS瓊脂培養(yǎng)基（固體平板），將其置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)過20 h左右的培養(yǎng)。然后從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上挑取微紅色或桃紅色的單菌落，將其接種到伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（固體平板），37 ℃培養(yǎng)20 h后，從伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中挑取單菌落，連同先前的SS 瓊脂培養(yǎng)基表面上的黑色單菌落分別制成涂片、革蘭氏染色、純化。

2.3 生化鑒定

將分離純化獲得病原菌分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、蛋白胨水）、β-半乳糖苷酶試驗（ONPG 試驗）、3%氯化鈉三糖鐵試驗、V-P 試驗、甲基紅試驗、尿素酶試驗、賴氨酸脫羧酶肉湯試驗、硫化氫試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)不同生化鑒定試驗管培養(yǎng)時間要求進(jìn)行培養(yǎng)，然后按照生化試驗管的生化反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行鑒定。

2.4 藥敏試驗

將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上分離、純化的大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)18 h后可見LB液體培養(yǎng)基變得渾濁，將試管搖勻，取適量渾濁菌液，加入適量生理鹽水，將菌液制成0.5 號麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管濃度（1.5×108個·mL-1），然后立即用無菌棉棒蘸取菌液涂抹在M.H.瓊脂培養(yǎng)基（固體平板），15～30 s后培養(yǎng)基表面干燥，用鑷子（已滅菌）夾取不同的藥敏紙片，每個培養(yǎng)基平板放置5片藥敏紙片，紙片間的間距大于24 mm，紙片與培養(yǎng)皿邊緣間距大于15 mm，37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行觀察，參照腸桿菌科細(xì)菌的抑菌圈直徑來判斷病原菌的藥物敏感性[4]。

3 結(jié) 果

3.1 分離培養(yǎng)的結(jié)果

3.1.1 菌落生長特征

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：長出圓形或扁平狀、表面濕潤、邊緣整齊的微紅色或桃紅色菌落。還有另一種菌落存在，菌落形狀為圓形凸起，表面濕潤，菌落顏色為透明或半透明狀，菌落中心的顏色變深，呈黑色。

SS 瓊脂培養(yǎng)基：長出圓形、表面光滑、邊緣整齊的乳白色菌落。還有另一種菌落存在，菌落形狀為圓形凸起，表面光滑，無色透明，菌落中心呈黑色。

從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中挑取微紅色或桃紅色的單菌落至伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基表面，可發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基上長出圓形凸起、表面光滑濕潤的深黑色或紫黑色菌落，菌落伴有金屬光澤。

3.1.2 染色結(jié)果

從伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中挑取的單菌落染色后菌體呈紅色，菌體形狀為短小桿狀，菌體為單個、散在分布，依此可以初步判定分離菌為大腸桿菌[5]。

從SS 瓊脂培養(yǎng)基中挑取的單菌落染色后菌體呈紅色，菌體形狀為細(xì)長、桿狀，單個或短鏈狀分布，可初步判定為沙門氏菌[6]。

3.2 生化鑒定的結(jié)果

大腸桿菌的鑒定結(jié)果顯示葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、蛋白胨水、ONPG、甲基紅、賴氨酸脫羧酶肉湯試驗中呈陽性，在3%氯化鈉三糖鐵中產(chǎn)氣不產(chǎn)H2S，在乳糖、蔗糖、鼠李糖、VP、尿素酶、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗中呈陰性。見表1。

沙門氏菌的鑒定結(jié)果顯示葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、甲基紅、賴氨酸脫羧酶肉湯、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗中呈陽性，在3%氯化鈉三糖鐵試驗中產(chǎn)氣、產(chǎn)H2S，在乳糖、蔗糖、蛋白胨水、ONPG、V-P、尿素酶試驗中呈陰性。見表1。

表1 病原菌的生化鑒定試驗結(jié)果

3.3 藥敏試驗的結(jié)果

大腸桿菌的耐藥、中度敏感、高度敏感藥物數(shù)量分別是7 種、2 種、6 種，沙門氏菌的耐藥、中度敏感、高度敏感藥物數(shù)量分別是5 種、3 種、7種，見表2。

表2 病原菌的藥敏試驗結(jié)果

4 治療建議

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，可以選用中度敏感的硫酸鏈霉素，按體重1 mg·kg-1肌肉注射，也可口服用藥，劑量為0.5～1 g，1次·d-1，連續(xù)用藥3 d。最好選用高度敏感的阿米卡星，肌肉一次性注射15 mg，也可在每100 kg 飲水中加入67 g，自由飲用，連續(xù)用藥3 d。同時，為防止蛋雞因腹瀉出現(xiàn)嚴(yán)重脫水，需要保障飲水充足、干凈，同時為提高蛋雞群的免疫力，可在蛋雞飲水中添加適量的黃芪多糖，可在每100 kg飲水中加入20 g黃芪多糖粉劑，連續(xù)飲用1周。

5 防控措施

5.1 環(huán)境控制

5.1.1 人和車消毒

雞場大門口設(shè)立足夠長、寬的消毒池，消毒試劑可選用2%氫氧化鈉溶液，上方設(shè)立頂棚和噴淋裝置，對入場車輛進(jìn)行消毒登記。駕駛員未消毒前不能隨意下車，需要佩戴一次性鞋套后進(jìn)入人員消毒室進(jìn)行消毒，人員消毒方法為腳踩3%氫氧化鈉消毒池，經(jīng)過紫外線消毒通道，手部用0.1%新潔爾滅清洗。

5.1.2 種蛋和蛋雞消毒

種蛋可通過熏蒸法進(jìn)行消毒，即種蛋入孵前進(jìn)行消毒，每立方米用清水7 mL+40%甲醛溶液14 mL+高錳酸鉀7 g，混勻后熏蒸，時長控制在20 min[7]。孵化設(shè)備在熏蒸消毒時需要關(guān)閉機(jī)門和通氣孔道，在熏蒸結(jié)束后需要將設(shè)備內(nèi)的殘余氣體排凈后再使用。

種雞可通過噴霧法進(jìn)行消毒，為減少消毒試劑的毒性和藥物殘留，可以使用小型背包式噴霧器在雞群頭部上方60 cm處進(jìn)行噴霧，消毒試劑為0.015%的百毒殺溶液。

5.1.3 雞舍消毒

每周對雞舍環(huán)境進(jìn)行消毒，消毒前全面清掃，徹底去除雞群糞便和殘余、變質(zhì)飼料，雞舍消毒試劑可選用0.1%新潔爾滅或0.3%過氧乙酸溶液[8]，消毒后用清水全面沖洗，保持地面干燥，這樣可以減少病原菌滋生。雞舍飲水管線最好間隔3 d 清洗、消毒1 次，每周消毒時可以加入0.1%有機(jī)酸，這樣可提高飲水管線內(nèi)部清潔度。

5.2 定期檢測

規(guī)?；B(yǎng)殖場要加強(qiáng)種雞的管理，定期進(jìn)行病原菌的血清學(xué)檢測[9]，并根據(jù)發(fā)病情況制定隔離、淘汰制度，降低病原菌擴(kuò)散，逐步建立凈化雞群。

5.3 科學(xué)引種

蛋雞引種前進(jìn)行大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌的流行病學(xué)調(diào)查，保證所引種的雞群來自非疫區(qū)[10]。同時，引種后要對每批引種雞只進(jìn)行血清抽樣檢測，若發(fā)現(xiàn)有病原陽性結(jié)果，需要整群隔離處理。

6 體 會

蛋雞日常生產(chǎn)中的用藥預(yù)防對病原菌防治具有積極作用，但是長期以來抗生素防治不僅會產(chǎn)生耐藥性問題，還會影響蛋雞自身健康及蛋品質(zhì)。同時蛋雞生產(chǎn)中禁止使用呋喃類、磺胺類、金霉素、丙酸睪酮、氨茶堿五種藥物，這些藥物不僅會影響蛋雞產(chǎn)蛋性能，還會使蛋雞產(chǎn)軟殼蛋，并損害蛋雞健康。因此，蛋雞生產(chǎn)中需要通過強(qiáng)化日常管理、提高飼養(yǎng)飼喂水平來增強(qiáng)雞群的免疫力，而非依賴藥物。

另一方面，養(yǎng)殖戶需要根據(jù)蛋雞沙門氏菌、大腸桿菌的傳播途徑做好預(yù)防管理，定期做好雞場的人、車、種蛋及孵化設(shè)備、蛋雞消毒處理，通過定期檢測和科學(xué)引種等操作來降低病原菌感染率，保障蛋雞健康生長和生產(chǎn)。