一種PCR 儀溫度校準裝置的溯源方法研究

王在旗 紀金龍 沈在欽 謝學江

（作者單位：廈門市計量檢定測試院）

引言

自2020 年暴發(fā)全球性新冠肺炎疫情以來，針對新型冠狀病毒的核酸檢測方法和設備——聚合酶鏈反應分析儀（也稱基因擴增儀，以下簡稱PCR儀）的研究受到了極大的重視，發(fā)展迅速。聚合酶鏈式反應技術（簡稱PCR 技術）出現(xiàn)于20 世紀80 年代，經過長期的應用、優(yōu)化和發(fā)展，已成為分子生物學領域的一項關鍵技術。其主要是對鏈式反應溫度進行快速改變和精確控制，通過重復循環(huán)變性-退火-延伸實現(xiàn)DNA 序列的體外擴增，從而為進一步的基因檢測提供足夠多的DNA 片段。

PCR 儀最主要的計量參數是溫度，溫度的準確性、均勻性，升溫速率和降溫速率等技術指標的優(yōu)劣直接影響了DNA 序列的擴增效果。如果溫度出現(xiàn)較大的非期望偏離，獲得的DNA 片段數量無法滿足后續(xù)核酸測序的需要，可能直接導致“漏檢”現(xiàn)象，埋下疫情擴散的隱患。目前，各級醫(yī)療機構，特別是城市核酸檢測基地都配置了大量的PCR儀，對其性能的要求也越來越高，這意味著對PCR儀溫度校準裝置的要求也不斷提高。為確保PCR儀溫度的準確可靠，本文擬從PCR 儀溫度校準裝置的溯源方法研究著手，提升PCR 儀溫度校準裝置測量結果的置信水平，保證其對PCR 儀溯源結果的準確可靠。

PCR 儀及其溫度校準裝置概述

PCR 儀市場巨大，國內外品牌及設備類型眾多，但是其加熱模塊基本上都是扁平板狀多孔設計，有24 孔、48 孔、96 孔、384 孔等，其中又以96 孔的PCR 儀最為常見。圖1 是一款比較常見的96孔PCR 儀。

1.PCR 儀的作用及原理

當采集到的樣品中DNA 含量太低，無法滿足正常儀器進行檢測分析的量，就需要將樣品溶解在特定溶劑中，通過PCR 儀來實現(xiàn)樣品中DNA 的擴增，擴增的倍數為2 的N 次方。其工作原理是：雙鏈DNA 在一定的環(huán)境中，通過在90～95℃變性，形成單鏈，然后退火降溫到40～60℃，在引物及其他輔助因子的作用下，使其初步結合，再快速升溫至70～75℃，在相關酶的催化作用下，合成雙鏈，完成一個擴增循環(huán)。通過PCR 儀對溫度的精確控制和快速循環(huán)，達到短時間內高效擴增的效果。

2.PCR 儀溫度校準裝置

PCR 儀溫度校準裝置是用于校準PCR 儀溫度參數的標準裝置，JJF1821—2020 《聚合酶鏈反應分析儀溫度校準裝置校準規(guī)范》明確提出校準裝置組成應包含通常為15 個的數據采集分析模塊、精密溫度傳感器，測溫范圍介于0～120℃之間，測量不確定度不超過0.1℃，且要求定期進行計量檢定。圖2 是一款常見的PCR 儀溫度校準裝置，其核心部件是作為傳感器的測溫模塊，一般采用高精度熱敏電阻探頭，并結合PCR 儀測試孔的形狀，封裝成扁平類采集器，使其與PCR儀完美貼合，確保測溫結果更加真實準確。

PCR 儀溫度校準裝置的溯源方法研究

2020 年國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布了JJF1821—2020《聚合酶鏈反應分析儀溫度校準裝置校準規(guī)范》，為PCR 儀溫度校準裝置的溯源提供了方法依據以及標準裝置的性能指標要求。采用二等及以上等級的標準鉑電阻溫度計與0.005級的電測設備連接構成高精度測溫系統(tǒng)對校準裝置性能進行驗證，同時要求作為提供恒定溫場的主要配套設備——恒溫槽及均溫塊也提出了一定的要求，見下表，均溫塊見圖3。

主要配套設備的性能指標表

規(guī)程JJF1821—2020 采用的校準方案是將PCR 儀溫度校準裝置的測溫模塊封裝在均溫塊內部，并整體浸入恒溫槽中，溫度穩(wěn)定之后讀取測量值。但是這種方法存在兩個方面的主要問題：一是對均溫塊的要求較高，需要絕對密封且無空氣存在，并且測溫模塊的傳感器頭要求與均溫塊緊密貼合。其次均溫塊大部分采用不銹鋼材料制成，即使大部分浸入恒溫槽中，仍會存在較大的軸向導熱，直接影響測試孔的溫度。二是這種溯源方案只能對PCR 儀溫度校準裝置進行定值溯源，無法對測溫模塊傳感器的響應情況進行校準，無法滿足PCR 儀升降溫速率測量的溯源要求。因此本文提出了一種采用一體化快速熱循環(huán)溫變系統(tǒng)對測溫模塊傳感器進行直接測溫的溯源方法，模擬實際PCR 儀工作過程，避免了由均溫塊引入的一系列測量不確定因素，提升了操作便利性以及測量精度，滿足溯源要求。設計流程圖見圖4。

首先，測溫模塊通過模擬PCR 儀的加熱板設計，測試孔的位置形狀能夠與PCR 儀測溫模板的傳感器頭完全貼合。整體采用紫銅材料，孔腔鍍金，提高抗氧化性。測溫板內部為空腔，高導熱液在空腔中快速流動，其中測溫孔腔與導熱液體充分接觸，能夠實現(xiàn)快速換熱和平衡。其次，熱液系統(tǒng)和冷液系統(tǒng)通過流量控制系統(tǒng)將導熱液進行混合后快速泵入測溫模塊的空腔內，溫度測控系統(tǒng)測量測溫模塊空腔內的液體溫度并反饋給熱液系統(tǒng)和冷液系統(tǒng)的相關控制模塊和流量控制系統(tǒng)，進一步調節(jié)混合導熱液體的溫度，達到快速升降溫的目的。最后，回液系統(tǒng)再將導熱液分流至冷熱液系統(tǒng)，實現(xiàn)高效循環(huán)。

總結

PCR 儀通過對基因的快速擴增，滿足了目前新冠病毒核酸檢測樣本數量的需要，是核酸檢測最主要的設備之一。確保PCR 儀參數準確、性能可靠，需要按照國家的規(guī)程規(guī)范，利用PCR 儀溫度校準裝置進行計量。而PCR 儀溫度校準裝置作為標準裝置，其計量性能確認無疑是更加重要。本文通過分析目前常規(guī)溯源方法，發(fā)現(xiàn)采用均溫塊的方案存在諸多容易引入誤差的不確定因素，因此進一步提出采用導熱液快速循環(huán)換熱系統(tǒng)對測溫模塊的傳感器進行直接溯源的方法，這對于PCR 儀溫度校準裝置的溯源方法和標準裝置的改進具有一定的參考價值。