響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助法提取黃秋葵多糖工藝及對(duì)多糖脫色工藝的研究

孫 晗，謝春陽(yáng)，傅俊曦，孟令志，張雅捷，夏 寧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

黃秋葵為錦葵科秋葵屬，最早的栽培技術(shù)起源于埃及，一般認(rèn)為發(fā)源于非洲，是非洲和印度部分地區(qū)飲食中不可分割的一部分。因其具有促進(jìn)健康的功效，在世界各地都被廣泛種植并作為食品和民間藥物[1～3]。黃秋葵(Abelmoschus esculentus L.Moench)，也稱(chēng)秋葵、羊角菜、補(bǔ)腎草，為一年生草本植物[4]。其嫩莢中含有大量的黏性多糖物質(zhì)，主要成分包括果膠多糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖及少量糖蛋白[5,6]。此外，還含有豐富的L-半乳糖醛酸、鼠李糖、D-半乳糖和葡萄糖[7]。黃秋葵根、莖、葉、花、果實(shí)、皆可以食用，其豆莢長(zhǎng)期以來(lái)一直被用作蔬菜和膳食藥物的來(lái)源[8～10]，同時(shí)也可作為治療痢疾，腹瀉等多種疾病的傳統(tǒng)藥物[11]，主要具有促進(jìn)人體消化吸收、提高免疫力、抗炎癥、降血糖、抗氧化、治療皮膚癌及降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖等功效[12～13]。它的種子，花等部位富含類(lèi)黃銅、多酚、果膠、維生素，氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作為功能性食品食用[14]。黃秋葵最突出的特點(diǎn)是粘液，可以起到促進(jìn)消化、防止便秘、促進(jìn)膽固醇物質(zhì)排出體外、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、增強(qiáng)抵抗力，緩解疲勞等功效[15]，而它的豆莢常被用作為粘性食物來(lái)對(duì)抗胃炎[16]。一般來(lái)說(shuō)，黃秋葵中主要能促進(jìn)健康的物質(zhì)稱(chēng)為多糖[17]，秋葵多糖是一種非凝膠性的多糖[18]可作為增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、黏合劑等在食品工業(yè)中應(yīng)用[19～20]，且具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化活性[21]，而秋葵凝膠是從葵花科木槿果實(shí)中提取出來(lái)的陰離子聚合物[22]。近年來(lái)主要集中在天然多糖的研究上，秋葵多糖被稱(chēng)為女士的手指，是一種經(jīng)濟(jì)型的蔬菜，在中國(guó)民間治療利尿，胃潰瘍，腸結(jié)炎[23]，具有很大的研究?jī)r(jià)值。多糖是天然大分子物質(zhì)，具有多種生物活性，如抑制自由基、抗腫瘤，抗癌等，其生物性功能已成為現(xiàn)代化醫(yī)學(xué)和食品功能化學(xué)一個(gè)關(guān)注的焦點(diǎn)[24～25]。

近年來(lái)，從植物、動(dòng)物和微生物中提取的多糖已成為研究的一個(gè)重要領(lǐng)域[26]。目前，關(guān)于植物多糖的提取方法有超聲提取法、水提醇沉法、微波輔助萃取法和酶法等，而超聲提取作為綠色提取方法已經(jīng)廣泛用于加速多糖的提取過(guò)程[27]。多糖的產(chǎn)量往往取決于提取方法的不同，水提醇沉法耗時(shí)長(zhǎng)，超聲提取對(duì)溶劑要求相對(duì)較高，成本高[28]，相比于前兩種方法，采用超聲輔助水提法可彌補(bǔ)兩者缺點(diǎn)。黃秋葵莖中含有大量的色素，導(dǎo)致提取的多糖顏色較深，因此需對(duì)秋葵多糖進(jìn)行脫色處理。脫色是多糖精致的重要步驟之一，傳統(tǒng)的吸附方法有過(guò)氧化氫吸附法，活性炭吸附法和大孔吸附樹(shù)脂吸附法[29～30]。活性炭脫色法效果明顯但多糖保留率相對(duì)較低，H2O2脫色效果好但容易使多糖氧化變質(zhì)，大孔吸附樹(shù)脂不影響多糖結(jié)構(gòu)但脫色效果不如H2O2，具體應(yīng)根據(jù)后期對(duì)提取多糖的應(yīng)用去合理選擇提取方法。新型大孔吸附樹(shù)脂近幾年被廣泛使用研究，在多糖脫色研究上具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃秋葵, 山東青島；無(wú)水乙醇, 天津富宇化工；苯酚, 天津大茂試劑;

濃硫酸, 北京化工廠(chǎng)；無(wú)水葡萄糖, 國(guó)藥試劑；D101大孔吸附樹(shù)脂, 國(guó)藥試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HX1002T電子分析天平, 慈溪市天東衡器廠(chǎng)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋, 常州朗越儀器制造有限公司；L2-4K臺(tái)式離心機(jī), 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；XD-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 上海賢德試驗(yàn)儀器；JY92-Ⅱ超聲細(xì)胞破碎機(jī), 寧波新芝生物科技股份有限公司；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱, 上海一恒科技有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度光度計(jì), 天津天泰儀器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 根據(jù)苯酚硫酸法測(cè)定的吸光值繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.2 秋葵多糖提取工藝流程 新鮮黃秋葵—鼓風(fēng)干燥—粉碎—過(guò)篩—超聲輔助水提—離心(4 000 r/min)(取上清液)—旋蒸濃縮—無(wú)水乙醇醇沉過(guò)夜—二次離心(4 000 r/min)(棄上清液)—烘干—秋葵多糖。

1.3.3 秋葵多糖提取工藝操作要點(diǎn) 主要有:

原料預(yù)處理：選取新鮮飽滿(mǎn)的黃秋葵果實(shí)，除蒂。

干燥：將新鮮黃秋葵切分成2～3 cm的小段，擺放均勻，放入鼓風(fēng)干燥機(jī)，直至干燥至恒重。

粉碎過(guò)篩：利用破碎機(jī)將秋葵打粉，反復(fù)過(guò)60目篩，平均出粉率達(dá)11%

離心：將多糖溶液放入離心機(jī)內(nèi)以4 000 r/s速度離心，離心后取多糖上清液

濃縮：將上清液濃縮至原體積的1/3。

二次離心：加入與濃縮液等體積的無(wú)水乙醇醇沉過(guò)夜。

式中：E-多糖得率；C-吸光值對(duì)應(yīng)濃度；V-體積；N-稀釋倍數(shù)；M-秋葵粉質(zhì)量

1.3.5 脫蛋白處理 脫蛋白：采用sevage試劑法脫蛋白處理，配置sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)，置于分液漏斗中劇烈震蕩直至分層，取上層液，脫蛋白過(guò)程中可脫去少許顏色。

1.4 超聲輔助水提醇沉法提取秋葵多糖單因素試驗(yàn)

以料液比，超聲時(shí)間，水提溫度為單因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，并重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.4.1 料液比試驗(yàn) 稱(chēng)取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸餾水中，當(dāng)水提溫度為70℃，超聲時(shí)間為40 min的條件下，其料液比(g/ml)分別選取1∶35,1∶40,1∶45,1∶50,1∶55,1∶60,1∶65進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2 超聲時(shí)間試驗(yàn) 稱(chēng)取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸餾水中，當(dāng)水提溫度為70℃，料液比為1∶50的條件下，其超聲時(shí)間分別選取25 min，30 min，35 min，40 min，45 min，50 min，55 min進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.3 水提溫度試驗(yàn) 稱(chēng)取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸餾水中，當(dāng)料液比為1∶50，超聲時(shí)間為40 min，水提溫度分別選取40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 超聲波輔助水提醇沉法提取秋葵多糖響應(yīng)面試驗(yàn)

以秋葵粗多糖得率為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助水提醇沉法提取秋葵粗多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 超聲波提取響應(yīng)面因素水平

1.6 D101大孔吸附樹(shù)脂脫色方法

1.6.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理 配置相同濃度的 NaoH溶液和 HCL溶液，分別浸泡D101大孔吸附樹(shù)脂，并用蒸餾水沖洗直至樹(shù)脂呈中性，真空抽氣活化后備用。

1.6.2 D101大孔吸附樹(shù)脂脫色單因素試驗(yàn) 以D101大孔吸附樹(shù)脂用量，脫色時(shí)間，脫色溫度為單因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。在490 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算脫色率，再利用苯酚—硫酸法測(cè)定粗多糖含量，從而測(cè)定多糖保留率，并進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，計(jì)算誤差。

1.6.3 D101大孔吸附樹(shù)脂用量 配置濃度為1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定脫色溫度為40℃，脫色時(shí)間為2 h，設(shè)置大孔樹(shù)脂用量為1%，1.5%，2%，2.5%，3%進(jìn)行脫色，離心，取上清液。

1.6.4 脫色溫度選擇 配置濃度為1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定D101大孔吸附樹(shù)脂用量為2%，脫色時(shí)間2h，設(shè)置脫色溫度為20℃，30℃，40℃，50℃，60℃進(jìn)行脫色，離心，取上清液。

1.6.5 脫色時(shí)間選擇 配置濃度為1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定D101大孔吸附樹(shù)脂用量為2%，脫色溫度40℃，設(shè)置脫色時(shí)間為1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，離心，取上清液。

1.7 D101大孔吸附樹(shù)脂脫色正交試驗(yàn)

表2 D101大孔吸附樹(shù)脂脫色正交試驗(yàn)因素水平

1.8 脫色率計(jì)算公式

式中：D2為脫色率，%；OD0為原樣品的吸光值；OD1為處理后的吸光值。

1.8.1 多糖保留率計(jì)算公式 采用上述苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量。

M=C×V×10-6

式中：M為多糖質(zhì)量，g；C為多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為多糖溶液體積，mL。

多糖保留率：

式中：D3為多糖保留率，%；M3為脫色后多糖含量，g；M2為樣品多糖含量，g。

1.8.2 綜合評(píng)分計(jì)算公式

式中：F為綜合評(píng)分；D2為脫色率，%；D3為多糖保留率，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程

2.2 超聲波輔助水提醇沉法提取粗多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響 由圖2可知，多糖得率在超聲時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到峰值，在25～40 min時(shí)逐步上升，在40～55 min時(shí)逐步下降，可能是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用，從而使多糖得率下降。

圖1 多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖2 超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

2.2.2 液料比對(duì)粗多糖得率的影響 由圖3可知，多糖得率在液料比為50∶1(mL/g)條件下達(dá)到峰值，在35∶1～50∶1時(shí)逐步上升，在50～65min時(shí)逐步下降，可能是因?yàn)檎麴s水變多，多糖被充分溶解，但蒸餾水過(guò)多會(huì)導(dǎo)致秋葵中其他雜質(zhì)析出，從而使多糖得率下降。

圖3 液料比對(duì)粗多糖得率的影響

2.2.3 水提溫度對(duì)粗多糖得率的影響 由圖4可知，多糖得率在水提溫度為70℃時(shí)達(dá)到峰值，在40～70℃時(shí)逐步上升，70～100℃時(shí)逐步下降，可能是因?yàn)闇囟壬仙?，多糖被充分溶解，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)果受熱變性，從而使多糖得率下降。

圖4 水提溫度對(duì)粗多糖得率的影響

2.3 超聲波輔助水提醇沉法提取秋葵粗多糖響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.4 顯著性分析結(jié)果

從表4可以看出該回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，方程對(duì)于該試驗(yàn)擬合度良好，該試驗(yàn)方法可行。分析得出主次因素：料液比(A)>超聲時(shí)間(C)>水提溫度(B)。回歸系數(shù)為0.9877，調(diào)整系數(shù)為0.9719，數(shù)值相近，準(zhǔn)確性可行。建立二次回歸方程：Y=6.68-0.046A+0.22B-0.14C-0.05AB+0.19AC+0.037BC-0.54A2-0.51B2-0.37C2。

表4 回歸模型方差分析

顯著性分析：一次項(xiàng)顯著性分析：A影響顯著，B,C影響極顯著；二次項(xiàng)顯著性分析：A2,B2,C2影響極顯著；交互項(xiàng)顯著性分析：AC影響極顯著。

響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 超聲時(shí)間與水體溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

圖6 超聲時(shí)間與料液比對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

圖7 水提溫度與料液比對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

得出結(jié)論：最優(yōu)工藝條件為：水提溫度68.08℃，超聲時(shí)間41.05 min，液料比49.56(mL/mg)，秋葵多糖得率為6.71%。

2.5 D101大孔樹(shù)脂脫色單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 D101大孔樹(shù)脂用量對(duì)脫色率和多糖保留率的影響 由圖8可知，隨著D101大孔樹(shù)脂用量的增加，多糖脫色效果越來(lái)越好，但多糖保留率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能原因是隨著大孔樹(shù)脂用量的增加，溶劑接觸面增大，色素能夠更好的被吸收，綜合考慮選擇最佳D101大孔樹(shù)脂用量范圍為1%～3%。

圖8 D101大孔樹(shù)脂用量對(duì)脫色率多糖保留率的影響

2.5.2 脫色時(shí)間對(duì)脫色率和多糖保留率的影響 由圖9可知，隨著脫色時(shí)間增加，多糖脫色效果越來(lái)越好，但多糖保留率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于時(shí)間的延長(zhǎng)，色素和多糖長(zhǎng)時(shí)間被樹(shù)脂吸附，從而能夠被更好的吸收。綜合考慮選擇最佳脫色時(shí)間范圍為1～2 h。

圖9 脫色時(shí)間對(duì)脫色率多糖保留率的影響

2.5.3 溫度對(duì)脫色率和多糖保留率的影響 由圖10可知，隨著脫色溫度的升高，色素被更好的吸收，脫色效果遞增，同時(shí)多糖保留率遞減，可能是由于溫度升高有利于分子運(yùn)動(dòng)，使色素充分吸收，而保留率低可能是由于高溫使多糖結(jié)構(gòu)破壞，綜合考慮選擇最佳脫色溫度范圍為20～40℃。單因素脫色效果相對(duì)較低，還有一部分原因是前一部分對(duì)多糖進(jìn)行脫蛋白處理過(guò)程中導(dǎo)致色素部分被脫去。

圖10 脫色溫度對(duì)脫色率多糖保留率的影響

2.6 D101大孔樹(shù)脂脫色脫色正交試驗(yàn)結(jié)果(表6)2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出多糖得率為6.71%。進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出多糖平均得率為6.62%，樹(shù)值接近，結(jié)果可靠。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，得出多糖脫色率為38.05%，保留率為90.76%。進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出多糖平均脫色率為37.88%，平均保留率為90.23%，數(shù)值接近，結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

秋葵多糖富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有抗氧化，抗疲勞，抗炎癥、促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)以及抗癌等多種功效，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于秋葵多糖的研究主要集中在多糖的抗氧化作用，多用于小鼠實(shí)驗(yàn)。而秋葵多糖是一種可再生并且價(jià)格便宜的可生物降解多糖，具有水溶性好、透明度高、可塑性強(qiáng)、黏性高的特點(diǎn)，所以還是一種理想的成膜原料。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于秋葵多糖做可食膜的研究還尚未發(fā)現(xiàn)，因此為今后做可食膜奠定了一定的基礎(chǔ)，具有很大的研究和應(yīng)用價(jià)值。秋葵多糖是一種粘性多糖，其粘液透明度高，拉伸性好，由此做成的可食膜可以幫助解決目前可食膜拉伸性能差的特點(diǎn)，而利用其抗氧化性，可以將其做成抗氧化抑菌類(lèi)的可食膜。由于提取的秋葵多糖顏色較深，如若后期應(yīng)用于制作可食膜，為了不影響外觀，需對(duì)其進(jìn)行脫色處理，而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于多糖脫色方法有三種，即活性炭、過(guò)氧化氫和大孔樹(shù)脂脫色法。而對(duì)于多糖的脫色方法，國(guó)內(nèi)外目前多用選用活性炭，對(duì)大孔樹(shù)脂的研究相對(duì)較少。筆者選用一種新型大孔吸附樹(shù)脂D101，研究它的吸附能力對(duì)秋葵多糖的脫色效果和脫色后多糖保留效果。使用大孔吸附樹(shù)脂要嚴(yán)格注意其活化步驟，若活化不好或不完全，會(huì)嚴(yán)重影響其吸附色素的能力。筆者用新型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)多糖脫色工藝進(jìn)行研究以及對(duì)后續(xù)用秋葵多糖制備可食膜的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。