葡萄膜黑色素瘤生存預(yù)后相關(guān)lncRNA的初步篩選及相關(guān)性分析

尚會平 林祥祥

作者單位：1 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點實驗室，溫州 325027；2 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江省神經(jīng)老化與疾病研究重點實驗室，溫州 325015

葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一種惡性腫瘤，起源于眼睛中的黑色素細(xì)胞。在加拿大，UM的年發(fā)病率為每年每百萬人3.75例。在美國，UM的總發(fā)病率為每百萬人4.637 例。UM轉(zhuǎn)移具有傾向性，大約一半的UM患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其是在肝臟。大約50%的UM患者在診斷后10年內(nèi)會發(fā)生轉(zhuǎn)移。多年來，隨著治療策略的不斷進(jìn)步，腫瘤的控制率有所提高，但生存率尚無明顯提高。

在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)了一系列與UM 預(yù)后相關(guān)的基因。其中黑色素瘤特異性抗原基因

(Preferably presented as an antigen of melanoma

，

PRAME)

與腫瘤的直徑、轉(zhuǎn)移與存活率均呈正相關(guān)關(guān)系。在83%的UM中發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α亞基q基因

(G protein subunit alpha Q

，

GNAQ)

和鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α亞基11基因

(G protein subunit alpha 11

，

GNA11)

的點突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但是，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，

GNAQ

和

GNA11

與UM 的轉(zhuǎn)移及生存率沒有良好的相關(guān)性。在對轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性UM的預(yù)后分析中發(fā)現(xiàn)，p52與各種類型的UM預(yù)后相關(guān)，而RelB的蛋白表達(dá)水平與非轉(zhuǎn)移性UM的生存率相關(guān)。通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（The weighted gene co-expression network analysis，WGCNA），研究人員鑒定出了與UM預(yù)后相關(guān)的一系列關(guān)鍵基因，如：

slic17A7

、

ntrkrk2

、

Abtb1

和

AdpRHL1

等。但是，到目前為止，與UM預(yù)后相關(guān)的基因鑒定工作鮮見報道。本研究從長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)角度出發(fā)，尋找與UM預(yù)后生存相關(guān)的lncRNA，并通過內(nèi)源競爭RNA(Competing endogenous RNAs，ceRNA)機(jī)制的探討，分析候選lncRNA 參與UM發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料

2019年7月13日從腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://cancergenome.nih.gov/)下載最新更新的全部80 例葡萄膜黑色素瘤患者（Project ID:TCGA-UM）的原發(fā)灶RNA-seq測序數(shù)據(jù)（HTSeq-FPKM）、miRNA-seq測序數(shù)據(jù)及其臨床信息，并收集相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、腫瘤TNM分期和生存時間等信息。納入的TCGA-UVM均為原發(fā)灶樣本，且均已經(jīng)過患者病理信息、腫瘤樣本純度、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量等步驟的質(zhì)量控制。

1.2 分析方法

1.2.1 UM預(yù)后相關(guān)lncRNA篩選

使用轉(zhuǎn)錄組相關(guān)軟件Cuffdiff（2.2.1 版本）將FPKM 值轉(zhuǎn)換為每百萬次閱讀的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)(Transcripts Per Million Reads，TPM)。使用統(tǒng)計計算軟件R survival包（4.0.5版本）和生存分析曲線繪制軟件survminer包（0.4.9版本）分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的UM腫瘤信息（TCGA-UM）中l(wèi)ncRNAs表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系。通過檢索RNALocate數(shù)據(jù)庫（http://www.rna-society.org/rnalocate/）篩選可能定位于細(xì)胞質(zhì)的候選lncRNAs。

1.2.2 LncRNA的靶miRNA預(yù)測及與UM生存預(yù)后相關(guān)的靶miRNA篩選

通過mircode數(shù)據(jù)庫（http://www.mircode.org/）檢索lncRNA可能可以結(jié)合的miRNA家族，再通過Targetscan數(shù)據(jù)庫（http://www/targetscan.org/vert_72/）檢索miRNA家族對應(yīng)的miRNA。使用R survival包和survminer包分析TCGA數(shù)據(jù)庫中miRNAs表達(dá)對UM生存預(yù)后的影響，篩選與UM生存預(yù)后相關(guān)的靶miRNA。

1.2.3 miRNA-靶基因關(guān)系的多數(shù)據(jù)庫驗證及靶基因KEGG通路富集分析

通過targetscan數(shù)據(jù)庫（http://www.targetscan.org/），miRTarBas數(shù)據(jù)庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）和miRDB數(shù)據(jù)庫（http://mirdb.org/）檢索候選miRNA對應(yīng)的靶基因。采用KEGG功能富集及其可視化軟件clusterProfiler（4.1版本）對基因集進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.2.4 LncRNA-miRNA-mRNA分析

使用生物信息學(xué)可視化軟件cytoscape（3.9.0版本）對lncRNA-miRNA作用關(guān)系及miRNA調(diào)控靶基因進(jìn)行可視化分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R軟件（4.0.0 版本）進(jìn)行統(tǒng)計、生物信息學(xué)分析并作圖。使用STATS包的Loess函數(shù)，對TCGA-UM RNA-seq中的所有基因的TPM值和生存時間進(jìn)行局部加權(quán)回歸（Loess回歸）分析，將回歸模型預(yù)測時間與實際生存時間值進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，

P

＜0.05 且

r

＞0.8，則認(rèn)為該基因與生存預(yù)后明顯相關(guān)。預(yù)后相關(guān)miRNAs的篩選方法同上。使用 clusterProfiler軟件（3.18.0版本）對所有候選功能基因進(jìn)KEGG通路功能分析，使用 Benjamini-Hochberg法對多重檢驗的

P

值進(jìn)行校正，以校正后

P

＜0.05為富集有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與生存預(yù)后相關(guān)的lncRNAs

本研究篩選到579個表達(dá)水平與生存預(yù)后明顯相關(guān)的lncRNAs（

P

＜0.05），見表1。作為ceRNA中發(fā)揮對下游靶基因調(diào)控作用的lncRNA，一般位于細(xì)胞質(zhì)中。因此，通過 RNALocate數(shù)據(jù)庫，從候選lncRNAs中進(jìn)一步篩選到17 個定位于細(xì)胞質(zhì)的lncRNAs，見表2。

2.2 lncRNA的靶miRNA鑒定結(jié)果

lncRNA可以作為競爭性結(jié)合位點結(jié)合miRNA，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)。因此，我們利用Mircode數(shù)據(jù)庫檢索17個候選lncRNA可能結(jié)合的miRNA家族，并通過targetscan數(shù)據(jù)庫檢索對應(yīng)的miRNA。最終，17個lncRNAs共找到70個miRNA家族以及對應(yīng)的154個靶miRNA分子，見表3。

表1.表達(dá)與生存預(yù)后明顯相關(guān)的lncRNAsTable 1.Expression of lncRNAs significantly correlated with survival prognosis

表2.定位于細(xì)胞質(zhì)的候選lncRNAsTable 2.Candidate lncRNAs localized in cytoplasm

表3.lncRNAs的下游靶miRNAs篩選Table 3.Downstream target miRNAs of lncRNAs

2.3 候選lncRNA下游與生存相關(guān)miRNA-mRNA的鑒定

在鑒定出的154個miRNA基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步明確這些miRNA是否與UM生存預(yù)后相關(guān)。通過Loss回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)120個miRNA與UM的生存預(yù)后明顯相關(guān)（

P

＜0.05）。然后，在154個靶miRNA和與UM預(yù)后相關(guān)的120個miRNA中，通過Venn分析篩選出共同的miRNA，最終篩選到與UM預(yù)后相關(guān)且被lncRNA可能吸附的15 個前體miRNA。見圖1A。

MicroRNA（miRNA）通過與下游功能基因的靶向結(jié)合實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控。因此，通過targetscan數(shù)據(jù)庫（http://www.targetscan.org/）、miRTarBase數(shù)據(jù)庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）和miRDB數(shù)據(jù)庫（http://mirdb.org/）檢索15個前體miRNA對應(yīng)的靶基因，并通過venn方法分析，篩選3個數(shù)據(jù)庫中同時存在的miRNA-mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在miRTarBase數(shù)據(jù)庫中檢索到8 053 個miRNA-mRNA，miRDB數(shù)據(jù)庫中檢索到23 646個miRNA-mRNA，targetscan數(shù)據(jù)庫中檢索到46 377個miRNA-mRNA。多數(shù)據(jù)庫驗證，共篩選到630對共有的miRNA-mRNA，其中29個成熟miRNA和578個基因。見圖1B。

圖1.UM預(yù)后相關(guān)miRNA-mRNAA：候選lncRNAs下游靶miRNAs和UM預(yù)后相關(guān)miRNA的Venn分析；B：Targetscan、miRTarBas、miRDB數(shù)據(jù)庫中共有的候選miRNA-mRNAFigure 1.MiRNA-mRNA associated with prognosis of uveal melanoma.A：Venn analysis of downstream target miRNAs of candidate lncRNAs and prognostic related miRNAs in uveal melanoma.B：Candidate miRNA-mRNAs common to TargetScan,miRTARbas,and miRDB databases.

2.4 預(yù)后相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA結(jié)合miRNA，調(diào)控基因表達(dá)。我們從17個候選lncRNA中鑒定出了9個可能發(fā)揮ceRNA功能的lncRNA（見表4），這些lncRNA調(diào)控578 個功能基因的表達(dá)。然后，對這些候選功能基因進(jìn)行KEGG功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因集中表達(dá)在前列腺癌和胰腺癌中。此外，這些功能基因也集中表達(dá)在PI3K-Akt、MAPK以及Hippo等腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵信號通路，說明鑒定的578個基因中確實存在參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵分子，見圖2A。最后，使用cytoscape軟件繪制ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時我們對富集到的黑色素瘤KEGG通路進(jìn)行了可視化。圖2B展示了SNHG6、LINC01278等lncRNA通過調(diào)控miRNA-mRNA參與UM發(fā)生發(fā)展過程。

3 討論

UM惡性程度高、致死率強(qiáng)。盡管在放化療的作用下，眼部腫瘤的控制得到了明顯改善。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存時間將明顯縮短，其死亡率目前尚無明顯改變。因此，尋找UM生存預(yù)后相關(guān)的診斷指標(biāo)對改善患者的預(yù)后具有重要的臨床價值。如類似EZH2抑制劑3-deazaneplanocin A（DZNep）可抑制人UM細(xì)胞增殖，具有治療UM的應(yīng)用前景。人的3 號染色體缺失及某些基因表達(dá)水平差異可能是用于評估UM預(yù)后的可靠指標(biāo)，UM通常含有激活G蛋白α-q信號級聯(lián)的突變，影響PLCB4 或CYSLTR2 的表達(dá)。其中，UM細(xì)胞中的

BAP1

基因的突變與腫瘤大小和睫狀體損傷相關(guān)，而在家族性UM和家族性癌癥綜合征（皮膚黑色素瘤、間皮瘤和其他腫瘤）中，

BAP1

的突變似乎也特別常見。除此之外，

PRAME

、

EIF1AX

、

FOXO3

、

ITPR2

、

GNAQ

和

GNA11

等基因的突變，也被認(rèn)為參與了UM的病理進(jìn)程。

lncRNAs的大小超過200 bp，可以通過調(diào)控基因表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列重要的細(xì)胞過程。lncRNAs可以通過與細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)，包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)揮各種生物學(xué)功能。因此，lncRNAs在轉(zhuǎn)錄抑制、轉(zhuǎn)錄激活、染色體修飾等方面均發(fā)揮重要作用。越來越多的研究證明，lncRNAs參與了腫瘤細(xì)胞的惡性過程，包括增殖、侵襲和干細(xì)胞特性。到目前為止，大多數(shù)lncRNAs的生物學(xué)功能仍處于未知狀態(tài)。已有的相關(guān)報道中，lncRNAs參與基因表達(dá)調(diào)控的主要分子機(jī)制之一是通過競爭性結(jié)合靶標(biāo)miRNA，從而解除miRNA對下游功能基因的轉(zhuǎn)錄抑制。如在胰腺癌中，LINC00673能夠增強(qiáng)PTPN11 與E3 泛素連接酶PRPF19 的相互作用，從而增強(qiáng)S TAT 1 依賴的抗腫瘤效應(yīng)，LINC00673 第4 外顯子的點突變（G＞A）使得LINC00673能特異性結(jié)合miR-1231，更容易表現(xiàn)出腫瘤易感性。在與UM生存預(yù)后相關(guān)的lncRNA

中，linc00963(MetaLnc9)已被證明在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且與不良預(yù)后呈正相關(guān)，Linc00963的高表達(dá)促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移、入侵以及增強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力。在肝癌中，LINC01391可誘導(dǎo)β-catenin與ICAT相互作用增強(qiáng)，通過抑制β-catenin與TCF/LEF相互作用來調(diào)控腫瘤的生長。這說明篩選出的lncRNA分子確實可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功能。

表4.lncRNA靶向miRNA及mRNATable 4.lncRNA targeting miRNA and mRNA

圖2.UM預(yù)后相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控機(jī)制A：UM預(yù)后相關(guān)lncRNA下游靶基因的KEGG功能富集圖；B：UM預(yù)后相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA通路調(diào)控黑色素瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程Figure 2.Regulation mechanism of lncRNA-miRNA-mRNA related to prognosis of uveal melanoma.A：KEGG function enrichment diagram of downstream target gene of lncRNA related to prognosis of UM.B：Prognostic related lncRNA-miRNA-mRNA pathway of UM regulates the occurrence and development of melanoma.UM,uveal melanoma.

在對lncRNA的下游靶基因miRNA及功能基因的預(yù)測中，我們鑒定出了630 對候選miRNAmRNA。在對功能基因的KEGG分析中，發(fā)現(xiàn)鑒定出的lncRNA的下游調(diào)控基因主要富集在參與腫瘤病理進(jìn)程的信號通路中。以SNHG6 為例，我們發(fā)現(xiàn)SHNG6 可能通過調(diào)控has-miR-214-5p、hasmiR-214-3p、has-miR-let-7b-5p、has-miR-let-7c-3p等microRNA，調(diào)節(jié)下游的功能基因

BAX

、

IGF1R

、

KRAS

、

PIK3R1

、

PDGFD

等。之前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SNHG6 的表達(dá)升高與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)，并證明SNHG6可通過與miR-26a、miR-26b、miR-214相互作用來調(diào)控EZH2，促進(jìn)細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。在膠質(zhì)瘤中，SNHG6可以競爭性地吸收miR-543，從而調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LMO3的表達(dá)及腫瘤的生長。在肝癌中，SNHG6作為ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中競爭性結(jié)合的位點，使has-let-7c-5p、c-Myc表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖。但是，在UM中，關(guān)鍵lncRNA的ceRNA機(jī)制研究鮮見報道。這意味著本研究鑒定出的SHNG6 信號通路可能在UM的發(fā)生發(fā)展、遷移及侵襲等方面扮演著重要角色。因此，這些候選的與UM預(yù)后相關(guān)的lncRNA及其信號通路有待后續(xù)進(jìn)一步的功能驗證。

綜上，本研究通過構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，探索與UM相關(guān)的lncRNA及其下游調(diào)控關(guān)系。篩選出的9 個可能發(fā)揮ceRNA功能的lncRNA可為研究UM的進(jìn)展機(jī)制提供依據(jù)，SHNG6、LINC01278 等lncRNA可能在UM發(fā)生、遷移及侵襲等方面起重要作用。其對應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系為后續(xù)更深入研究lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控機(jī)制及探索UM治療靶點提供了參考和方向。

利益沖突申明

無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

尚會平：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋和修改論文的結(jié)果、結(jié)論。林祥祥：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改