香梨優(yōu)斑螟EPSXL基因生物信息學(xué)及表達分析

賀鵬鵬 張來斌 肖海兵 劉振亞 楊明祿 韓旭

摘? ? 要：決定香梨優(yōu)斑螟性別的基因尚不清楚，推測香梨優(yōu)斑螟Sex-lethal（EPSXL）基因是潛在的主要性別決定基因，擬研究其在雌、雄個體不同組織及發(fā)育時期的表達。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測香梨優(yōu)斑螟EPSXL基因的氨基酸序列、分析蛋白質(zhì)特性和構(gòu)建近緣物種進化樹，并采用熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因在頭、胸、腹、翅中的表達情況。發(fā)現(xiàn)EPSXL基因編碼區(qū)長度為1 005 bp，編碼334個氨基酸，具有2個保守的RRM結(jié)構(gòu)域。其蛋白為堿性親水性蛋白質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，有51個磷酸化位點和2個N-糖基化位點，不存在跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽。對比發(fā)現(xiàn)，EPSXL氨基酸序列與臍橙螟ATSXL的序列相似性最高。在雄性香梨優(yōu)斑螟中EPSXL在成蟲期和蛹期中mRNA表達量較高，在雌性中則在1齡和3齡幼蟲期中表達量較高，在雄性腹部和胸部中的表達量極顯著高于雌性相應(yīng)組織。EPSXL蛋白具有2個保守的功能結(jié)構(gòu)域，該基因mRNA表達在不同性別與組織間差異明顯，能夠為深入研究其功能提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：香梨優(yōu)斑螟;EPSXL基因;生物信息學(xué);基因表達

中圖分類號：S436.612.2+9? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.001

Bioinformatics and Expression Analysis of EPSXL Gene of Euzophera pyriella

HE Pengpeng1， ZHANG Laibin1， XIAO Haibing1，2， LIU Zhenya1，2， YANG Minglu1，2， HAN Xu1，2

（1.College of Agriculture， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300， China; 2.Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University，Alar， Xinjiang 843300， China）

Abstract：The gene that determines the sex of Euzophera pyriella is still unclear. It is speculated that the Sex-lethal（EPSXL） gene of E. pyriella is a potential major sex-determining gene. This research aims to study its expression in different tissues and developmental stages of female and male individuals. Bioinformatics software was used to predict the amino acid sequence of EPSXL gene， to analyze the protein characteristics and construct the phylogenetic tree of its genetically close species. Quantitative PCR was applied to detect the expression of EPSXL gene in the head， thorax， abdomen and wing. It was found that the EPSXL gene coding region was 1 005 bp in length， encoded 334 amino acids， and had 2 conserved RNA recognition motif （RRM） domains. The protein was a basic hydrophilic protein. The secondary structure was mainly constituted by alpha helix and random coils. There were 51 phosphorylated sites and 2 N-glycosylation sites， but no transmembrane structure and signal peptide. By comparison， it was found that the amino acid sequence of EPSXL had the highest similarity with the sequence of Amyelois transitella. The mRNA expression of EPSXL was higher in the adult and pupal of the male， while it was higher in the 1st and 3rd instar larvae of the female. The mRNA expressions of EPSXL in the abdomen and thorax of males were significantly higher than those in the female tissues. EPSXL protein has two conserved functional domains， and its mRNA expression differed obviously between gender and tissue， which can provide a theoretical basis for in-depth study of its function.

Key words： Euzophera pyriella;EPSXL gene;bioinformatics;gene expression

香梨優(yōu)斑螟（Euzophera pyriella Yang）屬鱗翅目螟蛾科斑螟亞科優(yōu)斑螟屬，主要危害梨、蘋果、杏、桃和棗等果樹。其中，危害最重的是庫爾勒香梨，部分產(chǎn)區(qū)被害率高達90%，危害嚴重時可造成樹體衰弱死亡[1]。隨著動物基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，目前有關(guān)昆蟲雌雄性別發(fā)育相關(guān)基因的研究已有一定進展，性別決定的開關(guān)Sex-lethal（SXL）基因已經(jīng)在多個物種中被鑒定出來，包括黑腹果蠅、家蠶、羅氏沼蝦、東亞飛蝗、克氏原螯蝦和煙粉虱等[2-7]。在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）性別決定機制中關(guān)于SXL基因研究較為深入，SXL基因的作用是通過激活其活化蛋白來控制生物體細胞的性別分化、生殖細胞的分化以及劑量補償[4]。在果蠅體內(nèi)X∶A的信號調(diào)控SXL基因表達，當(dāng)比值為1時，SXL活性蛋白被激活，用來調(diào)控下游性別分化相關(guān)基因的表達，使果蠅個體發(fā)育成雌性;反之果蠅個體發(fā)育成雄性[8]。果蠅屬以外，如地中海實蠅等昆蟲母體transformer（TRA）基因替代SXL的作用，TRA基因通過自我調(diào)控而形成雌特異性的剪接，進而調(diào)控下游的doublesex（DSX）基因[9]。家蠶中，SXL基因在雌雄之間差異表達，可能與其性別決定有關(guān)，但家蠶基因組中沒有TRA基因[10]，可能與PSI和HRP28基因的調(diào)節(jié)有關(guān)[11]。由此可見，調(diào)控途徑上游的基因在不同昆蟲中有較大的變異，而底端的DSX基因較為保守[12]。

SXL是一個RNA結(jié)合蛋白，含有兩個RNA識別結(jié)構(gòu)域（RNA recognition motifs，RRM）[3]，該蛋白除了結(jié)合自身發(fā)生正向自我調(diào)控功能以外，還調(diào)控除家蠶外的其他昆蟲TRA和male-specific lethal-2（MSL-2）[10]。SXL蛋白通過結(jié)合SXL RNA轉(zhuǎn)錄本，選擇具有雌性特異性的RNA剪接，使SXL蛋白具有功能性;其次是通過結(jié)合TRA RNA轉(zhuǎn)錄本，選擇具有選擇性剪接的TRA轉(zhuǎn)錄本，使TRA調(diào)控蛋白具有活性與transformer 2（TRA-2）共同作用于DSX的轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)一系列調(diào)控及編碼過程使個體向著雌性方向分化發(fā)育[13]。

隨著分子生物學(xué)及計算機的發(fā)展，大數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)工具在生命科學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用，軟件能夠較為準確的預(yù)測基因功能。本研究利用生物信息學(xué)方法，對EPSXL基因進行生物學(xué)特性分析，利用熒光定量qPCR技術(shù)研究不同發(fā)育時期及組織的表達特征，為后期該基因功能研究奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法

1.1 試蟲

EPSXL基因序列來自課題組香梨優(yōu)斑螟轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，香梨優(yōu)斑螟試蟲來自實驗室飼養(yǎng)種群。

1.2 生物信息學(xué)分析

使用在線生物軟件ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測EPSXL基因的開放閱讀框及編碼區(qū)序列組成，利用ExPASy數(shù)據(jù)庫的ProtParam（http：//www.exPasy.org/tools/protparam）軟件對EPSXL蛋白的理化特性進行分析。用DNAMAN軟件對各物種的SXL氨基酸序列進行比較分析。利用SMARTS在線軟件（https：//smartsm.embl-heidelberg.de/）預(yù)測結(jié)構(gòu)域。選用MEGAX軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）對EPSXL及NCBI數(shù)據(jù)庫中相似度較高的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其中自展值（Bootstrap-value）設(shè)為1 000次，檢驗各節(jié)點的置信度。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

每個處理分別收集香梨優(yōu)斑螟卵40枚、1齡幼蟲10頭、3齡幼蟲雌雄各3頭、5齡幼蟲雌雄各3頭、雌雄蛹各5頭、雌雄成蟲各5頭，以及雌雄成蟲20只解剖后得到頭、胸、腹、翅組織樣品。每一個處理3個生物學(xué)重復(fù)，采集后的樣品經(jīng)液氮罐速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用Trizol法提取各個試驗樣品的總RNA。利用核酸檢測儀檢測含量與質(zhì)量，檢測合格后保存于-80 ℃冰箱備用;根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix）說明進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR及分析

在該基因保守區(qū)利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計熒光定量PCR引物（表1），選取TUB為內(nèi)參基因，使用SGExcel Ultra SYBR Mixture試劑盒和熒光定量PCR儀（Eppendorf Mastercycler ep realplex）進行相對定量分析。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性5 s;60 ℃退火20 s;40個循環(huán)，并設(shè)置溶解曲線溫度變化95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。使用2-△△Ct法分析香梨優(yōu)斑螟SXL基因在不同發(fā)育時期及組織的相對表達情況，以軟件GraphPad Prism 8對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析方法進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPSXL基因的序列分析

EPSXL基因序列的編碼區(qū)為1 005 bp，共編碼334個氨基酸。EPSXL蛋白相對分子質(zhì)量為37 170.76，分子式為C1641H2495N481O481S16，理論等電點為9.23，脂肪系數(shù)為52.63，平均親水系數(shù)為-0.705（親水），不穩(wěn)定系數(shù)為39.18，EPSXL蛋白在體外可能較穩(wěn)定。該蛋白序列不存在信號肽和跨膜區(qū)。二級結(jié)構(gòu)主要是無規(guī)則卷曲和α螺旋為主，有2個N-糖基化位點和51個磷酸化位點，其中第109和185處為N-糖基化位點，蘇氨酸磷酸化位點15個，絲氨酸磷酸化位點18個，酪氨酸磷酸化位點17個。

2.2 EPSXL氨基酸序列分析

通過NCBI檢索獲得其他昆蟲SXL蛋白的氨基酸序列，使用DANMAN軟件將所得氨基酸序列與其他昆蟲的SXL氨基酸序列進行多重比較分析，香梨優(yōu)斑螟（Euzophera pyriella）與臍橙螟蛾（Amyelois transitella）、地中海粉螟（Ephestia kuehniella）、粉紋夜蛾（Trichoplusia? ?ni）、草地貪夜蛾（Spodoptera? frugiperda）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的SXL氨基酸序列相似性高達91.99%（圖1）。通過SMARTS在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因存在兩個RRM結(jié)構(gòu)域，屬于SXL家族（圖2）。

為了解香梨優(yōu)斑螟SXL基因與其他昆蟲的進化關(guān)系，使用MEGA-X軟件將香梨優(yōu)斑螟（Euzophera pyriella）與臍橙螟蛾（Amyelois transitella）、地中海粉螟（Ephestia kuehniella）、蠟螟（Galleria mellonella）、煙草天蛾（Manduca sexta）、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）、草地貪夜蛾（Spodoptera? frugiperda）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、偏瞳蔽眼蝶（Bicyclus anynana）、小菜蛾（Plutella xylostella）、家蠶（Bombyx mori）、菊黃花粉蝶（Zerene cesonia）的SXL基因氨基酸序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap-value設(shè)置為1 000次。EPSXL蛋白與臍橙螟聚為一支（圖3），兩者親緣關(guān)系最近，其次是地中海粉螟。

2.3 EPSXL在不同發(fā)育時期的表達分析

EPSXL在不同發(fā)育時期中都有表達，但存在著較大的差異，3齡以后雌雄之間差異明顯（圖4），雄成蟲期的表達量達到高峰，其次是蛹期、1齡幼蟲期和3齡幼蟲期，其他時期EPSXL表達量相對較低;雌蟲則是1齡幼蟲期的表達量最高，其次是3齡幼蟲期，其他蟲態(tài)表達量相對較低。

2.4 EPSXL在成年雌雄不同組織中的表達分析

EPSXL成蟲雌雄性組織中均有所表達，但不同的組織中存在著較大的差異（圖5），EPSXL成蟲腹部表達量最高，其次是胸部和翅，頭部組織最低;EPSXL在頭部中的表達水平不存在雌雄差異;在雌性翅的EPSXL表達量極顯著高于雄性;而腹部和胸部組織中雄性表達水平極顯著高于雌性。

3 討論與結(jié)論

SXL家族蛋白在不同生物體中具有較高的同源性，均具有2個保守的RRM結(jié)構(gòu)域[3]。該結(jié)構(gòu)域可能調(diào)控下游靶基因。包括TRA基因、TRA-2基因、DSX基因[5]、MSL-2基因等，這些基因與性別決定都有一定的關(guān)系[14-15]。本研究預(yù)測的氨基酸序列也具有2個保守的RRM結(jié)構(gòu)域，EPSXL蛋白屬于SXL家族具有高度保守性。

SXL基因在東亞飛蝗[5]、家蠶[10]和黑腹果蠅[15]各個發(fā)育時期和不同組織中均有表達，SXL活化蛋白將TRA、TRA-2等基因活化，活化后的基因統(tǒng)一作用于決定雌性性別的最后一個基因DSX[16]，并且還會導(dǎo)致生物體細胞的性別分化、生殖細胞的分化以及劑量補償發(fā)生變化[4]。本研究得出SXL基因在香梨優(yōu)斑螟的不同發(fā)育時期及組織中均有表達，但表達水平有較大的差異：雌雄成蟲之間差異特別明顯，推測表達情況與香梨優(yōu)斑螟性器官發(fā)育過程有關(guān);腹部中的表達水平最高，而在其他組織中的表達水平顯著低于腹部，可能腹部存在精巢和卵巢，黑腹果蠅和家蠶在卵巢中表達明顯高于其他組織[17-18]。雖然EPSXL基因大量存在于腹部中，但是該基因是否與香梨優(yōu)斑螟性功能有關(guān)，還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 魯建英， 王小兵， 何元英. 香梨優(yōu)斑螟的發(fā)生規(guī)律與防治研究[J]. 北方果樹， 2013（3）： 9-11.

[2] 王慧超， 朱勇， 夏慶友. 黑腹果蠅的性別控制[J]. 遺傳， 2003， 25（1）： 97-101.

[3] 石盼盼. 家蠶Bmsxl基因自身剪接的調(diào)控機理研究[D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2017.

[4] 俞炎琴. 羅氏沼蝦中性別發(fā)育相關(guān)基因Sxl和Dmrt基因的分子特征和功能研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2013.

[5] 王鵬. 東亞飛蝗Sex-lethal基因的克隆、表達及功能初步研究[D]. 重慶： 重慶師范大學(xué)， 2014.

[6] 費佳敏， 石林林， 李艷和. 克氏原螯蝦sex-lethal基因的克隆與表達分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2021， 40（1）： 120-128.

[7] 劉雅婷. 煙粉虱性別決定基因的注釋與功能研究[D]. 長沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

[8] S?NCHEZ L. Sex-determining mechanisms in insects[J]. The International Journal of Developmental Biology，2008， 52（7）： 837-856.

[9] LAGOS D， KOUKIDOU M， SAVAKIS C， et al. The transformer gene in Bactroceraoleae：? the genetic Switch that determines its sex fate[J]. Insect Molecular Biology，2007， 16（2）： 221-230.

[10] 查幸福. 家蠶（Bombyxmori）性別決定網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵基因BmSxl的cDNA克隆和功能研究[D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2006.

[11] SUZUKI M G. Sex determination： insights from the silkworm[J]. Journal of Genetics， 2010， 89（3）： 357-363.

[12] CHEN S， YANG P， JIANG F， et al. De novo analysis of transcriptome dynamics in the migratory locust during the development of phase traits[J]. PLOS one， 2010， 5（12）： e15633

[13] MOSCHALL R， STRAUSS?D， GARC?A-BEYAERT M， et al. Drosophila Sister-of-Sex-lethal is a repressor of translation[J]. RNA （new York， N. Y. ）， 2018， 24（2）： 149-158.

[14] SACCONE G， PELUSOI， ARTIACO D， et al. The ceratitiscapitata homologue of the drosophila sex-determining gene Sxl is structurally conserved，but not sex-specifically regulated[J]. Development， 1998， 125（8）： 1495-1500.

[15] WANG M， XIE X， XU D， et al. Molecular characterization of the Sex-lethal gene in mud crab Scylla paramamosain and its potential role in sexual development[J]. Comparative Biochemistry and Physiology.Part B， Biochemistry & Molecular Biology， 2020， 250： 110486.

[16] RUIZ M F， GODAY C， GONZ?LEZ P， et al. Molecular analysis and developmental expression of the Sex-lethal gene of Sciaraocellaris （Diptera order， Nematocera suborder）[J]. Gene Expression Patterns： GEP， 2003， 3（3）： 341-346.

[17] LI X， LIU Q， LIU H， et al. Mutation of doublesex in Hyphantriacunea results in sex-specific sterility[J]. Pest Management Science，2020， 76（5）： 1673-1682.

[18] 宛秋興. Sex lethal（BmSxl）基因在家蠶生殖細胞調(diào)控中的功能研究[D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2021： 003217.