蒙藥枸杞子-7防治子宮內膜異位癥復發(fā)作用的實驗研究

白梅榮 陳玉蘭 烏日漢 薩出日拉 根玉

摘要：目的 評價蒙藥枸杞子-7防治子宮內膜異位癥復發(fā)的藥理作用。方法 以手術法制備子宮內膜異位癥復發(fā)大鼠模型，以蒙藥枸杞子-7灌胃治療14 d，分別在給藥第1、7、14 d測量異位包塊大小，末次給藥后麻醉處死大鼠，測定血清E2和P含量，觀察子宮組織病理組織學變化。結果 與空白組相比，模型組血清E2和P含量升高（P<0.05）;與模型組相比，蒙藥枸杞子-7組血清E2和P含量下降（P<0.05），病理學變化好轉。結論 蒙藥枸杞子-7在14 d內可有效防治子宮內膜異位癥復發(fā)。該研究為枸杞子進一步開發(fā)研究提供了堅實的工作基礎。

關鍵詞：蒙藥;枸杞子-7;防治;子宮內膜異位癥復發(fā);實驗研究

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2022）04-0049-06

Experimental Study on the Effect of Lycium Barbarum-7 in the Prevention and Treatment of the Recurrence of Endometriosis

BAI Mei-rong1， CHEN Yu-lan1， WU Ri-han1， Sachu Rila2， GEN Yu2

（1. Key Laboratory of Mongolian Medicine Research and Development Engineering of Ministryof Education， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000， China;2. The Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000， China）

【Abstract】Objective： To evaluate the pharmacological effects of Lycium barbarum-7 in the prevention and treatment of the recurrence of endometriosis. Methods： A rat model of recurrent endometriosis was prepared by surgery， and the rats were intragastrically treated with Lycium barbarum-7 for 14 days. The size of the ectopic mass was measured on the 1st， 7th， and 14th day of administration， and the rats were sacrificed after anesthesia when the last administration was performed. Their serum E2 and P levels were determined and their histopathological changes in uterine tissue were observed. Results： Compared with the blank group， the serum E2 and P contents of the model group increased （P<0.05）; compared with the model group， the serum E2 and P contents of the Lycium barbarum-7 group decreased （P<0.05）， and the pathological changes improved. Conclusion： Lycium barbarum-7 can effectively prevent and treat the recurrence of endometriosis within 14 days. The study provides a solid working foundation for further development of wolfberry fruit.

【Key words】Mongolian Medicine; Lycium Barbarum-7; Prevention And Treatment; Recurrence Of Endometriosis; Experimental Study

子宮內膜異位癥（簡稱內異癥）是指具有生長能力的子宮內膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位異常生長，雖然是一種良性激素依賴性疾病，但其表現(xiàn)的浸潤、轉移、復發(fā)和種植生長都是一種惡性生物心行為表現(xiàn)，成為難治之癥，被稱為“良性癌癥”。它主要引起不孕、痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛、盆腔包塊等，困擾著許多女性的身心健康，臨床上越來越予以重視，發(fā)病率有逐漸升高的趨勢，但在治療方面還沒有突破性進展，目前治療以藥物及手術治療為主，但術后復發(fā)率高[1-2]。

蒙藥枸杞子-7是臨床常用于婦血癥的蒙成藥之一。出自《觀者之喜》，由枸杞子、沙棘、硼砂、樸硝等具有清血、化瘀、破痞功效的七味藥組成。本方性溫，具有清血、化瘀、解凝等功效，對血痞、血癥及閉經(jīng)等病均有良效。在蒙藥古籍《認藥白晶鑒》、《蒙藥正典》、《識藥學》、《方?！分芯需坭阶?7治療血痞、痛經(jīng)治療顯效的記載;同時，大量臨床資料顯示，枸杞子-7對巧克力囊腫、繼發(fā)性痛經(jīng)療效最佳而復發(fā)率低等優(yōu)點而深受廣大醫(yī)患的歡迎。課題組前期以動物實驗研究佐證了枸杞子-7可降低子宮內膜異位癥大鼠異位包塊、并顯著降低血清IL-8、E2、P含量及血液粘度[3-7]。但未涉及枸杞子-7防治子宮內膜異位癥復發(fā)（簡稱內異癥復發(fā)）的相關研究。該研究以異位復發(fā)模型大鼠為研究對象，以枸杞子-7為示例藥物，以異位包塊、E2、P含量及病理組織學變化為重點觀察指標，評價枸杞子-7防治異位復發(fā)的藥理作用，為該藥的進一步深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 cobas c311全自動生化分析儀（Roche）。

1.2 實驗動物 Wistar雄性大鼠，50只，體重（200±10）g，實驗動物按每籠5只分籠喂養(yǎng)。所有大鼠在SPF級別條件下飼養(yǎng)。根據(jù)《實驗動物管理條例》實施對實驗動物的操作。

1.3 實驗藥物 枸杞子-7，由內蒙古民族大學附屬醫(yī)院提供。雌二醇檢測試劑盒（E2）、孕酮檢測試劑盒（P）均購自由北京北方生物技術研究所。戊酸雌二醇片（國藥準字J20170009，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）;硫酸慶大霉素注射液（國藥準字 H41020318，國藥集體容生制藥有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 復制大鼠內異癥復發(fā)模型 大鼠復發(fā)模型的制備分兩步進行。第一步：以手術法制備內異癥模型;第二步：在內異癥模型的基礎上進一步制備復發(fā)模型。

第一步：取SD雌性大鼠50只，按體重分為空白對照組和模型組，空白對照組10只，模型組40只。手術前連續(xù)一周灌胃0.1 mg/kg·d戊酸雌二醇片，統(tǒng)一使大鼠處于動情期。在動情期模型組大鼠以1%戊巴比妥鈉0.6 mL腹腔麻醉，常規(guī)消毒，腹部脫毛，開腹剪切左側子宮長約2～3 cm，置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，左側子宮兩端一細絲線結扎。將切下的子宮沿長軸剖開，分離子宮內膜及肌層（內膜較薄者不易剝離或剝離后組織較少，則可將子宮內膜片段連同肌層一道移植，其成活不受影響），將剝離的內膜組織切成3 mm×3 mm大小的內膜塊，共2塊，使內膜表面朝向腹腔，分別將2塊組織縫在左右兩側壁層腹膜上，然后縫合腹部切口，手術后將動物分籠單放，讓其自然蘇醒。正常對照組的大鼠切除長2 cm的一段子宮體，棄之不用，斷端結扎后關腹。術后每只大鼠腹腔注射慶大霉素0.1 mL，共7 d。術后模型組大鼠隔兩天灌服乙烯雌酚片0.1 mg/kg，促進其子宮內膜生長。造模4周根據(jù)經(jīng)觸及包塊大小、血清雌二醇（E2）和孕酮（P）和病理組織學觀察證實異位內膜已成活。32只大鼠復制內異癥模型成功，成功率80%。腹部異位內膜包塊大小變化見表1，異位內膜的組織學檢查結果見圖1，圖2。

第二步：取內異癥模型大鼠40只，在實驗的第一天灌胃0.1 mg/kg戊酸雌二醇片，保證其大鼠動情期，第二天常規(guī)消毒異位小包塊處并脫毛，剪切包塊處腹部皮膚，暴露其異位包塊，以針頭刺破其異位包塊，包塊中液體被流到腹腔內，不做其他處理。每只大鼠腹腔注射慶大霉素0.1 mL，共7 d。術后模型組大鼠隔兩天灌服戊酸雌二醇片0.1 mg/kg，共3次，促進其子宮內膜生長。造模第2周根據(jù)經(jīng)觸及包塊大小和病理組織學觀察證實異位內膜已成活，異位復發(fā)成功率100%。包塊大小變化見表3，異位內膜組織學檢查結果見圖4。

1.4.2 枸杞子-7防治異位復發(fā)作用實驗研究 取異位復發(fā)模型大鼠32只和健康大鼠8只，分為正常對照組、異位復發(fā)組、異位復發(fā)加枸杞子-7大、中、小三個劑量組等5組，每組8只。除了正常對照組和異位復發(fā)模型組外，各給藥組灌胃不同劑量藥物溶液（2 mL/100 g），每天1次，連續(xù)給藥14 d，記錄包塊大小變化。末次給藥后，麻醉處死各組大鼠，取血，以3500 r/min離心分離血清15 min，待測E2、P水平，取部分子宮組織以10%甲醛溶液固定，觀察病理組織學變化。

2 實驗結果

2.1 復制大鼠內異癥復發(fā)模型實驗結果

2.1.1 異位包塊肉眼觀察 建模后4周移植物外觀看：40只大鼠在移植的腹部皮下可見移植物結節(jié)，剔除大鼠腹部被毛可見突出結節(jié)，結節(jié)突起呈大小不等的球形，打開皮膚可見突起內部充滿液體，呈淡黃色或暗黃色囊狀結構，質地較軟，表面有血管走形，個別移植物外觀呈現(xiàn)渾濁黃白色結節(jié)，后病理證實為膿腫。建模成功與否以病理檢查證實移植物中均有子宮內膜上皮細胞、腺體和間質生長為最終標準。病理組織切片證實本實驗成功建模32只，本實驗異癥建模成功率為80%。

2.1.2 觀察內異癥模型組大鼠包塊 實驗結果表明，32只模型組大鼠子宮內膜異位成功，在異位處形成肉眼可見的包塊、出現(xiàn)液體積聚，并有血管形成。模型大鼠子宮組織異位包塊大小較均勻，具有較好的離散度?？梢?，該模型制備方法較成熟和穩(wěn)定。結果見表1。

2.1.3 內異癥模型大鼠血清雌二醇和孕酮含量變化 與正常對照組相比較，模型組血清雌二醇和孕酮含量明顯高于正常對照組（P<0.05）。結果見表2

2.1.4 異位子宮組織病理學檢查結果 正常對照組子宮組織病理學檢查結果：在位子宮內膜上皮為高柱狀或柱狀;腺體數(shù)量多，腺上皮細胞多為柱狀，個別為立方狀，可見核下空泡和頂漿分泌。結果見圖1。

內異癥模型大鼠病理組織學檢查結果：可見移植的內膜存活，表面上皮增生呈柱狀，腺體稀疏，腺腔形態(tài)欠規(guī)則，并有分泌活動。可見腺上皮及間質細胞，腺上皮呈柱狀、立方狀或扁平狀，部分可見核下空泡，間質較密，間質細胞小而稀疏。結果見圖2。

2.2 復制內異癥復發(fā)模型實驗結果

2.2.1 內異癥復發(fā)移植物肉眼觀察 建復發(fā)模型后2周移植物外觀看：兩種制備方法未見明顯差異。2組大鼠幾乎所有大鼠腹部皮下也可見移植物結節(jié)，外形和質地同內異癥異位包塊。證明復發(fā)模型已成功，造模成功率達100%。

2.2.2 內異癥復發(fā)模型組大鼠包塊 實驗結果表明，32只模型組大鼠子宮內膜異位復發(fā)成功，在異位處形成肉眼可見的包塊、出現(xiàn)液體積聚，并有血管形成。雖然與內異癥模型相比，包塊已變小，但在建模后21 d內模型較穩(wěn)定。該數(shù)據(jù)為實驗研究的順利實施提供了堅實的模型基礎。結果見表3。

2.2.3 內異癥復發(fā)模型大鼠血清雌二醇和孕酮含量變化 與正常對照組相比較，復發(fā)模型1組和復發(fā)模型2組血清雌二醇和孕酮含量明顯高于正常對照組（P<0.05）。結果見表4。

2.2.4 內異癥復發(fā)模型病理組織學變化 正常對照組子宮組織病理學檢查結果：在位子宮內膜上皮為高柱狀或柱狀;腺體數(shù)量多，腺上皮細胞多為柱狀，個別為立方狀，可見核下空泡和頂漿分泌。結果見圖3。

內異癥復發(fā)模型大鼠病理組織學檢查結果：被處理過的子宮內膜存活，可見腺上皮及間質細胞。子宮內膜上皮細胞，內膜上皮絨毛整齊，分泌顆粒豐富，線粒體、內質網(wǎng)形態(tài)正常。結果見圖4。

2.3 枸杞子-7防治內異癥復發(fā)作用

2.3.1 治療前后移植物肉眼觀察 于枸杞子-7干預EM復發(fā)模型后14 d內移植物外觀看：模型組幾乎所有大鼠腹部或皮下可見移植物結節(jié)，剔除大鼠腹部被毛可見突出結節(jié)，結節(jié)突起呈大小不等的球形，打開皮膚可見突起內部充滿液體，呈淡黃色或暗黃色囊狀結構，質地較軟，表面有血管走形，個別移植物外觀呈現(xiàn)渾濁黃白色結節(jié)，后病理證實為膿腫。枸杞子-7大劑量組8只大鼠中2只大鼠異位包塊體積變小，6只已測量不到基本消失;枸杞子-7中劑量組3大鼠異位包塊體積變小，4只已測量不到基本消失，1只無變化;枸杞子-7小劑量組3只大鼠包塊變小，5只基本無明顯變化。

2.3.2 各組大鼠異位包塊大小變化 與模型組相比較，枸杞子大劑量和中劑量組包塊在給藥第7 d有縮小趨勢，但到給藥14 d時明顯變小，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;枸杞子小劑量組雖然有縮小趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表5。

2.3.3 枸杞子-7對內異癥復發(fā)模型組大鼠雌激素含量的影響 與正常對照組相比，復發(fā)模型組白介素-8、雌二醇和孕酮含量明顯高于正常對照組（P<0.05）。

與模型組相比，枸杞子-7大組白介素-8、雌二醇和孕酮含量均顯著降低（P<0.05）;枸杞子-7中和小組無明顯差異（P>0.05）。結果見表6。

2.3.4 各組病理組織學觀察結果 正常對照組子宮組織病理學檢查結果：子宮內膜上皮為高柱狀或柱狀;腺體數(shù)量多，腺上皮細胞多為柱狀，個別為立方狀，可見核下空泡和頂漿分泌。結果見圖5。

內異癥復發(fā)模型大鼠病理組織學檢查結果：可見腺上皮及間質細胞。子宮內膜上皮細胞，內膜上皮絨毛整齊，分泌顆粒豐富，線粒體、內質網(wǎng)形態(tài)正常。結果見圖6。

枸杞子-7大劑量組大鼠病理組織學檢查結果：可見少量子宮內膜上皮細胞，內膜上皮絨毛整齊，少量分泌顆粒。結果見圖7。

枸杞子-7中劑量組大鼠病理組織學檢查結果：可見子宮內膜上皮細胞，內膜上皮絨毛較整齊，分泌顆粒減少。結果見圖8。

枸杞子-7小劑量組大鼠病理組織學檢查結果：可見大量腺上皮及間質細胞。子宮內膜上皮細胞，內膜上皮絨毛整齊，分泌顆粒豐富，線粒體、內質網(wǎng)形態(tài)正常。結果見圖9。

4 討論

隨著人們對內異癥的認識不斷增加，中西藥及蒙藥治療內異癥方法較多并治療效果也不同，但幾乎所有治療方法均以抑制卵巢功能為主，目前暫未出現(xiàn)徹底治愈此病或防治復發(fā)的治療方案[8]。因此篩選徹底治愈內異癥和復發(fā)的有效藥物及治療方案是廣大醫(yī)患關注焦點，也是廣大學術界的熱議話題。課題組近10年研究中發(fā)現(xiàn)，蒙藥枸杞子-7有效防治內癥位而且復發(fā)率較低。通過本研究結果顯示，蒙藥枸杞子-7可顯著降低復發(fā)模型異位包塊大小，降低血清E2和P含量，并減少子宮內膜上皮細胞和顆粒分泌?？梢?，蒙藥枸杞子-7在防治內異癥復發(fā)方面具有研究和開發(fā)價值。該研究為蒙藥枸杞子-7進一步深入探討奠定了夯實的工作基礎。

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（收稿日期：2021-09-16）