茶籽皂苷改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪代謝及氧化應(yīng)激水平

曹文瀞，劉爽，蘇彥民，李嘉麗，覃會珊，曾榛,2*，宋家樂,3,4*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541199）（2.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南長沙 410000）（3.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣西桂林 541109）（4.廣西衛(wèi)生健康委員會全生命周期健康保健研究實驗室，廣西環(huán)境暴露組學(xué)與全生命周期健康重點實驗室，廣西桂林 541199）

肥胖是一種以白色脂肪組織增大和體內(nèi)脂肪異常蓄積為主要表現(xiàn)的慢性代謝性疾病[1]。據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織（WHO）的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全世界有超過19億成年人存在超重或肥胖，發(fā)生率達38.9%[2]。隨著人們生活水平和經(jīng)濟條件的提高，肥胖已經(jīng)成為全世界主要衛(wèi)生問題之一。有研究表明，脂質(zhì)過度堆積引起體內(nèi)氧化應(yīng)激增加是肥胖相關(guān)代謝綜合征的重要致病機制之一[3]。氧化應(yīng)激是由于細胞和組織中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生速度遠高于機體清除速度，從而造成大量ROS積累在體內(nèi)各處并引發(fā)組織器官的氧化損傷[4]。正常生理條件下，細胞表現(xiàn)出一種自我保護的抗氧化活性，從而防止由酶和非酶引起的氧化損傷[5]。長期攝入高脂飲食（High fat diet，HFD）則會誘導(dǎo)肥胖，導(dǎo)致機體能量攝入與消耗的不平衡，造成大量ROS的產(chǎn)生及游離脂肪酸的增加和釋放入血，最終引起機體的脂質(zhì)代謝紊亂及氧化應(yīng)激狀態(tài)，而這一系列事件均與心血管疾病、糖尿病及各種癌癥的發(fā)生存在有密切的聯(lián)系[6-8]。已有研究表明，脂肪堆積與高氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，而通過改善機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)有助于起到改善肥胖狀態(tài)的目的[9,10]。

茶是中國及世界范圍內(nèi)最受歡迎的健康飲料之一。茶葉中富含有許多對人體有益的天然化合物（如兒茶素、茶黃素和類黃酮等）。茶籽皂苷（Tea seed saponin，TSS）又稱為茶皂素，是一類天然存在的齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷化合物，廣泛存在于山茶科植物的種子、根、莖、葉和花中[11]?，F(xiàn)有的研究提示，TSS具有降血脂[11]、抗癌[12]、抗病毒[13]、抗真菌[14]、降血糖[15,16]、調(diào)節(jié)腸道菌群[17]、預(yù)防阿爾茨海默氏病[18]等生物學(xué)作用。但對于茶籽皂苷在降脂減肥、改善氧化應(yīng)激等方面相關(guān)作用機制的研究報道則較少。

AMP激活的蛋白激酶（Adenosine 5-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK）是生物體內(nèi)重要的能量感應(yīng)器，主要參與維持著機體能量代謝平衡。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴性蛋白脫乙酰酶（Sirtuin1，SIRT1）/AMPK途徑是重要的能量代謝通路之一，可調(diào)節(jié)肝臟中的脂質(zhì)和葡萄糖代謝[19]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1-alpha（peroxisome proliferater activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α）與線粒體能量代謝密切相關(guān)且能被上游因子SIRT1激活[20]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ）屬于過氧化物酶體增殖物激活受體PPARs（peroxisome proliferator activated-receptors）家族，可協(xié)同AMPK增加線粒體的生物發(fā)生，促進脂肪酸的β-氧化[21]?；谏鲜鲅芯浚愿咧嬍痴T導(dǎo)的肥胖小鼠為模型，觀察茶籽皂苷干預(yù)對肥胖小鼠脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激的影響，探究茶籽皂苷是否通過調(diào)控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路及PPAR-γ來實現(xiàn)其抗肥胖、抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通維持飼料（AIN-93M）及HFD飼料，購于常州鼠一鼠二生物科技有限公司；HFD（60%脂肪供能比）組分為玉米淀粉22.75%、酪蛋白20%、麥芽糊精13.2%、豬油17%、蔗糖10%、玉米油7%、纖維素5%、礦物質(zhì)混合物3.5%、維生素混合物1%、蛋氨酸0.3%、酒石酸氫膽堿0.25%；茶籽皂苷（批號：F02040019122601），購自湖南漢清生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）購自中國汕頭西隆科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）生化試劑盒均購于江蘇科特生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；PPAR-γ、AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5424R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ELx808酶標儀，美國BioTek公司；DM4B正置熒光顯微鏡，德國LEICA公司；FluorChem M超靈敏多色熒光化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司；KZ-II高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠（共35只，四周齡，體重17～22 g），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004），飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院SPF級動物房（實驗設(shè)施使用許可證號：SYXK（桂）2020-0005）。所有小鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持室內(nèi)溫度23±3 ℃，相對濕度50%～60%，每日光照時間12 h，室內(nèi)通風(fēng)良好，自由攝食，清潔飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組及高脂小鼠模型構(gòu)建

總35只小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組（N=7）和肥胖模型組（N=28）。造模期間，正常組飼喂普通維持飼料，模型組飼喂HFD飼料。6周后，如模型組小鼠體重高于正常組小鼠平均體重20%以上，則判定為造模成功[22]。

1.4.2 茶籽皂苷干預(yù)處理

將肥胖模型組28只小鼠隨機分為肥胖對照組、茶籽皂苷低、中、高劑量組。各組干預(yù)方式如表1所示，藥物干預(yù)組分別給予持續(xù)4周的不同劑量的茶籽皂苷（以0.5%的CMC液配制）灌胃。茶籽皂苷干預(yù)期間，每3 d進行體質(zhì)量監(jiān)測，每日進行攝食量和精神狀態(tài)的監(jiān)測，所有小鼠自由攝食及清潔飲水。

表1 動物分組及干預(yù)處理Table 1 Animal grouping and intervention methods

1.4.3 血液及器官組織的取材

給藥干預(yù)四周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，測量小鼠體重及體長。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）麻醉后，腹主動脈取血1 mL置于干凈的EP管內(nèi)。在4 ℃，3500 r/min的條件下離心10 min后取血清。將取血后的小鼠置于冰上并迅速分離肝臟、附睪脂肪、腎周脂肪及腹部脂肪，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4.4 血清中生化指標及氧化應(yīng)激指標的測定

根據(jù)試劑盒說明書，檢測依1.4.3中所述制備得的小鼠血清生化指標（TC、TG、HDL-C、LDL-C）和氧化應(yīng)激指標（SOD、MDA、GSH）水平。

1.4.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

取各組小鼠相同部位的肝組織，10%的多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋并進行H&E染色，顯微鏡下觀察各組小鼠脂肪變性程度，拍照記錄。

1.4.6 Western Bolt法檢測肝臟組織中相關(guān)蛋白的表達

稱取一定質(zhì)量小鼠肝臟組織（50～60 mg），用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗血污，濾紙吸干，按比例加入組織蛋白裂解液（含PMSF），破碎勻漿，提取組織總蛋白。在4 ℃，12000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液采用BCA法測定蛋白濃度，將所有組織樣品蛋白濃度調(diào)整為1.9 mg/mL。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PGCE）膠，每孔加樣20 μL，濃縮膠80 V，分離膠120 V，電泳120 min。恒定電流240 mA濕法轉(zhuǎn)膜1 h，將轉(zhuǎn)膜完的NC膜放于5%的脫脂牛奶中封閉4 h。孵育一抗過夜，用1×TBST溶液洗膜后慢搖孵育二抗1 h，1×TBST溶液洗膜3次后，加入特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，自動化學(xué)發(fā)光成像儀檢測相關(guān)蛋白的表達情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本研究中實驗結(jié)果以均值（means）±標準偏差（SD）表示。所得實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，當(dāng)p＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶籽皂苷干預(yù)對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重和Lee's指數(shù)的影響

小鼠灌胃給藥期間，正常對照組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)迅速，活動敏捷，采食正常。HFD組小鼠體型增大，活動減少，抓取時反應(yīng)遲鈍。與HFD組相比，茶籽皂苷不同處理組小鼠的精神狀態(tài)有所改善，活動增多，體態(tài)變小。造模期結(jié)束后，造模組28只小鼠體質(zhì)量均大于正常組小鼠體質(zhì)量20%，可納入實驗組進行后續(xù)實驗。由表2可知，與正常對照組相比，高脂飲食造模后HFD組初始體重增加了36.54%（p＜0.05），茶籽皂苷各劑量組初始體重較HFD組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。給藥干預(yù)期結(jié)束后，與HFD組相比，茶籽皂苷各劑量組體重分別下降了9.80%、16.25%及23.25%（p＜0.05）。Lee's指數(shù)可作為評價小鼠肥胖程度的有效指標[23]。與正常對照組相比，HFD組小鼠Lee's指數(shù)顯著增加了9.49%（p＜0.05），與HFD組相比，茶籽皂苷處理能夠顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的Lee's指數(shù)，分別下降了1.88%、4.83%及6.38%（p＜0.05）。

表2 茶籽皂苷對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量和Lee's指數(shù)的影響Table 2 Effects of tea seed saponin on body weight and Lee's index in high fat diet fed mice

通過對小鼠每日攝食量的檢測，給予高脂飼料喂養(yǎng)的各組小鼠給藥干預(yù)期間的攝食量如表3所示。給藥干預(yù)4周內(nèi)，與HFD組比較，茶籽皂苷各劑量組小鼠的攝食量無顯著性差異（p＞0.05），林玲[11]等的研究結(jié)果也提示，給予茶籽皂苷干預(yù)并不會影響大鼠的飲水量和飲食量，可排除茶籽皂苷對小鼠的降體重作用是通過減少攝食量實現(xiàn)的可能。

表3 各組高脂飲食小鼠攝食量Table 3 The diet of high fat diet fed mice in each group

2.2 茶籽皂苷對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠器官質(zhì)量的影響

由圖1可知，相比正常組，HFD組的附睪脂肪、腎周脂肪和腹部脂肪重量顯著升高（p＜0.05）。與HFD組相比，給藥處理4周后，茶籽皂苷各劑量組附睪脂肪、腎周脂肪和腹部脂肪重量明顯降低，且脂肪重量降低的程度與給藥劑量呈正比關(guān)系。HFD+TSS-L組、HFD+TSS-M組和HFD+TSS-H組的附睪脂肪臟器指數(shù)分別下降18.85%、33.40%和43.85%；腎周脂肪臟器指數(shù)分別下降15.28%、36.90%和55.42%；腹部脂肪臟器指數(shù)分別下降17.20%、40.93%和49.10%，除HFD+TSS-L組無顯著性差異外，其他兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），且茶籽皂苷高劑量組的干預(yù)效果最好。這一結(jié)果提示，茶籽皂苷可以通過降低小鼠脂肪組織的重量，緩解脂肪組織堆積抑制小鼠體重的增加。

2.3 茶籽皂苷對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟指數(shù)和肝臟脂肪變性的影響

肝臟指數(shù)可以反映肝臟的損傷程度，當(dāng)肝臟出現(xiàn)水腫、增生和充血等病理變化時，肝臟指數(shù)增大，肝臟指數(shù)下降則說明器官出現(xiàn)萎縮和退行性病變等[24]。由圖2可知，與正常對照組相比，HFD組的肝臟指數(shù)顯著增加(p＜0.05）。與HFD組相比，干預(yù)給藥4周之后，茶籽皂苷各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)分別下降了15.73%、22.49%和21.83%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05），但茶籽皂苷各劑量組之間無顯著性差異。這一結(jié)果提示茶籽皂苷能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟的損傷程度。而給予不同劑量茶籽皂苷干預(yù)（50～150 mg/kg）能夠顯著降低高脂飲食所致高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的升高[11]。

由圖2可知，正常對照組小鼠肝臟組織細胞大小均一，排列緊密，細胞輪廓清晰，核仁明顯。與正常對照組相比，HFD組肝臟組織脂肪變性程度明顯，組織中脂滴增多，細胞間空隙增大，部分細胞出現(xiàn)氣球樣病變和水腫現(xiàn)象。而經(jīng)茶籽皂苷干預(yù)4周后，肥胖小鼠的肝臟脂肪變性程度得到明顯改善，主要表現(xiàn)為脂滴明顯減少，細胞間空隙縮小，細胞輪廓逐漸清晰，且HFD+TSS-H組與正常對照組相比無顯著性差異。本研究結(jié)果提示，茶籽皂苷干預(yù)能夠改善肝臟脂肪變性的程度，且改善程度與給藥劑量呈劑量依賴性。而這一實驗結(jié)果與林玲等[11]研究中茶籽皂苷能夠改善大鼠肝臟細胞脂肪變性的結(jié)果較為接近。同時，茶籽皂苷干預(yù)也能改善HFD聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）所誘發(fā)2型糖尿病大鼠的肝臟脂肪變性程度[16,25]。

2.4 茶籽皂苷對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血清脂代謝水平的影響

如圖3所示，與正常對照組相比，高脂肪組血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高（p＜0.05），血清HDL-C水平降低，但無顯著性差異。茶籽皂苷干預(yù)后，小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著降低（p＜0.05），HDL-C水平升高，且呈劑量依賴性。與模型組相比，茶籽皂苷各劑量組小鼠血清TC水平分別降低3.47%、25.72%和37.83%，TG水平降低40.84%、50.30%和64.77%，LDL-C水平降低52.17%、69.99%和76.83%，血清HDL-C水平分別升高17.05%、37.74%和67.26%。這一結(jié)果說明，茶籽皂苷干預(yù)后能有效恢復(fù)小鼠因高脂飲食喂養(yǎng)后引起的血脂代謝紊亂，對調(diào)節(jié)機體脂代謝具有良好的作用。而在高血脂癥大鼠和2型糖尿病大鼠模型中，茶籽皂苷的干預(yù)同樣也能夠分別有效改善血清代謝指標（即降低TC、TG和LDL-C，并升高HDL-C水平）[11,16,25]，同時降低了高脂血癥大鼠的動脈硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）水平[11]。

2.5 茶籽皂苷對高脂飲食小鼠肝臟AMPK/SIRT1/PGC-1α通路的影響

AMPK和PGC-1α是機體能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在機體各種能量代謝過程中都發(fā)揮著重要作用[26-28]。SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙?；?，調(diào)節(jié)參與葡萄糖和脂質(zhì)代謝的各種基因的表達，有研究報道，SIRT1可以通過其去乙?；饔谜{(diào)節(jié)細胞代謝[27]。由圖4可知，與正常對照組相比，模型組中磷酸化的AMPK、SIRT1和PGC-1α蛋白表達水平顯著降低（p＜0.05）。茶籽皂苷干預(yù)后能夠顯著促進AMPK的磷酸化并對SIRT1和PGC-1α蛋白上調(diào)水平且呈劑量依賴性。其中，磷酸化的AMPK蛋白表達水平分別增加3.92倍、4.95倍和6.63倍，SIRT1蛋白表達水平分別增加了0.86倍、1.36倍和1.77倍，PGC-1α蛋白表達水平分別增加3.10倍、3.11倍和4.33倍。由此可得，茶籽皂苷能夠改善高脂飲食攝入后引起的能量紊亂，抑制小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)積累，該作用可能是通過激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號通路實現(xiàn)的。

2.6 茶籽皂苷對高脂飲食小鼠肝臟中PPAR-γ蛋白表達的影響

PPAR-γ作為PPAR家族的關(guān)鍵成員，具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能。研究表明，PPAR-γ有能夠促進游離脂肪酸代謝，調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用[28]。如圖5所示，與正常對照組相比，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的HFD組小鼠肝臟中PPAR-γ的表達水平降低了41.42%（p＜0.05）。與HFD組相比，茶籽皂苷干預(yù)能顯著上調(diào)小鼠肝臟組織中PPAR-γ蛋白水平（p＜0.05），且蛋白表達程度與給藥劑量成正比，分別增加了2.83倍、4.27倍和5.51倍。而激活PPAR-γ能夠減少轉(zhuǎn)運至肝臟和肌肉的脂肪酸數(shù)量，從而減少脂肪的合成[29]。由此可得，茶籽皂苷可能通過激活PPAR-γ，改善脂質(zhì)沉積，調(diào)控脂質(zhì)代謝。

2.7 茶籽皂苷對高脂飲食小鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響

長期的高脂飲食會導(dǎo)致血液內(nèi)游離脂肪酸增加，造成肝臟脂肪過量和脂毒性環(huán)境，導(dǎo)致線粒體功能障礙及大量ROS的產(chǎn)生，最終引起機體氧化應(yīng)激[30]。SOD是體內(nèi)廣泛存在的自由基清除劑，對于緩解體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)起到重要作用；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的醛類物質(zhì)，可以反映機體過氧化程度；GSH是體內(nèi)良好的抗氧化劑，具有清除和中和體內(nèi)自由基和過氧化物的作用[31,32]。如圖6所示，HFD組小鼠血清中SOD水平顯著低于正常對照組小鼠（p＜0.05），經(jīng)茶籽皂苷處理后，小鼠血清中SOD水平分別上升59.28%、57.03%和88.19%，與HFD組差異均有顯著性差異（p＜0.05）。茶籽皂苷各劑量組小鼠血清中MDA水平較HFD模型組分別降低67.17%、69.42%和81.65%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。此外，茶籽皂苷干預(yù)能夠上調(diào)血清中GSH水平，較HFD組分別提高8.28%、26.82%和84.18%。林玲等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，茶籽皂苷干預(yù)能夠提升高脂血癥大鼠血清中SOD活性并降低MDA水平，從而增強機體的整體抗氧化水平，這與本研究結(jié)果較為接近。因此，本實驗結(jié)果提示茶籽皂苷具有通過清除自由基，增強體內(nèi)抗氧化酶活力，抑制ROS的產(chǎn)生從而改善氧化應(yīng)激狀態(tài)的作用。

3 結(jié)論

經(jīng)4周茶籽皂苷的干預(yù)能夠有效抑制HFD誘導(dǎo)的小鼠體重增加，并通過降低小鼠脂肪組織的重量來緩解脂質(zhì)堆積。茶籽皂苷處理同時也能夠顯著降低小鼠的肝臟指數(shù)和Lee's指數(shù)，改善肝臟組織脂肪變性的程度。茶籽皂苷干預(yù)還能增強小鼠肝臟組織中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、PPAR-γ的蛋白表達，不僅通過促進機體脂肪酸分解代謝以此來改善機體脂質(zhì)代謝的紊亂，還能增加抗氧化酶的活性。此外，茶籽皂苷干預(yù)還能增強血清中SOD和GSH的水平，降低MDA水平，來改善肥胖小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。綜上所述，茶籽皂苷對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖有一定的改善作用，該作用可能與抑制脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)能量代謝、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)等機制有關(guān)。