改進(jìn)QuEChERS-氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法測(cè)定水果中嗎啉脂肪酸鹽的殘留

陳鋰，朱正偉，汪薇，榮茂，江豐，王會(huì)霞

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430075）

嗎啉脂肪酸鹽果蠟由嗎啉、脂肪酸和天然動(dòng)植物蠟（如棕櫚蠟）或天然動(dòng)植物膠（如紫膠），在一定溫度下反應(yīng)制成。自12到13世紀(jì)起被廣泛使用于水果和蔬菜表面，用于防止水分的揮發(fā)、抑制昆蟲(chóng)的侵染和抗菌[1,2]，以達(dá)到長(zhǎng)期存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)哪康摹Ｄ壳笆袌?chǎng)上的水果特別是柑橘、梨和蘋果會(huì)被噴灑上人工生產(chǎn)的嗎啉脂肪酸鹽果蠟，人體誤食后會(huì)在體內(nèi)分解成嗎啉和相應(yīng)的脂肪酸。有動(dòng)物機(jī)體實(shí)驗(yàn)表明，嗎啉在一定劑量下攝入可以引起動(dòng)物肝臟、腎臟損傷；由于環(huán)境和食物中亞硝酸鹽的存在，嗎啉還可以在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)生亞硝基化反應(yīng)生成亞硝基嗎啉，亞硝基嗎啉對(duì)所有受試動(dòng)物均有致癌性[3,4]，屬于WHO規(guī)定的2B類致癌物[5]。歐盟在食品添加劑法規(guī)中，早已禁止銷售含有嗎啉的食物；加拿大衛(wèi)生部門建議嗎啉類物質(zhì)的每日允許攝入量（ADI）不超過(guò)0.48 mg/kg bw·d[6]；而在中國(guó)嗎啉脂肪酸鹽果蠟被允許按照產(chǎn)品要求適當(dāng)添加使用，因此檢測(cè)水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟具有極其重要的意義。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.227-2016《食品添加劑嗎啉脂肪酸鹽果蠟》只對(duì)果蠟的理化指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定和檢測(cè)，對(duì)其含量的檢測(cè)方法并未給出。文獻(xiàn)中的方法也主要集中于嗎啉的直接提取和檢測(cè)[7,8]，檢測(cè)方法有液相法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法等[9-11]，由于嗎啉分子量較小，在儀器分析中出峰時(shí)間較早且峰型較差，在復(fù)雜的食品基質(zhì)中存在很大的干擾問(wèn)題。同時(shí)，由于生產(chǎn)嗎啉脂肪酸鹽果蠟使用的脂肪酸和天然動(dòng)植物蠟種類繁多，市面上的嗎啉脂肪酸鹽果蠟各不相同，難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量，嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢測(cè)方法未見(jiàn)報(bào)道。

為提高食品樣品中目標(biāo)化合物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性并降低基質(zhì)干擾等問(wèn)題，樣品的前處理技術(shù)十分重要。QuEChERS方法被廣泛的應(yīng)用于食品前處理步驟中[12]，目前有兩種官方的前處理方法，分別是AOAC（Association of Official Agricultural Chemists）推薦使用的乙酸鹽作為緩沖劑的方法[13]和CEN（European Committee for Standardization）使用的檸檬酸鹽作為緩沖劑的方法[14]，其前處理方法都是使用提取試劑對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行提取后分層，有機(jī)相通過(guò)不同吸附劑進(jìn)行純化達(dá)到去除食物基質(zhì)中色素、脂肪和蛋白質(zhì)等干擾物的目的[15,16]。本研究根據(jù)嗎啉脂肪酸鹽果蠟的基本性質(zhì)，經(jīng)QuEChERS方法提取、凈化后，通過(guò)衍生的方法將水果中的嗎啉脂肪酸鹽果蠟轉(zhuǎn)換成亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR），使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，建立QuEChERS-GC-MS/MS法檢測(cè)水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的殘留，為實(shí)現(xiàn)水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ 9000 GC-MS/MS氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Avanti JXN-30高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；ME 2002 E型分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XH-C渦旋混合器，江蘇金怡儀器科技公司；N-EVAP 24氮吹儀，美國(guó)Organomation公司。

水果購(gòu)于超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醚、二氯甲烷，均為色譜純，德國(guó)默克公司；弗羅里硅土填料（Florisil）40～60 μm、十八烷基鍵合硅膠填料（C18）40～60 μm、N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）40～60 μm、石墨化炭黑吸附劑（GCB）40～60 μm，北京迪馬科技有限公司；嗎啉、N-亞硝基嗎啉（NMOR），Toronto Research Chemicals；鹽酸、亞硝酸鈉、無(wú)水硫酸鎂（MgSO4），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取1.0 mg（精確至0.0001 mg）嗎啉和亞硝基嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈溶解并定容至100 mL，避光-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

分別取全果、果皮和果肉，切碎放入攪碎機(jī)中制備成勻漿，準(zhǔn)確移取10.0 g至50 mL離心管中，加入1%酸化（甲酸）乙腈10 mL，1 g氯化鈉，1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈渦旋1 min，以4000 r/min離心3 min；取上清液7 mL，加入PSA 300 mg、GCB 300 mg，渦旋1 min；取上清液5 mL，加入2.5 mL 200 g/L HCl和2.5 mL 300 g/L NaNO240 ℃超聲10 min，冰浴3 h，期間每30 min渦旋一次，每次1 min，衍生完成后加入1 g NaCl，以4000 r/min離心3 min，取上清液2.5 mL至試管中，40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL乙腈定容，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定分析。

1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別稱取不含目標(biāo)物的空白水果樣品10.0 g，按1.3節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理。用基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)對(duì)各被測(cè)組分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)作圖，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 儀器條件

色譜條件：色譜柱：HP-FFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1 min；以15 ℃/min升溫至120 ℃保持1 min；以30 ℃/min升溫至240 ℃保持5 min，總時(shí)長(zhǎng)16 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃，流速1.3 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：EI源；電離能量70 eV，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲3.5 min，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，其具體參數(shù)見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 亞硝基嗎啉的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 The mass spectrometry conditions of N-nitrosomorpholine

1.6 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由儀器中的Xcalibur分析軟件收集，Quan Browser定量軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)匯總后，經(jīng)Office軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的選擇

乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、1%甲酸-乙腈、乙醚是QuEChERS方法中常見(jiàn)的萃取溶劑[17]，提取試劑的選擇可以有效的降低基質(zhì)效應(yīng)，減少共萃取物，提高后續(xù)凈化和衍生步驟的效果。前期實(shí)驗(yàn)表明，水果中水分含量較大，加入無(wú)水硫酸鎂會(huì)迅速結(jié)塊并放熱降低目標(biāo)化合物的提取率，因此實(shí)驗(yàn)中不加入無(wú)水硫酸鎂，使用陶瓷均質(zhì)子達(dá)到分散基質(zhì)的效果。本實(shí)驗(yàn)以陽(yáng)性柑橘為研究對(duì)象，通過(guò)衍生后亞硝基嗎啉峰面積比較六種常用有機(jī)試劑（見(jiàn)圖2）對(duì)嗎啉脂肪酸鹽果蠟的提取效果。

結(jié)果表明，乙酸乙酯的提取效果最差，二氯甲烷的提取效果最好，但是會(huì)引入更多的雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行干擾，由于二氯甲烷不溶解于水，在第二步衍生過(guò)程中亞硝基化反應(yīng)在兩相中進(jìn)行，導(dǎo)致衍生化效果不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度偏差大于20%，不符合GB 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求。1%甲酸-乙腈混溶于水提取效果較好，目標(biāo)化合物在酸性條件下衍生穩(wěn)定，因此選用1%酸化乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化填料的優(yōu)化

由于果汁基質(zhì)含有較高的維生素、色素和糖分對(duì)后續(xù)衍生有較大的影響[18]，為保證提取效率的同時(shí)排除基質(zhì)干擾，本實(shí)驗(yàn)以陽(yáng)性柑橘為研究對(duì)象，通過(guò)衍生后亞硝基嗎啉峰面積進(jìn)行比較，對(duì)凈化填料和用量進(jìn)行選擇并優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)比較了單因素條件下PSA、C18、Florisil、GCB不同使用量對(duì)目標(biāo)化合物提取的影響（圖3）。結(jié)果表明，PSA和GCB可以有效的去除柑橘中不同雜質(zhì)對(duì)嗎啉脂肪酸鹽的影響，目標(biāo)化合物峰面積隨著用量的增加而提高，在300 mg時(shí)凈化效果最優(yōu)，繼續(xù)增加凈化填料用量會(huì)吸附目標(biāo)化合物并對(duì)提取產(chǎn)生影響；C18在50 mg時(shí)效果最優(yōu)，隨著用量的增加峰面積逐漸降低；Florsil對(duì)目標(biāo)化合物影響較大不適于嗎啉脂肪酸鹽果蠟的凈化。由于柑橘中色素較多，單獨(dú)使用PSA雖然凈化效果較好，但是凈化液依然帶有顏色，而使用GCB凈化后為無(wú)色溶液。為進(jìn)一步篩選凈化填料，將最優(yōu)條件下的PSA、GCB和C18分別進(jìn)行混合同單獨(dú)使用PSA凈化效果進(jìn)行比較（如圖3，mixed-mode）。結(jié)果表明，PSA和GCB混合使用的效果最優(yōu)（MS-A），色素的存在對(duì)后續(xù)衍生存在一定的干擾，C18的加入對(duì)目標(biāo)化合物有一定的影響。因此，選用300 mg PSA和300 mg GCB作為凈化劑填料。

2.3 衍生效果的優(yōu)化

嗎啉脂肪酸鹽果蠟是由嗎啉、脂肪酸和天然動(dòng)植物蠟（如棕櫚蠟）或天然動(dòng)植物膠（如紫膠），在一定溫度下反應(yīng)制成的食品添加劑。由于嗎啉含有仲胺基團(tuán)，仲胺在酸性條件下可以和亞硝酸鈉、亞硝酸鹽水溶液或氮氧化物（如N2O3、N2O4、N2OX）發(fā)生亞硝基化反應(yīng)生成N-亞硝胺（NAms）[19-21]。因此，根據(jù)嗎啉這個(gè)特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使在常溫條件下，不論嗎啉脂肪酸鹽果蠟取代基團(tuán)是什么，嗎啉脂肪酸鹽果蠟都可以發(fā)生亞硝基化反應(yīng)生成亞硝基嗎啉，反應(yīng)如圖4所示。本實(shí)驗(yàn)分別討論了鹽酸和亞硝酸鈉濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)衍生效果的影響，使用陽(yáng)性鮮榨桔汁為樣本，通過(guò)峰面積進(jìn)行比較。由圖5鹽酸和亞硝酸鈉濃度從0 g/L到800 g/L的正交試驗(yàn)可知，鹽酸在200 g/L濃度下和亞硝酸鈉300 g/L進(jìn)行混合衍生效果最優(yōu)，隨著濃度的增加衍生效果逐漸降低，通過(guò)測(cè)量衍生pH發(fā)現(xiàn)，酸性條件下有利于亞硝基化反應(yīng)，最優(yōu)pH約為3.3左右，當(dāng)亞硝酸鈉過(guò)量時(shí)，衍生環(huán)境變成強(qiáng)堿性，對(duì)反應(yīng)成抑制效果。

食品基質(zhì)中的亞硝基化反應(yīng)速率會(huì)受到許多因素的干擾，如維生素C對(duì)反應(yīng)有抑制作用，會(huì)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間[18]。為減少食品基質(zhì)對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)探究了不同反應(yīng)時(shí)間和溫度下的反應(yīng)效率。如圖6所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)峰面積逐漸提高，溫度越高亞硝基化反應(yīng)的速率越慢。當(dāng)實(shí)驗(yàn)樣本置于冰箱冷凍層溫度設(shè)置為-25 ℃時(shí)，提取溶劑乙腈會(huì)從水相中分離出來(lái)從而降低反應(yīng)速率。因此，最佳的反應(yīng)溫度為0 ℃反應(yīng)時(shí)間為3 h。

2.4 檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)的考察

由于嗎啉脂肪酸鹽果蠟種類各不相同，但衍生主要發(fā)生在其母體嗎啉環(huán)上，都是將嗎啉轉(zhuǎn)變成亞硝基嗎啉，所以使用嗎啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備1、10、50、100、200、400、800 μg/L 7個(gè)不同水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液。加入10 mL 1%酸化乙腈，2.5 mL 300 g/L HCl和2.5 mL 200 g/L NaNO240 ℃超聲10 min，冰浴衍生3 h，期間每30 min渦旋一次，每次1 min，衍生完成后加入1 g NaCl，以4000 r/min離心3 min，取上清液2.5 mL至試管中，40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL乙腈定容，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜。

在最優(yōu)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件下，通過(guò)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)和目標(biāo)化合物的峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。對(duì)市售水果樣品同水平加標(biāo)，通過(guò)1.3前處理后經(jīng)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，外標(biāo)法定量繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)ME（Matrix effect）以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與純空白溶劑標(biāo)曲斜率之比來(lái)確定；最低檢出限（limit of detection，LOD）由3倍信噪比得出（S/N=3）；最低定量限（limit of quantification，LOQ）由10倍信噪比得出（S/N=10）。

分別比較了柑橘、梨和蘋果三種水果全果、果皮和果肉的基質(zhì)效應(yīng)，由表2可知，基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果范圍在-28.9到-80.6之間，所有結(jié)果均超過(guò)基質(zhì)效應(yīng)可接受的標(biāo)準(zhǔn)（±20%），基質(zhì)效應(yīng)明顯，水果果肉比果皮表現(xiàn)出了更強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，因此在實(shí)際檢測(cè)中為保證結(jié)果準(zhǔn)確，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)化合物進(jìn)行定量分析。衍生后的亞硝基嗎啉在1～800 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，亞硝基嗎啉檢出限在0.14～1.09 μg/kg之間，定量限在0.47～3.63 μg/kg之間，該方法可以滿足復(fù)雜基質(zhì)中痕量物質(zhì)的檢測(cè)。

表2 亞硝基嗎啉的線性方程、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限Table 2 Analytical performance of the proposed method for NMOR

2.5 回收率和日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

空白水果樣品中準(zhǔn)確加入嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加量分別為4、8、40 μg/kg，按最優(yōu)條件進(jìn)行測(cè)定，方法的準(zhǔn)確度用回收率表示，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次。方法的日內(nèi)精密度用6次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。由表3可知，衍生后的亞硝基嗎啉在不同水果中的加標(biāo)回收率范圍為73.6%～118.5%，RSD為3.6%～15.2%（n=6）。

表3 嗎啉的添加回收率和RSDTable 3 Average recoveries (n=6) and relative standard deviations (RSD) at three spiking levels

2.6 實(shí)際樣品分析

采用優(yōu)化建立的GC-MS/MS分析方法應(yīng)用于果皮、果肉和整個(gè)水果的分析，選擇表面光滑、光亮的水果樣品作為實(shí)際監(jiān)測(cè)樣品。衍生化后蘋果和梨果肉中NMOR含量較低或未檢出，嗎啉脂肪酸鹽果蠟主要覆蓋在水果表面。全柑橘、柑橘皮、柑橘肉、全蘋果、蘋果皮、全梨和梨皮的NMOR水平分別為95～712、20～366、10～90、98～263、18～132、110～291、20～143μg/kg。柑橘、梨和蘋果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢出率分別為78.5%、42.8%、35.7%。這些結(jié)果表明，水果中存在嗎啉脂肪酸鹽果蠟的殘留污染，其中柑橘類風(fēng)險(xiǎn)最高。實(shí)際樣本結(jié)果表明，本方法靈敏度高，方法簡(jiǎn)單，在實(shí)際樣本中有較高的檢出率，適用于日常水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢測(cè)和分析。

3 結(jié)論

由于生產(chǎn)加工工藝的不同，市面上的嗎啉脂肪酸鹽果蠟存在多種不同的形式，在檢驗(yàn)過(guò)程中難以對(duì)其進(jìn)行定性和定量。目前水果表面的檢測(cè)方法主要是對(duì)嗎啉的檢測(cè)，具有一定的局限性，無(wú)法準(zhǔn)確的代表嗎啉脂肪酸鹽果蠟。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)嗎啉脂肪酸鹽果蠟的性質(zhì)，通過(guò)亞硝基化反應(yīng)將嗎啉脂肪酸鹽果蠟轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的亞硝基嗎啉進(jìn)行監(jiān)測(cè)，使用改進(jìn)QuEChERS作為前處理方法，對(duì)提取試劑、凈化劑種類和用量進(jìn)行選擇和優(yōu)化，建立了QuEChERS-GC-MS/MS法測(cè)定水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢測(cè)方法。采用1%甲酸-乙腈為提取溶劑，QuEChERS凈化處理，5.5 mol/L鹽酸和4.3 mol/L亞硝酸鈉進(jìn)行衍生，實(shí)現(xiàn)了嗎啉脂肪酸鹽果蠟的定性和定量方法，檢出限為0.14～1.09 μg/kg，定量限為0.47～3.63 μg/kg，該方法成功的應(yīng)用于實(shí)際水果的檢測(cè)，并提供了一種方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、分離效果好的食品基質(zhì)中嗎啉脂肪酸鹽果蠟殘留檢測(cè)方法，在理論和實(shí)際上都具有重要的意義。