超高靜壓對非濃縮還原楊梅果汁中氧化酶的鈍化作用

吳新怡，孟梓怡，朱吟非，羅子陽，王超，段翰英

（暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東廣州 510632）

楊梅作為我國主要的亞熱帶水果，果色鮮艷、汁液豐富、酸甜適度、風味獨特，深受消費者青睞，具有很高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值[1]。果汁、果醋、蜜餞果脯、水果罐頭等為楊梅主要的深加工產(chǎn)品，其中楊梅果汁的產(chǎn)量最大[2-4]。NFC果汁是以鮮果為原料，直接經(jīng)榨汁和殺菌等工序所制得的一種果汁產(chǎn)品[5]。由于其不經(jīng)過高溫濃縮和還原等工序，可最大程度地保持果汁的原有風味、口感和營養(yǎng)價值，健康新鮮，符合當前的消費趨勢和市場需求。

目前，NFC及傳統(tǒng)果汁的滅菌方式仍以熱處理為主，這種方式嚴重破壞了產(chǎn)品的營養(yǎng)、風味、色澤，導(dǎo)致了非酶褐變、維生素分解和揮發(fā)性化合物損失等問題的產(chǎn)生。近年來，以超高靜壓（HHP）等為主的非熱殺菌技術(shù)在食品行業(yè)中發(fā)展迅猛。HHP實現(xiàn)低溫滅菌，更大程度地保留了食品感官和營養(yǎng)特性，極大滿足了消費者對最少化食品加工的需求。在對NFC橙汁品質(zhì)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，相比高溫短時殺菌（110 ℃，8.6 s），HHP處理（600 MPa/1 min）對NFC橙汁殺菌效果較好，且對總酚、維生素C、抗氧化活力、天然色澤和感官風味起到了更好的保護作用[6]。

多酚氧化酶（PPO）與過氧化物酶（POD）是影響果汁褐變、品質(zhì)劣變的主要氧化酶，HHP可鈍化酶從而提高果汁品質(zhì)。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)HHP處理能通過鈍化PPO與POD的活性，從而顯著降低西瓜汁的褐變程度。經(jīng)HHP處理的香蕉豆?jié){復(fù)合汁，其PPO、POD活性分別在壓力為400 MPa、100～400 MPa時顯著降低[8]；Ortu?o等[9]報道了菲律賓番石榴果泥中的POD經(jīng)600 MPa/5 min后，其活性下降了78%。桃汁經(jīng)600 MPa/25 min后，其PPO活性下降了79%[10]。可見不同果汁中的氧化酶對HHP的耐壓性不同，但有關(guān)HHP對楊梅果汁中氧化酶的影響未見報道。

本文主要研究了HHP壓力與保壓時間，以及持續(xù)保壓對楊梅果汁中PPO與POD鈍化的影響。對比傳統(tǒng)高溫滅酶，擬合建立HHP壓力與酶活性的一級動力學(xué)回歸方程，得到PE，ND、Dp及K等關(guān)鍵性指標，為楊梅果汁中氧化酶的鈍化起指導(dǎo)預(yù)測作用，以期為HHP加工果汁、延長果汁保質(zhì)期提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮楊梅（原產(chǎn)地：中國仙居）。

PPO活性檢測試劑盒（BC0190）、POD活性檢測試劑盒（BC0095），中國北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CQC2-600型全液相超高靜壓食品滅菌機，北京速原中天公司；HR2874榨汁機，荷蘭飛利浦公司；14886真空包裝機，浙江寧波得力有限公司；YC-520L醫(yī)用冷藏箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；Centrifuge5810R離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 楊梅汁制備

楊梅清洗后浸泡于冰水浴中，去核，用榨汁機擠壓得到粗楊梅汁；然后用冷凍高速離心機于8000 r/min離心10 min（4 ℃），取上清液，得到澄清楊梅汁（鮮榨楊梅汁）。

1.3.2 HHP及高溫處理

因考慮壓力的上升會帶來溫度的增加（壓力每上升100 MPa，樣品和加壓介質(zhì)溫度上升3 ℃）[11,12]，分別用300、450、600 MPa壓力處理楊梅果汁0、5、10、15、25、30 min，并對600 MPa/30 min處理組，進行2～3次重復(fù)加壓（即2～3次600 MPa/30 min處理）。另取一組高溫滅菌（100 ℃，15 min）。每個實驗均重復(fù)三次，處理完成后將所有樣品于4 ℃冷藏儲存。

1.3.3 酶活性測定

PPO活性和POD活性測定按各自檢測試劑盒說明使用方法操作。

吸取0.005 mL鮮榨楊梅汁或高溫、HHP處理的楊梅果汁，加入1 mL試劑盒內(nèi)的酶提取液進行冰浴勻漿；8000×g 4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測。分別調(diào)節(jié)分光光度計波長至410 nm、酶標儀波長至470 nm處測定PPO、POD樣品的吸光度，通過計算得到酶活性A（U/mL)：

式中：

A——t（min）時間HHP處理后剩余酶活性，U/mL；

ΔABS——吸光度變化值。

文中出現(xiàn)的酶活性（%）計算公式如下：

式中：

A0——酶的初始活性，U/mL。

1.3.4 數(shù)據(jù)的實驗設(shè)計和統(tǒng)計分析

以壓力水平（300～600 MPa）和保壓時間（0～30 min）為自變量，運用IBM SPSS Statistics 25進行數(shù)據(jù)分析，評價壓力和時間及其交互作用對酶活性的影響。采用廣義線性方法（generalized linear model，GLM）對結(jié)果進行方差分析，通過鄧肯多重比較各因素水平之間的顯著性差異。酶活性（因變量）與自變量水平（壓力、時間）的相關(guān)性由公式（4）定義為：

式中：

Xijk——各種因素的共同影響；

μ——各種處理的觀測結(jié)果；

?j——第一個影響因素；

?k——第二個影響因素；

?jk——相互影響因素；

εijk——實驗誤差分析。

1.3.5 動力學(xué)數(shù)據(jù)分析

將酶的壓力失活分為兩種影響效應(yīng)，一是加壓與降壓引起的活性變化（相當于壓力脈沖效應(yīng)），二是在保壓時間內(nèi)壓力對酶活性的一級動力學(xué)分析。在保壓時間內(nèi)，酶的壓力失活是以一級速率動力學(xué)為基礎(chǔ)的，如公式（5）：

式中：

K——反應(yīng)速率常數(shù)，min-1。

在給定壓力下，導(dǎo)致酶初始活性下降90%的保壓時間，即酶活性減少一個對數(shù)值所花的時間稱之為D值，D值可從log（A/A0）與時間的對應(yīng)關(guān)系中得到，如公式（6）。

根據(jù)Riahi等[11]定義，壓力脈沖為保壓時間為0 min的壓力處理技術(shù)，即樣品被加壓到指定壓力后立即減壓的過程。PE為初始活性減去經(jīng)過脈沖后的活性（對數(shù)標度）得到[11,13]，如公式7。ND表示酶活性降低一個對數(shù)所需要的壓力脈沖數(shù)[14]，如公式（8）。

Dp值為時間等效值，定義為在給定的壓力下脈沖一次等同于在這個壓力下保持時間的效果，即一個壓力脈沖實現(xiàn)的等效破壞。由于D值為在給定壓力下與其保壓時間的關(guān)系，所以Dp值可以由PE而導(dǎo)致的酶活性對數(shù)減少獲得[11]，如公式（9）：

2 結(jié)果與討論

2.1 HHP壓力和時間對PPO和POD活性的影響

鮮榨楊梅果汁中PPO初始活性為17.14 U/mL，POD為48.10 U/mL。HHP處理對PPO和POD的酶活性影響如圖1a、1b所示。隨著壓力升高、時間延長，酶活性均會有不同程度的下降。壓力大小、保壓時間及其相互作用對酶活性的影響是極其顯著的（p＜0.001)。同時，不同壓力水平下酶活性水平平均值均有顯著性差異，且不受保壓時間的影響。對比POD，HHP對鈍化PPO的效果更好。300 MPa/0 min處理的PPO和POD的鈍酶效果最差，PPO甚至出現(xiàn)了激活現(xiàn)象，其酶活性為鮮榨的105%；而在600 MPa、保壓時間大于20 min時，PPO滅酶率達到90%以上，POD達到80%以上。在600 MPa處理時，保壓時間的延長對酶活性下降影響很小（均下降不到5%）。將楊梅汁在600 MPa/30 min HHP重復(fù)2～3次處理，同時對比高溫滅菌（100 ℃，15 min）處理組，PPO和POD活性變化分別見圖1c、1d。高溫滅菌后，兩種酶都完全被滅活，HHP處理中，酶未被完全滅活，且隨著HHP處理次數(shù)的增加，其活性變化小于1%，鈍化效果不明顯。

改變酶活性的方式主要分為兩種。一種是對酶（主要成分為蛋白質(zhì)）二、三級構(gòu)象的改變，另一種是改變酶的修飾位點。酶的三級結(jié)構(gòu)由疏水鍵和離子相互作用力（靜電相互作用力和范德華作用力）維持，二級結(jié)構(gòu)主要由氫鍵鏈接，從而保持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。酶在HHP下會出現(xiàn)類似于高溫處理下結(jié)構(gòu)的變化[15]，壓力通過破壞酶蛋白的離子相互作用力和各種非共價鍵（疏水鍵、氫鍵）來鈍化酶的活性[16]。這些作用力和分子運動的減弱會進一步導(dǎo)致酶蛋白二三級結(jié)構(gòu)的展開，而形成酶活性中心的氨基酸殘基僅在分子的天然結(jié)構(gòu)中發(fā)生作用，因此折疊結(jié)構(gòu)的展開將會導(dǎo)致酶部分結(jié)構(gòu)解體，從而導(dǎo)致酶活性的喪失[17,18]。在低壓下，根據(jù)Balny等[19]和Cheftel[20]的研究，壓力不足以使蛋白酶三級結(jié)構(gòu)完全展開，而通過改變部分空間結(jié)構(gòu)位置從而暴露出酶的部分修飾位點，最終增加酶活性。因此，楊梅汁中PPO的部分修飾位點在300 MPa處理后暴露出來，增加了其活性；而在高壓400 MPa以上，PPO和POD的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使酶鈍化。但酶活性變化還受水果種類影響。Riahi等[11]報道了蘋果汁在400 MPa水平下，PPO活性降低了0.12個對數(shù)周期。而葡萄汁在經(jīng)400 MPa/15 min處理后，PPO得到了激活[21]。POD相對耐壓性較強，蘋果和辣根中的POD已被證明在極端HHP下仍具有較高的抗壓能力，即使在壓力高達1000 MPa的情況下，也未能被完全滅活，且在保壓時間15～30 min內(nèi)時，鈍化效果并不明顯[22]。

2.2 酶的鈍化動力學(xué)分析

2.2.1 PPO和POD的動力學(xué)擬合

如表1所示，對PPO和POD活性進行一級動力學(xué)擬合，得到一級線性回歸方程。各個壓力水平下R2值均大于0.8，說明模型與實際擬合較好，線性回歸方程可以較好地擬合楊梅汁中保壓時間分別和PPO、POD活性之間的關(guān)系；皮爾遜相關(guān)系數(shù)為負值，表明酶活性隨著保壓時間的增加而減少，同時其絕對值均大于0.9，進一步表明了保壓時間與酶活性具有顯著相關(guān)性。因此，線性回歸方程對楊梅汁中PPO和POD活性與HHP條件處理條件的擬合結(jié)果是可靠的。

表1 不同壓力水平下PPO和POD活性的動力學(xué)擬合Table 1 PPO and POD activity fitting results under different pressure levels

2.2.2 PPO和POD的動力學(xué)參數(shù)分析

進一步利用ND和DP等值表明壓力脈沖次數(shù)、保壓時間與酶活性的關(guān)系（表2）。PE則表示酶活性每降低一個對數(shù)所需要在該壓力條件下施加的脈沖次數(shù)的倒數(shù)。例如，PE為0.2時表示在五個壓力脈沖下酶活性降低一個對數(shù)；對應(yīng)于相應(yīng)的ND值，即酶活性降低一個對數(shù)所需要的壓力脈沖數(shù)為5。

表2 NFC楊梅汁中PPO和POD的PE、失活率、ND、D、K、DP值Table 2 PE, percentage of inactivation, ND, D, K, DP of PPO and POD in NFC bayberry juice

因此，對于PPO，在400 MPa時，約3次壓力脈沖才能使PPO活性下降一個對數(shù)；而在600 MPa時，ND值為1.04，表示約一個壓力脈沖即可使酶活性降低一個對數(shù)。但在300 MPa時，ND值卻為負值，這是由于PPO為蛋白質(zhì)類內(nèi)源酶，在較低壓力下，其三級結(jié)構(gòu)被破壞，部分活性修飾位點暴露，酶被激活。對于PPO，K值隨著壓力的增大而增大，表明壓力越高，該壓力下壓力保持時間對楊梅汁中PPO所產(chǎn)生的鈍化效果越強，推測有可能是在較低壓力下，酶的三級結(jié)構(gòu)未被完全破壞，在保壓過程中，所施加的壓力影響也不足以使其結(jié)構(gòu)得到完全不可逆破壞，而較高壓力下PPO的二、三級結(jié)構(gòu)在保壓過程中出現(xiàn)持續(xù)性不可逆失活，破壞氫鍵和分子間相互作用力，從而對酶活性產(chǎn)生較強的抑制效果。

對于POD，在600 MPa時，ND值為1.59，表明單獨施加一次高壓脈沖并不能達到鈍化POD 90%酶活性的效果。此外，兩種酶的K值都逐漸增大，而POD的K值所增加的速度遠低于PPO，這也表明POD活性受壓力影響比PPO弱，體現(xiàn)了POD更好的耐壓性。同時，兩種酶在600 MPa時Dp值都為19，表明在該壓力下，保壓19 min對酶產(chǎn)生的影響都相當于施加一次高壓脈沖所產(chǎn)生的效果。這與一些研究結(jié)果相似，如在對HHP處理黑果枸杞汁影響的研究中，300 MPa以上HHP處理能有效鈍化POD酶，其酶活降為鮮榨的50%。對于PPO酶，300 MPa未能顯著降低其酶活性，400 MPa以上壓力則有較好的鈍化效果，使PPO活性降低到0.5 U/mL以下[23]。

3 結(jié)論

3.1 楊梅果汁經(jīng)過HHP處理后，隨著壓力升高、時間延長，酶活性產(chǎn)生不同程度的下降，300 MPa/0 min條件下HHP處理的鈍酶效果最差。HHP的壓力大小和保壓時間及其相互作用對PPO和POD活性的影響均有極高的顯著性（p＜0.001）。但600 MPa/30 min條件下，加壓次數(shù)的增加不能明顯加強鈍化效果。

3.2 PPO在300 MPa處理下PE值為-0.02，出現(xiàn)酶激活現(xiàn)象，說明在低壓條件下，壓力效應(yīng)有可能使PPO更多的酶促位點得到暴露，從而增強了酶活性。在較高壓力（400～600 MPa）處理下，PPO活性受到了不同程度的鈍化，在600 MPa/10 min即可達到鈍化90%酶活性的效果。在300～600 MPa之間，隨壓力增大，K值從3.03×10-2到12.12×10-2依次遞增，表明壓力越高，該壓力下壓力保持時間對楊梅汁中PPO所產(chǎn)生的鈍化效果越強。在600 MPa下ND值為1.04，表明在實際生產(chǎn)中，施加一次高壓脈沖即可鈍化近90%；Dp值為19表明在該壓力下，保壓19 min對酶產(chǎn)生的影響相當于施加一次高壓脈沖所產(chǎn)生的效果。

3.3 POD在300～600 MPa壓力處理下均顯示出不同程度的鈍化效果，但與PPO相比，POD表現(xiàn)出了較高的耐壓性，在500 MPa下僅能鈍化50%左右活性，即使在600 MPa下加壓30 min、重復(fù)多次的情況下，都未能達到鈍化90%酶活性的效果。在300～600 MPa之間，隨著壓力的增大。K值從1.23×10-3依次增加到7.67×10-3，但斜率小于PPO，表明POD的耐壓性要高于PPO。在600 MPa下ND值為1.56，表明單獨施加一次高壓脈沖并不能達到鈍化POD 90%酶活性的效果；Dp值也為19，表現(xiàn)出了與PPO相類似的規(guī)律。這些參數(shù)對NFC楊梅果汁中氧化酶的鈍化起到了一定指導(dǎo)預(yù)測作用，同時在實際生產(chǎn)中能夠進一步滿足企業(yè)需求、節(jié)省生產(chǎn)時間。