珍珠貝肉抗氧化肽制備工藝優(yōu)化及其對(duì)酪氨酸酶的抑制活性

黃潘鈿，陳冰冰，沈金鵬，黃文，夏珍，李應(yīng)坤，王湘華，喻言，曹庸，苗建銀*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

（2.北海黑珍珠海洋生物科技有限公司，廣西北海 536000）

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）又稱合浦珠母貝，簡稱珍珠貝，是我國南方海水珍珠養(yǎng)殖的主要品種。中國藥典（2015）指出珍珠具有“解毒生肌，潤膚祛斑”等功效。近年來對(duì)珍珠貝的研究發(fā)現(xiàn)，不但珍珠，其貝肉和分泌物中同樣含有與珍珠類似功效的活性成分，有待深入挖掘和開發(fā)利用。當(dāng)前，在珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，取珠后的貝肉、分泌物等利用附加值很低，亟需研究如何對(duì)其進(jìn)行深入的開發(fā)和利用。

任何有氧呼吸的生物都會(huì)產(chǎn)生自由基。體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)在清除活性氧（ROS）、防止細(xì)胞損傷方面起著重要作用。然而，過量的ROS產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致氧化損傷的發(fā)生，啟動(dòng)DNA、RNA和膜脂等生物分子氧化，進(jìn)一步可能引起機(jī)體失調(diào)，造成提前衰老或如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和心血管等疾病的產(chǎn)生[1]。因此需要攝入足夠數(shù)量的抗氧化劑來預(yù)防或減緩ROS引起的氧化應(yīng)激，合成抗氧化劑雖可降低食品中的自由基水平，但對(duì)人體健康有潛在的毒性作用[2]，開發(fā)天然抗氧化劑具有重要研究意義。

酪氨酸酶是黑色素生成的限速酶[3]，酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化成L-多巴，L-多巴進(jìn)一步氧化成L-多巴醌，最終形成黑色素[4]。雖然黑色素有助皮膚抵御紫外線，但過量酪氨酸酶表達(dá)會(huì)造成黃褐斑、雀斑和老年斑等皮膚問題。大量研究表明，具有抗氧化作用的活性組分多具有抑制酪氨酸活性的效果[5,6]，通過抗氧化劑調(diào)節(jié)酪氨酸酶活性已被確定為促進(jìn)皮膚白皙的有效策略。合成酪氨酸酶抑制劑存在高細(xì)胞毒性和不穩(wěn)定性[7]，亟需開發(fā)無毒、穩(wěn)定、有效的新型抑制劑。我國古代傳統(tǒng)中醫(yī)和現(xiàn)代研究表明，珍珠具有公認(rèn)的美白、護(hù)膚功效，而其中的蛋白/肽組分發(fā)揮了重要作用[8]。珍珠貝肉作為取珠后的附屬物，富含蛋白成分，從中提取類似于珍珠中的抗氧化活性組分并用于抑制酪氨酸酶活性將是一種可行的思路，也有利于珍珠貝肉的高值化利用。

本研究以珍珠貝肉為原料，以抗氧化能力為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定最佳酶解制備抗氧化肽工藝條件，并研究多肽的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性，為珍珠貝肉的深加工和產(chǎn)業(yè)化高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

馬氏珍珠貝肉來自廣西合浦縣；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）、L-酪氨酸、L-多巴、酪氨酸酶，上海源葉生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、鄰苯三酚、氯化亞鐵等試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

AL104萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SC110A臺(tái)式超高速真空離心干燥機(jī)，北京賽萬特電子科技有限公司；Enspire2300多功能酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer公司；pH計(jì)，上海佑科儀器有限公司；RD-50DTZ低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司；WZ-100恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最優(yōu)酶篩選

根據(jù)胰蛋白酶（pH 8.00、溫度40 ℃）、堿性蛋白酶（pH 9.00、溫度50 ℃）、中性蛋白酶（pH 7.00、溫度45 ℃）、木瓜蛋白酶（pH 6.50、溫度55 ℃）、胃蛋白酶（pH 2.00、溫度40 ℃）五種酶的理論最適條件，將貝肉絞碎成肉糜，取5 g肉糜，加20 mL蒸餾水，調(diào)pH，分別加酶15 mg，恒溫水浴酶解3 h，高溫滅酶（90 ℃，15 min），冷卻離心（4000 r/min，15 min），取上清液稀釋10倍后，采用ABTS自由基清除能力測定方法評(píng)價(jià)的抗氧化能力。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

結(jié)合1.3.1篩選最優(yōu)酶結(jié)果，分別考察pH（6.50、6.75、7.00、7.25、7.50）、溫度（35、40、45、50、55 ℃）、時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、料液比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）和酶底比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對(duì)酶解液抗氧化能力影響。制備酶解液后將上清液稀釋30倍，測ABTS自由基清除率。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

結(jié)合1.3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)：溫度（45、50、55 ℃）、pH（7.00、7.25、7.50）、時(shí)間（2、3、4 h），優(yōu)化珍珠貝肉蛋白抗氧化肽酶解工藝。

1.3.4 氨基酸分析

參照《GB 5009.235-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》中測定方法使用全自動(dòng)氨基酸分析儀（Sykam）進(jìn)行測定。

1.3.5 抗氧化活性的測定

1.3.5.1 ABTS自由基清除能力測定

參考Floegel等[9]的方法略作修改。分別用超純水配制7 mmol/L ABTS溶液和140 mmol/L過硫酸鉀溶液，取88 μL過硫酸鉀溶液加入5 mL ABTS溶液中，混勻室溫避光12 h后，在734 nm下稀釋至吸光值為0.7±0.02，得到ABTS+·工作液。取100 μL樣液和100 μL ABTS+·工作液混合，室溫反應(yīng)10 min后于734 nm測吸光值。以超純水作為空白對(duì)照。根據(jù)公式（1）計(jì)算清除率，并計(jì)算IC50值。

式中：

At——樣品和ABTS+·工作液的吸光值；

Ar——樣品和超純水的吸光值；

Ao——超純水和ABTS+·工作液的吸光值。

1.3.5.2 氧自由基吸收能力（ORAC）測定

參考Nimalaratne等[10]的方法略做修改，取50 μL樣品和100 μL 4 μmol/L Fluorescein溶液混合均勻37 ℃保溫10 min后迅速加入50 μL 153 mmol/L AAPH溶液，在激發(fā)波長490 nm和發(fā)射波長514 nm下進(jìn)行測定，每隔2 min測定一次熒光值，連續(xù)測定60個(gè)循環(huán)。以磷酸緩沖溶液代替樣品作為空白對(duì)照。Trolox溶液（25、50、75、100和125 μmol/L）作為標(biāo)準(zhǔn)參考物，Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.38x+0.84（R2=0.9833）。

根據(jù)公式（2）、（3），通過熒光曲線下面積（AUC）和相對(duì)面積（Net AUC）計(jì)算ORAC值，用Trolox當(dāng)量（μmol TE/g凍干粉）表示。

式中：

AUC——熒光曲線面積；

Net AUC——樣品組和空白組的相對(duì)面積。

1.3.5.3 Fe2+螯合能力測定

參考張美玲等[11]的方法略做修改，取50 μL樣液、30 μL 0.25 mmol/L FeCl2溶液和70 μL超純水，混勻放置2 min。迅速加入50 μL 0.5 mmol/L Ferrozine水溶液，充分震蕩混勻后靜置10 min后在562 nm下測吸光值，以超純水為空白對(duì)照。根據(jù)公式（4）計(jì)算Fe2+螯合能力，并計(jì)算IC50值。

式中：

At——樣品、FeCl2溶液和Ferrozine水溶液的吸光值；

Ac——超純水、FeCl2溶液和Ferrozine水溶液的吸光值。

1.3.6 酪氨酸酶抑制效果測定

參考耿廣青等[12]的方法略做修改，分別以L-酪氨酸和L-多巴作為單酚和二酚底物。取40 μL 0.1 mg/mL L-酪氨酸溶液或L-多巴溶液，加入40 μL樣液和80 μL磷酸緩沖溶液，在37 ℃保溫10 min后加入40 μL 250 U/mL酪氨酸酶溶液啟動(dòng)反應(yīng)，在475 nm下分別測0 min和30 min的吸光值。根據(jù)公式（5）計(jì)算分別計(jì)算酪氨酸單酚酶和酪氨酸二酚酶的抑制率，并計(jì)算IC50值。

式中：

A1——底物、樣液、酪氨酸酶和PBS體系的吸光值；

A2——樣液、酪氨酸酶和PBS體系的吸光值；

A3——底物、酪氨酸酶和PBS體系的吸光值；

A4——酪氨酸酶和PBS體系的吸光值。

1.3.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS version 21.0軟件和Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)酶篩選

由于不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，蛋白酶種類會(huì)影響酶解液的抗氧化活性[13]。圖1可知，中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶制備的酶解液抗氧化活性良好，其ABTS自由基清除率分別為91.87%、91.80%和91.55%。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及考慮環(huán)境友好等因素，選擇中性蛋白酶作為最優(yōu)酶。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH對(duì)ABTS自由基清除率的影響

pH值不僅影響蛋白酶的狀態(tài)，也影響酶與底物的結(jié)合情況[14]，不同反應(yīng)的最適pH也受到底物種類和濃度的影響。如圖2所示，pH值為6.50～7.25時(shí)，酶解液抗氧化能力不斷升高，在7.25時(shí)達(dá)到最大82.46%，之后明顯開始降低。pH值過低或者過高都會(huì)影響中性蛋白酶的酶解能力，進(jìn)而影響珍珠貝肉酶解液的抗氧化能力，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步選定pH值為7.25左右。

2.2.2 溫度對(duì)ABTS自由基清除率的影響

如圖3所示，當(dāng)溫度為35～50 ℃時(shí)，酶解液抗氧化能力不斷升高，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大79.70%，之后開始有降低趨勢。溫度會(huì)影響酶活力，在低溫階段，酶活力隨著溫度上升，酶促反應(yīng)加快，但溫度高于最適溫度后，高溫可能會(huì)改變蛋白酶的結(jié)構(gòu)，使蛋白酶和底物的接觸位點(diǎn)產(chǎn)生變化，導(dǎo)致催化活性逐漸降低，從而抑制了酶解反應(yīng)[15]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步選定酶解溫度為50 ℃左右。

2.2.3 時(shí)間對(duì)ABTS自由基清除率的影響

如圖4所示，當(dāng)時(shí)間為1～3 h時(shí)，酶解液抗氧化能力不斷升高，在3 h時(shí)達(dá)到最大85.76%，隨后明顯不斷降低?？赡茉诙虝r(shí)間內(nèi)，酶解反應(yīng)尚未完全，因此隨著時(shí)間的延長，酶和底物充分反應(yīng)，珍珠貝肉蛋白被逐漸酶解成多肽，產(chǎn)生更多具有抗氧化效果的肽段。隨著酶解時(shí)間的延長，部分具有抗氧化活性的多肽可能被水解成更小的片段[16]。Zou等[17]研究指出抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系存在緊密聯(lián)系，因此過度水解可能導(dǎo)致多肽的氨基酸的數(shù)量和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而降低了多肽的抗氧化活性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步選定酶解時(shí)間為3 h左右。

2.2.4 酶底比對(duì)ABTS自由基清除率的影響

如圖5所示，酶解液抗氧化能力在酶底比從0.1%增加到0.4%的過程中不斷增強(qiáng)，從76.48%升高到80.31%，酶底比大于0.4%后趨于平緩。酶底比較小時(shí)，由于加酶量較少，酶和底物反應(yīng)尚未飽和。隨著酶底比增大，反應(yīng)體系中酶濃度增大，酶和底物接觸充分，反應(yīng)加快，單位時(shí)間內(nèi)得到更多具有抗氧化效果的多肽。但酶底比增大到一定程度，反應(yīng)趨于飽和，繼續(xù)增大酶底比對(duì)于酶促反應(yīng)幫助不大[18]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)濟(jì)效益，選定酶底比為0.4%。

2.2.5 料液比對(duì)ABTS自由基清除率的影響

如圖6所示，當(dāng)料液比從1:1增加到1:5的過程中，酶解液抗氧化能力在不斷減弱，從88.70%降低到82.71%。新鮮珍珠貝肉中水分含量83%[19]，貝肉本身含水分較多，在料液比1:1時(shí)，底物和蛋白酶的濃度較高，接觸更充分，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，隨著加水比例增大，底物和蛋白酶的濃度降低，接觸較不充分，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。在實(shí)際生產(chǎn)中，用水量少可以節(jié)約成本和水資源，因此選定料液比為1:1。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度（A）、pH（B）和時(shí)間（C），以珍珠貝肉酶解液對(duì)ABTS自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化珍珠貝肉抗氧化肽酶解工藝，結(jié)果見表1。運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件，對(duì)表1進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Box-behnken design and results for response surface analysis

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

從方差分析結(jié)果可知，模型p值小于0.0001，表示回歸模型高度顯著。失擬項(xiàng)p值為0.1510，不顯著，表示回歸模型預(yù)測值與實(shí)測值的擬合水平較好，模型合適?；貧w系數(shù)R2為0.9744，說明該模型相關(guān)度好[20]。R2Adj值為0.9414，說明有94.14%的響應(yīng)值變化可以用模型來解釋，試驗(yàn)誤差較小，模型具有良好的擬合度，可以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確分析和預(yù)測[16]。在回歸方程中，B2、C2和AC達(dá)到極顯著水平，A2、AB和BC達(dá)到顯著水平。從一次項(xiàng)系數(shù)的對(duì)比，響應(yīng)值受到不同因素影響的順序依次是：pH、時(shí)間、溫度。通過響應(yīng)面方差分析得到酶解制備珍珠貝抗氧化肽工藝的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=97.35-0.027A+0.16B+0.064C-0.29AB-0.74AC-0.39BC-1.07A2-0.085B2-0.86C2。模型預(yù)測最優(yōu)酶解條件為溫度49.82 ℃，pH 7.27，時(shí)間3.03 h，料液比1:1，酶底比0.4%，在此條件下ABTS清除率為97.36%。

溫度、時(shí)間和pH的交互對(duì)珍珠貝肉抗氧化肽抗氧化能力的影響如圖7、8、9所示。每個(gè)等高線圖上都有一個(gè)橢圓，說明最佳點(diǎn)恰好在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)[21]。等高線形狀越接近橢圓形，說明兩因素之間的交互作用越強(qiáng)。從圖7、8、9中可以看出溫度和時(shí)間的交互作用最強(qiáng)，pH和時(shí)間的交互作用次之，溫度和pH的交互作用最弱。

2.3.2 模型驗(yàn)證

結(jié)合實(shí)際操作，實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證酶解條件修正為溫度50.00 ℃，pH 7.25，時(shí)間3.00 h，料液比1:1，酶底比0.4%，在此條件下ABTS清除率為98.48%，與預(yù)測值接近，說明模型優(yōu)化結(jié)果較準(zhǔn)確。

2.4 氨基酸組成分析

珍珠貝肉抗氧化肽的氨基酸組成如表3所示，氨基酸種類豐富，必需氨基酸占33.36%，營養(yǎng)價(jià)值較高。疏水性氨基酸是肽清除自由基能力關(guān)鍵因素[17]，如脯氨酸具有吡咯環(huán)可以作為氫供體，苯丙氨酸有助于清除自由基。酸性氨基酸帶負(fù)電荷，具有自由基猝滅活性。堿性氨基酸具有螯合金屬離子的能力[22]，組氨酸含有咪唑環(huán)可以酶催化反應(yīng)中作為質(zhì)子供體，賴氨酸能幫助形成疏水微環(huán)境，芳香族氨基酸中苯環(huán)的存在可以顯著提高肽的抗氧化能力[17]。在珍珠貝肉抗氧化肽中，有助提高抗氧化能力的氨基酸包括疏水性氨基酸（41.57%）、酸性氨基酸（25.32%）、堿性氨基酸（17.76%）和芳香族氨基酸（6.88%）的總占比為88.03%。同時(shí)，精氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等已被報(bào)道有助于抑制酪氨酸酶的氨基酸含量高[7]，占比39.69%。從物質(zhì)基礎(chǔ)層面表明珍珠貝肉抗氧化肽具有較好清除自由基能力，也可能具有抑制酪氨酸酶催化氧化反應(yīng)的能力。

表3 氨基酸組成分析Table 3 Analysis of amino acids contents

2.5 抗氧化活性的測定

氧化體系十分復(fù)雜，相關(guān)的體外抗氧化評(píng)價(jià)方法也多種多樣，因此本研究從清除ABTS自由基、氧自由基吸收能力和螯合金屬離子三個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)最優(yōu)酶解物凍干粉的抗氧化能力。

2.5.1 ABTS自由基清除能力測定

ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)可用于樣品的總抗氧化能力的測定，其機(jī)制是通過樣品提供一個(gè)氫原子或一個(gè)電子清除ABTS自由基[23]。如圖10所示，隨濃度增大，最優(yōu)酶解物的ABTS自由基清除率提高，呈現(xiàn)良好量效關(guān)系，在2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到88.77%。相關(guān)報(bào)道中發(fā)酵法制備馬氏珠母貝多肽的ABTS自由基的IC50值為1.78 mg/mL[24]，而本研究所得珍珠貝肉最優(yōu)酶解物的IC50值為0.57 mg/mL，說明酶解法制備多肽ABTS自由基清除效果很好。據(jù)報(bào)道Cys、Tyr、Arg、His、Lys、Met、Phe和Val具有ABTS清除活性[25]，而在最優(yōu)酶解物中上述氨基酸占總氨基酸比例高達(dá)34.79%，因此可能有助于更好地清除ABTS自由基。

2.5.2 氧自由基吸收能力（ORAC）

氧自由基吸收能力（ORAC）的測定機(jī)制是樣品提供質(zhì)子以清除AAPH產(chǎn)生的過氧自由基（ROO·）和羥基自由基（OH·）[23]，ORAC值越大表明清除效果越好。在相同Net AUC下，不同濃度珍珠貝肉最優(yōu)酶解物對(duì)應(yīng)的Trolox濃度如圖11所示。珍珠貝肉最優(yōu)酶解物濃度150～400 μg/mL，相同Net AUC對(duì)應(yīng)的Trolox的濃度93.16～195.61 μmol/L。相關(guān)報(bào)道中燕麥麩水解蛋白和牡蠣水解物的ORAC值分別為131～418 μmol TE/g蛋白和450～606 μmol TE/g蛋白[23,26]，本研究所得珍珠貝肉最優(yōu)酶解物的ORAC值為601.38 μmol TE/g凍干粉，與牡蠣水解物相近，高于燕麥麩水解物，說明珍珠貝肉最優(yōu)酶解物具有良好的氧自由基吸收能力。從氨基酸角度分析，Cys、Trp、Tyr、His、Met、Arg、Leu、Lys和Phe具有氧自由基吸收能力[25]，而在珍珠貝肉最優(yōu)酶解物中上述氨基酸占總氨基酸比例高達(dá)33.84%，有助于吸收自由基，具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.5.3 Fe2+螯合能力測定

Fe2+是促氧化劑，可以使過氧化氫和有機(jī)氫過氧化物生成羥基自由基[23]，可能導(dǎo)致氧化誘導(dǎo)的代謝紊亂[22]，因此樣品具有螯合Fe2+能力可反應(yīng)樣品具有的抗氧化能力。如圖12所示，在1.00～2.50 mg/mL范圍內(nèi)隨濃度增大，珍珠貝肉最優(yōu)酶解物的Fe2+螯合能力從9.81%提高到16.61%，提高效果較弱，而在2.50～10.00 mg/mL之間，F(xiàn)e2+螯合能力從16.61%提高到71.42%，提高效果明顯，其IC50值為6.89 mg/mL。張德舉[25]研究發(fā)現(xiàn)只有Cys具有直接的Fe2+螯合能力，而Leu、Phe、Trp、Tyr和Val等氨基酸具有協(xié)同作用。低濃度時(shí)螯合能力較弱，高濃度時(shí)具有良好螯合Fe2+的能力可能是因?yàn)檎渲樨惾庾顑?yōu)酶解物中Cys占比僅2.93%，可能因此低濃度時(shí)Cys含量過低，螯合作用不顯著，高濃度下Cys含量提高，并在其他氨基酸協(xié)同作用下表現(xiàn)出顯著的螯合活性。

2.6 酪氨酸酶活性抑制的測定

黑色素的生物合成是通過一系列復(fù)雜的氧化反應(yīng)和酶反應(yīng)進(jìn)行的。酪氨酸酶是一種多酚氧化酶，酶活性包括單酚酶活性和雙酚酶活性[27]，參與黑色素生成的兩個(gè)速率限制反應(yīng)[28]，分別是將單酚底物L(fēng)-酪氨酸氧化成為L-多巴和將二酚底物L(fēng)-多巴氧化成L-多巴醌，進(jìn)而生成黑色素。通過測定珍珠貝肉最優(yōu)酶解物對(duì)酪氨酸酶催化氧化L-酪氨酸和L-多巴反應(yīng)的抑制效果，可以間接反映樣品是否具有抑制黑色素生成的能力。

2.6.1 酪氨酸單酚酶活性抑制的測定

如圖13所示，隨濃度增大，珍珠貝肉最優(yōu)酶解物的酪氨酸單酚酶活性抑制率提高，濃度在0.25～2.50 mg/mL之間，抑制率為49.50%～67.33%，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。相關(guān)報(bào)道中金槍魚粉和紫娟茶酚類提取物的單酚酶抑制IC50值分別為3.44 mg/mL和3.52 mg/mL[29,30]，而珍珠貝肉最優(yōu)酶解物的IC50值為0.37 mg/mL，顯著低于魚粉酶解物和部分酚類，說明其具有很強(qiáng)的酪氨酸單酚酶抑制能力。

2.6.2 酪氨酸二酚酶活性抑制的測定

如圖14所示，隨濃度增大，珍珠貝肉最優(yōu)酶解物的酪氨酸二酚酶抑制率提高，濃度在2.50～15.0 mg/mL之間，抑制率從9.79%提高到44.93%，抑制率提高明顯，濃度在15.0～25.0 mg/mL之間，抑制率從44.93%提高到54.03%，可能是隨著濃度提高，對(duì)酶的抑制反應(yīng)趨于飽和。相關(guān)報(bào)道中，魚膠原肽（20 mg/mL）的酪氨酸二酚酶抑制率為32.55%[31]，珍珠貝肉最優(yōu)酶解物的IC50值為20.27 mg/mL，說明其具有良好的酪氨酸二酚酶抑制能力。

3 結(jié)論

3.1 本研究在最優(yōu)酶篩選的基礎(chǔ)上，分析料液比、酶底比、pH、溫度和時(shí)間等單因素對(duì)ABTS清除率的影響，并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化最終確定了珍珠貝肉的最優(yōu)酶解工藝為溫度50 ℃，pH 7.25，時(shí)間3 h，料液比1:1，酶底比0.4%，最優(yōu)酶解物的ABTS清除率為98.48%，具有良好的抗氧化活性，為大量酶解制備珍珠貝肉抗氧化肽提供工藝參考。

3.2 通過氨基酸分析，珍珠貝肉最優(yōu)酶解物含有17種氨基酸，營養(yǎng)價(jià)值高，其中有助于提高抗氧化活性的氨基酸占比高達(dá)88.03%，有助于抑制酪氨酸酶活性的氨基酸占比39.69%，表明最優(yōu)酶解物在物質(zhì)層面上具備開發(fā)抗氧化劑和美白劑的潛力。

3.3 通過對(duì)珍珠貝肉最優(yōu)酶解物凍干粉的體外抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明本研究所得的抗氧化肽具有很強(qiáng)的ABTS自由基清除能力（IC500.57 mg/mL）、氧自由基吸收能力（601.38 μmol TE/g凍干粉）和較好的Fe2+螯合能力（IC506.89 mg/mL），并具有很好的酪氨酸單酚酶抑制能力（IC500.37 mg/mL）和酪氨酸二酚酶抑制能力（IC5020.27 mg/mL），具備體外抗氧化和抑制酪氨酸酶的雙重能力。本研究將對(duì)其進(jìn)行分離純化和深入研究，旨在利用珍珠貝肉開發(fā)為具有雙重功效的新型抗氧化劑和美白劑，實(shí)現(xiàn)社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。