基于穴位電刺激對神經(jīng)病理性疼痛大鼠p38MAPK影響探討穴位鎮(zhèn)痛機制

楊代和，魏 真，林永寶，黃 文，龍 波，張孟麗，蔡 楠，李 潔

(1. 福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2. 安溪縣醫(yī)院，福建 安溪 362499；3. 漳州市第三醫(yī)院，福建 漳州 363007)

穴位電刺激是在針刺刺激穴位的基礎上，通過脈沖電流以增強療效的針灸療法，該方法可提高神經(jīng)病理性疼痛閾值[1]。p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)是細胞內(nèi)外信號重要傳遞者，p38MAPK在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著重要作用[2]。本項目立足于前期實驗及理論研究，觀察了穴位電刺激足三里、夾脊穴對坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用及對背根神經(jīng)節(jié)中p38MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑的影響，旨在進一步探討穴位電刺激鎮(zhèn)痛的具體機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性8周齡SD大鼠125只，體重200～250 g，由福建中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(閩)2016-0005。每籠養(yǎng)5只，室內(nèi)保持通風，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～24 ℃，濕度50%～65%。

1.2實驗方法 應用隨機數(shù)字表將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、抑制劑組、針刺穴位組、電刺激穴位組，每組25只。抑制劑組于造模前24 h參照Poon等[3]方法鞘內(nèi)置管：腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，俯臥位固定，選取L3～4棘突間隙，備皮、消毒，切開皮膚，分離棘突間隙的肌肉和筋膜，暴露并穿破硬脊膜將PE-10導管(內(nèi)徑0.28 mm、外徑0.64 mm，Smiths Medical International Ltd．英國)朝頭端置入2 cm，當大鼠出現(xiàn)甩尾反射以及有腦脊液流出，提示置管成功，固定導管，導管通過皮下隧道從頸部引出。第2天采用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉各組大鼠，仰臥位固定，切開皮膚，假手術組分離肌肉筋膜，暴露坐骨神經(jīng)后未進行結(jié)扎；其余組參考文獻[4]建立神經(jīng)病理性疼痛模型：鈍性分離坐骨神經(jīng)，4-0鉻制羊腸線結(jié)扎，每兩道間隔1 mm，結(jié)扎4道。術后縫合皮膚后預防感染，假手術組和模型組不給予其他處理；抑制劑組鞘內(nèi)注射SB203580(購自美國Med Chem Express公司)2 g，2次/d，持續(xù)注射14 d；針刺穴位組采用28號1寸毫針(華佗牌，蘇州醫(yī)療用品有限公司)針刺足三里及雙側(cè)L3～6夾脊穴，但不給予電刺激，2次/d，持續(xù)14 d；電刺激穴位組針刺方法同針刺穴位組，針刺后接LH-800型穴位神經(jīng)刺激儀(北京航空航天大學)進行電刺激，連續(xù)波，頻率2 Hz，強度1 mA，刺激30 min，2次/d，持續(xù)14 d。

1.3檢測指標及方法

1.3.1行為學檢測 分別于術前1 d及術后1 d、3 d、7 d、14 d當天8:00進行疼痛行為學檢測，環(huán)境保持靜音、恒溫通風，避免對大鼠造成激惹，檢測前先將大鼠放在檢測環(huán)境中適應1 h，依次檢測機械觸誘發(fā)痛閾(MWT)和熱縮足反射潛伏期(PTWL)，間隔時間為1 h。所有檢測都由同一人完成。

1.3.1.1MWT檢測方法 通過動態(tài)足底觸覺儀進行測試，采用Chaplan等[5]改良的評估法評估。將大鼠置于透明隔籠中適應15 min，然后將von Frey細絲垂直刺激大鼠后腳掌中部皮膚，刺激力度(0.4 g、0.6 g、1.0 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g)從2.0 g開始，每次刺激持續(xù)6～8 s，根據(jù)大鼠的反應依次評估(up-down 法[6])，大鼠表現(xiàn)縮足或舔足反應則標記為陽性，無反應則標記為陰性，每只大鼠評估時間控制在1 min之內(nèi)。當von Frey細絲刺激強度小于4 g即確認出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛。

1.3.1.2PTWL檢測方法 采用熱刺激痛覺測試儀檢測，參考Hargreaves[7]的方法評估。評估前15 min大鼠先放在樹脂玻璃籠中適應，每只評估3次，每次間隔3 min，取縮足反應平均值為熱痛閾值，最長熱刺激時間20 s。

1.3.2腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表達檢測 采用 Western blot法檢測：分別于術前1 d及術后1 d、3 d、7 d、14 d，每組隨機選取5只大鼠處死，取出其手術側(cè)腰膨大勻漿，每個電泳道中加入30 μg總蛋白，用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，濾膜在室溫下封阻1 h，在抗TNF-α抗體、抗p38MAPK抗體以及抗β-actin抗體中4 ℃孵育一夜，所得的印跡通過二抗孵育1 h，放到ECL試劑盒中顯影1 min，然后于X射線片上暴露1～10 min，p38MAPK和TNF-α的數(shù)據(jù)分別與各自的β-actin在同一張濾膜上進行內(nèi)對照。

1.4統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均呈正態(tài)分布，組內(nèi)比較用重復測量資料的方差分析，組間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠MWL和PTWL比較 假手術組大鼠各時間點的MWL、PTWL比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與術前1 d比較，模型組、抑制劑組、針刺穴位組、電刺激穴位組術后各時間點的MWL均明顯降低(P均<0.05)，PTWL均明顯縮短(P均<0.05)，且術后3 d時MWL最低、PTWL最短。術后1 d、3 d時與抑制劑組比較,模型組、針刺穴位組、電刺激穴位組的MWL更低，PTWL更短,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。術后3 d、7 d、14 d時與模型組比較,針刺穴位組、電刺激穴位組的MWL更高，PTWL更長,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。術后7 d、14 d時與針刺穴位組比較，電刺激穴位組的MWL更高，PTWL更長，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。術后7 d、14 d時,抑制劑組和電刺激穴位組的MWL、PTWL比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖1和圖2。

2.2各組大鼠腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表達情況比較 假手術組大鼠各時間點腰膨大中TNF-α、p38MAPK蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與術前1 d比較，模型組、抑制劑組、針刺穴位組、電刺激穴位組術后各時間點腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相對表達量均明顯增高(P均<0.05)，且術后3 d時最高。術后1 d、3 d時，抑制劑組腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相對表達量均明顯低于模型組、針刺穴位組、電刺激穴位組(P均<0.05)。術后3 d、7 d、14 d時，針刺穴位組、電刺激穴位組腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相對表達量明顯低于模型組(P均<0.05)。術后7 d、14 d時，電刺激穴位組腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相對表達量明顯低于針刺穴位組(P均<0.05)。術后7 d、14 d時,抑制劑組和電刺激穴位組腰膨大中TNF-α、p38MAPK蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖3和圖4。

3 討 論

大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型引起坐骨神經(jīng)痛覺超敏類似于神經(jīng)病理性疼痛患者的癥狀，中樞和外周敏化都是神經(jīng)病理性疼痛的病理因素[8]。脊髓背角神經(jīng)元突觸可塑性的改變形成突觸長時程增強，同脊髓背角神經(jīng)元的中樞敏化以及神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生有著密切關系。損傷的外周感覺神經(jīng)元激活小膠質(zhì)細胞釋放細胞因子，引起興奮性氨基酸釋放增多，尤其是谷氨酸的釋放，谷氨酸與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合后，細胞膜對鉀離子、鈉離子的通透性增強，引起突觸后膜電位，當去極化到達一定程度時，則鈣離子通道開放，內(nèi)流的Ca2+與鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合形成Ca2+/CaM/復合物，激活一氧化氮合酶(NOS)，催化一氧化氮(NO)生成[9]。NO是一種神經(jīng)信號傳遞因子，經(jīng)過級聯(lián)反應促使信息放大，引發(fā)中樞敏化[9]。周圍神經(jīng)損傷通過脊髓背角、丘腦等神經(jīng)通路，激發(fā)大腦皮質(zhì)產(chǎn)生痛覺[10]。

針刺是中國的傳統(tǒng)療法，穴位電刺激是在針刺基礎上發(fā)展而來。足三里、夾脊穴是治療下肢慢性疼痛的有效穴位，電針上述穴位可改善局部血液循環(huán)，抑制炎癥反應和滲出，有效減輕急慢性疼痛，改善神經(jīng)病理性疼痛癥狀。Liang等[11]研究發(fā)現(xiàn)穴位電刺激能有效抑制神經(jīng)病理性疼痛大鼠腰段脊髓背角小膠質(zhì)細胞的活化，具有很好的即刻鎮(zhèn)痛作用和后效應。馬騁等[12]通過坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，穴位電刺激可以抑制C纖維誘發(fā)電位突觸長時程傳遞的形成，阻斷突觸可塑性的形成，降低脊髓背角神經(jīng)元的敏感性。本實驗結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠傷后1 d出現(xiàn)機械觸誘發(fā)痛閾和熱痛覺閾值下降，傷后3 d達到最低值，與Wu等[13]報道的結(jié)果一致。術后3 d、7 d、14 d時，針刺穴位組、電刺激穴位組的MWL明顯高于模型組，PTWL明顯長于模型組；術后7 d、14 d時，電刺激穴位組的MWL明顯高于針刺穴位組，PTWL明顯長于針刺穴位組。提示針刺足三里及雙側(cè)L3～6夾脊穴可以改善坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠機械觸誘發(fā)痛閾和熱痛覺閾值下降，穴位電刺激比常規(guī)針刺效果好。

p38 MAPK是MAPK家族成員之一，同應激、炎癥反應等密切相關，脊髓背角小膠質(zhì)細胞的p38MAPK蛋白磷酸化導致神經(jīng)病理性疼痛[14-15]。陸培春等[16]研究認為大鼠坐骨神經(jīng)損傷導致腰段脊髓背角TNF-α等炎癥因子升高。TNF-α可激發(fā)蛋白激酶級聯(lián)反應，促使p38MAPK磷酸化為p-p38MAPK，p-p38MAPK進入到其他部位或細胞胞核中，調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)錄、受體表達以及蛋白合成等過程，對機體疼痛信號的傳遞發(fā)揮重要作用[17]。SB203580是p-p38MAPK抑制劑，可以阻斷坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α，并可明顯抑制p-p38MAPK表達和磷酸化[18]。本實驗結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠傷后1 d腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表達量明顯升高，3 d達到最高值，與楊亮等[19]研究一致，提示TNF-α與p38之間可能存在著重要聯(lián)系，且在神經(jīng)損傷后的神經(jīng)病理性疼痛形成過程中發(fā)揮重要作用。術后3 d、7 d、14 d時，抑制劑組、針刺穴位組、電刺激穴位組腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相對表達量均明顯低于模型組；術后7 d、14 d時，電刺激穴位組腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相對表達量明顯低于針刺穴位組，與抑制劑組比較差異均無統(tǒng)計學意義。提示針刺足三里及雙側(cè)L3～6夾脊穴可以抑制坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表達，但穴位電刺激效果更好。

綜上所述，穴位電刺激治療與常規(guī)針刺治療相比，可更及時、有效地緩解神經(jīng)病理性疼痛；穴位電刺激的鎮(zhèn)痛作用可能是通過調(diào)節(jié)L3～6脊髓背角p38MAPK受體的表達從而影響TNF-α合成來實現(xiàn)的。今后可用基因敲除手段等進一步研究p38MAPK受體與穴位電刺激鎮(zhèn)痛的關系。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。