百合葉燒病發(fā)病過程葉片細胞和差異表達基因分析

葛金濤，王江英，湯雪燕，孫明偉，騰年軍，朱朋波，趙統(tǒng)利，吳秋月，邵小斌

（1. 連云港市農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 連云港 222000；2. 南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095；3. 連云港市海州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 連云港 222006）

0 引 言

【研究意義】百合葉燒病是一種生理性病害，國內(nèi)外百合種植過程中普遍發(fā)生，嚴重影響切花百合和盆栽百合生產(chǎn)質(zhì)量。其發(fā)病癥狀表現(xiàn)為百合生長至30～40 cm，花蕾出現(xiàn)前，頂部6～10 片新葉離葉尖約2 cm 處出現(xiàn)灰白色病斑，后期逐漸向葉尖蔓延，最后變成焦枯狀。百合葉燒病具有顯著的品種特異性，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與葉燒病存在緊密聯(lián)系的品種特征[1]，因此探索百合葉燒病發(fā)病機理，對百合新種質(zhì)創(chuàng)制和栽培技術創(chuàng)新具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發(fā)現(xiàn)，通過剪掉一半剛展開的下部葉片[2]、在發(fā)病之前噴施氯化鈣和硝酸鈣溶液[3]、通過手動展開尚未展開的新葉和降低栽培環(huán)境的濕度[4]等方法能夠降低葉燒病的發(fā)生率，同時施用生根劑、微生物菌肥和使用合適的栽培基質(zhì)均能有效地降低葉燒病的發(fā)生[5?7]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，百合葉燒病發(fā)病原因及防治方法等相關研究已較為深入，其中由缺鈣導致葉燒病發(fā)生已被確認，但由于鈣參與多項植物生理調(diào)節(jié)過程，如何確定葉燒病發(fā)生分子機理，以及缺鈣導致哪些代謝途徑受阻從而產(chǎn)生葉燒病，是今后選育抗葉燒病品種的重要研究基礎?！緮M解決的關鍵問題】通過掃描電鏡和投射電鏡觀察東方百合Tarrango 正常葉片、輕度葉燒葉片和重度葉燒葉片超微結構的差異，并通過比較東方百合Tarrango 正常葉片、葉燒葉片、正常葉片噴鈣和葉燒葉片噴鈣4 種處理的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，以期探索與葉燒病發(fā)病相關的分子機理和關鍵調(diào)控基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以荷蘭進口的Tarrango 百合種球為試驗材料，種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學院東辛農(nóng)場實驗基地日光溫室，Tarrango 百合生長至現(xiàn)蕾期，對部分百合葉燒葉片和正常葉片噴施30 mmol·L?1硝酸鈣葉面肥一次，其余百合噴施等量清水。24 h 后分別取正常葉片 （TarCK）、葉燒葉片（TNCK）、葉面噴鈣正常葉片（TarCa）和葉面噴鈣葉燒葉片（TNCa）4 個處理，干 冰冷藏送樣檢測，每個處理生物學重復3 次。

1 .2 轉(zhuǎn)錄組測序及分析試驗方法

1.2.1 RNA 提取及處理 上述4 個處理中，取每個處理葉片混合樣品1 g，參照TaKaRA 全RNA 提取試劑 操作說明進行葉片總RNA 提取。

1.2.2 文庫構建及測序 百合葉片cDNA 文庫構建及測 序均委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋 百合葉片轉(zhuǎn)錄組測序及對獲得的數(shù)據(jù)庫 Unigene 的全面分析和注 釋，均委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3 百合葉片掃面電鏡及透射電鏡觀察

采集Tarrango 正常葉片、輕度發(fā)病葉燒葉片和重度發(fā)病葉燒葉片（圖1），無菌水漂洗干凈后，手術刀裁成3 mm×3 mm 大小，置于電鏡固定液中固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃保存，4 ℃冰袋運輸送樣至武漢賽維爾生物科技有限公司。

圖1 不同葉燒程度百合葉片F(xiàn)ig. 1 Leaves from different degrees of ULN-infection注：A，百合Tarrango 正常葉片；B，百合Tarrango 輕度葉燒葉片；C，百合Tarrango 重度葉燒葉片。圖2 同。Note: A: Leaf from normal lily plant; B: Leaf from lily plant mildly infected by ULN; C: Leaf from lily plant severely infected by ULN. Same for Fig. 2.

2 結果與分析

2.1 百合葉片葉燒病掃描電鏡分析

如圖2 所示，近軸面表皮層均無氣孔分布，其中Tarrango 正常葉片和Tarrango 輕微葉燒葉片的上表皮細胞橫直徑為500 μm。而Tarrango 重度葉燒葉片上表皮細胞發(fā)生嚴重皺縮，其上皮細胞的橫直徑只有312.5 μm。輕度葉燒時，百合葉片上表皮細胞出現(xiàn)輕微的收縮，重度葉燒時，百合葉片表皮細胞表面出現(xiàn)褶皺痕跡。

圖2 百合葉片近軸面超微結構Fig. 2 Ultrastructure of lily leaves in adaxial view

如圖3 所示，百合葉片遠軸面表皮層分布了大量氣孔，氣孔數(shù)量最多的是Tarrango 重度葉燒葉片（圖3-A），其次為Tarrango 輕度葉燒葉片（圖3-B）和Tarrango 正常葉燒葉片（圖3-C）葉片。Tarrango正常葉片、Tarrango 輕微葉燒葉片和Tarrango 重度葉燒葉片氣孔直徑大小基本一致，均在400 μm 左右。Tarrango 輕度葉燒葉片下表皮層便發(fā)生皺縮現(xiàn)象，重度葉燒葉片皺縮程度更加嚴重。

圖3 百合葉片遠軸面超微結構Fig. 3 Ultrastructure of lily leaves in abaxial view注：A，百合Tarrango 重度葉燒葉片；B，百合Tarrango 輕度葉燒葉片；C，百合Tarrango 正常葉片。Note: A, Leaf from lily plant severely infected by ULN; B, Leaf from lily plant mildly infected by ULN; C, Leaf from normal lily plant.

2.2 百合葉片透射電鏡分析

正常葉片葉肉細胞（圖4-A、B）和輕度葉燒葉肉細胞（圖4-C、D）液泡較大，葉綠體分布在邊緣。重度葉燒葉片的葉肉細胞由于液泡失水，葉綠體分布在整個細胞，細胞較為規(guī)則；重度葉燒細胞由于失水，整個細胞皺縮，形狀不規(guī)則（圖4-E、F）。在葉燒病發(fā)展過程中，葉綠體結構未發(fā)生太大變化，基粒垛疊層數(shù)較多且排列規(guī)律，3 個處理中葉綠體均含有數(shù)量不等的淀粉粒。但重度葉燒葉片葉肉細 胞中，線粒體數(shù)量明顯較少。

圖4 百合葉片透射電鏡下超微結構Fig. 4 Ultrastructure of lily leaves shown by TEM注：A 和B：百合Tarrango 正常葉片；C 和D：百合Tarrango 輕度葉燒葉片；E 和F：百合Tarrango 重度葉燒葉片。Note: A and B: normal leaf of lily Tarrango; C and D: mildly ULN leaf of Lily Tarrango; E and F: severely Lily ULN leaf of Lily Tarrango.

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序組裝及unigene 注釋分析

使用軟件Cutadapt 對測序原始數(shù)據(jù)（Pass filter data）去除接頭以及低質(zhì)量序列，獲得后續(xù)信息分析用的過濾數(shù)據(jù)（Clean data）。4 個處理12 個文庫產(chǎn)生了541 393 662 條序列，約80.68 Gb 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，Unigene 平均長度在148.63 ～149.00 bp，GC 含量變化范圍為49.17%～52.32%（表1）。由表2 可以看出，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)組裝產(chǎn)生了19 585 575 個重疊群，349537 條unigenes，平均長度為513.25 bp。在所有unigenes 序列中，序列長度小于500 bp 的占75.92%（表3）。Unigene注釋分析顯示有124 405 unigenes 獲得注釋，占unigenes總數(shù)的35.59%，其中獲得注釋較多的數(shù)據(jù)庫分別是Nr 注 釋121 501（34.76%）、COG 注 釋49 594 條（14.19%）、Swissport 注 釋72 421 條（20.72%）和K EGG 注釋17 051 條（4.88%）。

表 1 12 個cDNA 文庫的過濾數(shù)據(jù)Table 1 Clean data of 12 cDNA library

表 2 轉(zhuǎn)錄組序列組裝分析Table 2 Summary of transcriptome assembly

表3 Unigene 的長度及數(shù)量統(tǒng)計Table 3 Unigene length and quantity statistics

2.4 差異表達基因篩選及分析

對4 組處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行層次聚類（Hierarchical clustering）分析，噴鈣2 個處理TarCa 與TNCa 基因表達模式相近，并且與噴清水2 個處理TarCK 與TNCK基因表達模式存在顯著區(qū)別，通過基因表達量可以將差異表達基因劃分成A、B 兩個簇（圖5-A），同時通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分組對比分析發(fā)現(xiàn)，TarCK/TarCa比較中差異表達基因最多，總數(shù)為4 816 個，其中上調(diào)表達基因2 419 個，下調(diào)表達基因2 397 個；其次TNCK/TNCa 比較中差異表達基因2 782 個，其中上調(diào)表達基因1 090 個，下調(diào)表達基因1 692 個；TarCK/TNCK 比較中差異表達基因822 個，其中上調(diào)表達基因399 個，下調(diào)表達基因423 個；TarCa/TNCa 比較中差異表達基因最少，總數(shù)為113 個，其中上調(diào)表達基因56 個，下調(diào)表達基因57 個（圖5-B）。

通過PCA（Principal Component Analysis）分析發(fā)現(xiàn)，TarCa 與TNCa 兩個處理的重復組間的變異較小，并且兩個處理間的差異性也較小，而TarCK 與TNCK兩個處理間不但處理間的差異性較大，重復組間的變異也比較大（圖5-C）。同時，在4 組對照分析中，發(fā)現(xiàn)了特異的和共同的差異表達基因，共發(fā)現(xiàn)7 185 個差異表達基因，包括5 860 個特異差異表達基因和1 325 個共同差異表達基因（圖5-D）。其中TarCK/TarCa 與TNCK/TNCa 共差異表達基因最多，為991 個；其次為TarCK/TNCK 與TarCK/TarCa 共差異表達基因為230 個和TNCK/TNCa 與TarCK/TNCK共差異表達基因為96 個，TarCa/TNCa 與TarCK/TNCK共差異表達基因最少，只有1 個，通過上述數(shù)據(jù)表明，噴鈣處理能顯著降低葉燒葉片與正常葉片的差異 表達基因數(shù)量。

圖5 差異表達基因的表達譜分析Fig. 5 Expression profiling of differentially expressed genes注：A，差異表達基因的聚類分析；B，差異表達基因的數(shù)量；C，差異表達基因的主成分分析；D，差異基因維恩圖分析。Note: A: Cluster analysis on differentially expressed genes; B: Number of differentially expressed genes; C: Principal component analysis on differentially expressed genes; D: Venn diagram of differential genes.

2.5 差異基因GO 富集分析

通過GO 富集分析對差異表達基因進行生物學功能研究，在錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR＜0.01 時，25 個GO 條目富集在TarCa/TNCa，25 個GO 條目富集在TarCK/TNCK，31 個GO 條目富集在TarCK/TarCa，31 個GO條目富集在TNCK/TNCa。有18 個GO 條目在4 組對比分析中均有富集，其中，“催化活性” “結合”和“代謝過程”是富集基因最多的GO 條目。在4 組對比分析中有5 個特異性GO 條目，其中“多細胞生物過程”和“繁殖”GO 條目僅在TarCK/TarCa 中富集，“突觸部分”GO 條目僅在TNCK/TNCa 中富集，“細胞外基質(zhì)”和“細胞外基質(zhì)成分”GO 條目僅在TarCa/TNCa 中富集 ，TarCK/TNCK 無特異性GO 條目（圖6）。

注：1，催化活性；2，結合；3，轉(zhuǎn)運活性；4，結構分子活性；5，電子載體；6，核酸結合轉(zhuǎn)錄因子活性；7，酶調(diào)節(jié)活性；8，抗氧化活性；9，分子傳感器活性；10，細胞組分；11，細胞器；12，膜部分；13，細胞器部分；14，細胞膜；15，高分子復合物；16，胞外區(qū)；17，類核；18，細胞連接；19，代謝過程；20，細胞過程；21，單一生物過程；22，生物調(diào)節(jié)；23，應激反應；24，定位；25，發(fā)育過程；26，多生物過程；27，免疫系統(tǒng)過程；28，組織細胞組成或生物起源；29，生殖過程；30，多細胞生物過程；31，繁殖；32，細胞外區(qū)域部分；33，細胞外基質(zhì)；34，細胞外基質(zhì)成分；35，運動；36，生長；37，突觸部分。Note: 1: catalytic activity; 2: binding; 3: transporter activity; 4: structural molecule activity; 5: electron carrier activity; 6: nucleic acid binding transcription factor activity; 7: enzyme regulator activity; 8: antioxidant activity; 9: molecular transducer activity; 10: cell part; 11: organelle; 12:membrane part;13: organelle part; 14: membrane; 15: macromolecular complex; 16: extracellular region; 17: nucleoid; 18: cell junction; 19: metabolic process; 20: cellular process; 21: single-organism process; 22: biological regulation; 23: response to stimulus; 24: localization; 25: developmental process;26: multi-organism process; 27: immune system process; 28: cellular component organization or biogenesis; 29: reproductive process; 30: multicellular organismal process; 31: reproduction; 32: extracellular region part; 33: extracellular matrix; 34: extracellular matrix component; 35: locomotion; 36:growth; 37: synapse part.圖 6 差異表達基因的GO 富集分析Fig. 6 GO enrichment analysis on differentially expressed genes

2.6 差異基因KEGG 富集分析

在植物體內(nèi)，Ca2+參與的代謝調(diào)控十分復雜，通過KEGG 代謝通路分析，在本次轉(zhuǎn)錄組測序中“剪接體” “代謝途徑” “丙酮酸代謝” “次生代謝產(chǎn)物的生物合成”和“光合作用生物的碳固定作用”代謝途徑在4 組試驗處理對比分析中都有基因富集，經(jīng)過差異基因COG 分析，4 組試驗處理對比分析共有25 個COG分組，其中4 組試驗處理共有COG 功能分類22 個，包括“細胞外結構” “信號轉(zhuǎn)導機制” “未知功能基因”“細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸” “翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生” “細胞壁/膜/信封生源論” “一般功能預測基因” “復制、重組和修復” “碳水化合物運輸和代謝” “無機離子的轉(zhuǎn)運和代謝” “細胞骨架” “氨基酸的運輸和代謝” “脂質(zhì)運輸與代謝” “細胞周期控制，細胞分裂，染色體分裂” “能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換” “染色質(zhì)結構和動力學” “翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，伴侶” “輔酶運輸和代謝” “RNA 加工和修飾” “次級代謝產(chǎn)物生物合成、運輸和分解代謝”。

2.7 顯著差異基因分析

結合掃描電鏡和透射電鏡分析，本研究重點關注葉燒病發(fā)病過程和噴施鈣處理中，細胞膜通透性相關基因的表達變化。如表4 所示，在百合葉燒病發(fā)病過程中即TarCK/TNCK 對比分析中，顯著下調(diào)基因有參與脫落酸信號的負調(diào)控的FOLK 基因（Farnesol kinase 法呢醇激酶）[8]、影響脂類物質(zhì)生物合成和細胞膜穩(wěn)定性的PLD1_2 基因（phospholipase D1/2 磷 脂 酶D1/2）[9]、ATPeF1B 基 因（F-type H+-transporting ATPase subunit bet 膜上ATP 合酶）和KCS基 因（3-ketoacyl-CoA synthase 3-酮 脂 酰 輔 酶A 合酶）[10]。同時CALM 基因（Calmodulin 鈣調(diào)蛋白）[11]、ENO 基因（enolase 烯醇酶）[12]和pel 基因（Pectate lyase 果膠酸裂解酶）[13]等響應鈣離子信號和影響木質(zhì)素和果膠生物合成的基因下調(diào)。在百合葉燒病發(fā)病過程中表達量上調(diào)的基因有促進生成脫落酸的AAO基因（abscisic-aldehyde oxidase 脫落醛氧化酶）[14]。

表4 顯著差異表達基因Table 4 Significantly differentially expressed genes

而在葉燒葉片噴鈣后即TNCK/TNCa 對比分析中，表達量上調(diào)的基因有CALM 基因、CPK 基因（Calcium-dependent protein kinase 鈣依賴性蛋白激酶）、EIN2 基因 （ethylene-insensitive protein 2 乙烯不敏感蛋白2）[15]、AUX1 基因（Auxin influx carrier 生長素流入載體）[16]、PLD1_2 基因和果糖和甘露糖的代謝途徑的SORD 基因（L-iditol 2-dehydrogenase L-艾杜糖醇-2-脫氫酶）[17]。與此同時下調(diào)表達的基因有ABF基 因（ABA responsive element binding factor ABA 響應元件結合因子）[18]和參與脂肪酸降解途徑的MFP2基因 （Enoyl-CoA hydratase/3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase 烯酰輔酶A 水合酶/3-羥酰輔酶A 脫氫酶）[19]。

3 討論與結論

通過百合葉片掃描電鏡分析，葉片近軸面表皮細胞大小隨葉燒程度的加深而減小，重度葉燒時，表皮細胞發(fā)生皺縮，表明此時表皮細胞失水。葉片遠軸面表皮細胞在輕度葉燒時發(fā)生皺縮，而近軸面表皮細胞在重度葉燒時才發(fā)生皺縮，說明葉燒癥狀先出現(xiàn)在遠軸面一側(cè)。通過透射電鏡分析，百合葉片在發(fā)生葉燒的過程中，液泡失水是導致表皮細胞體積縮小的原因。因此，推測細胞膜和液泡膜的通透性發(fā)生改變是導致百合葉片葉燒病癥狀的原因。

差異表達基因的PCA 分析發(fā)現(xiàn)，正常葉片3 個重復處理和葉燒葉片3 個重復處理之間的差異性都很大，而正常葉片噴鈣后3 各處理和葉燒葉片噴鈣后3 個處理之間差異性較小。同時在對比分析中也發(fā)現(xiàn)，TarCa/TNCa 比較組差異表達基因顯著少于TarCK 與TNCK，都說明噴鈣處理能降低正常葉片和葉燒葉片之間的差異表達基因數(shù)量，甚至噴鈣處理能夠降低正常葉片和葉燒葉片之間差異表達基因數(shù)量，說明噴鈣處理能緩解葉燒病的發(fā)病過程，這與白菜干燒心[20?21]、萵苣[22]等缺鈣生理性病害的一致。

在分析單個基因表達中發(fā)現(xiàn)，在葉燒病發(fā)病過程中，響應鈣離子信號CALM 基因顯著下調(diào)，而噴鈣處理后CALM 和CPK 基因顯著上調(diào)，說明CALM基因是葉燒病發(fā)病過程中的主要信號傳導基因。同時，葉燒病發(fā)病過程中促進生成脫落酸的AAO 基因顯著上調(diào)，葉燒葉片噴鈣后乙烯信號調(diào)控基因EIN2和生長素輸入載體基因AUX1 表達量上調(diào)，表明葉燒病發(fā)病可能受脫落酸、乙烯和生長素的調(diào)控。同時，葉燒病發(fā)病過程中，在細胞膜和液泡膜穩(wěn)定相關基因phospholipase D1/2、ATPeF1B 、KCS 等表達均顯著下調(diào)。而噴鈣后phospholipase D1/2 顯著上調(diào)，這與擬南芥中PLD 及其產(chǎn)物磷脂酸（PA）調(diào)控ABA響應的負調(diào)控因子[23?24]結果一致。

鈣在植物生理活動中，既起著結構成分的作用，也具有酶的輔助因素功能，它能維持細胞壁、細胞膜及膜結合蛋白的穩(wěn)定性，參與細胞內(nèi)各種生長發(fā)育的調(diào)控作用。因此目前雖然基本證實百合葉燒病是由缺鈣導致，但其具體的致病分子機理仍不能十分明晰，今后仍需開展相關基因分析驗證工作，為百合分子育種提供理論支撐。