茉莉花JsMYB305 轉(zhuǎn)錄因子的原核表達(dá)及蛋白純化

萬 超，張 月，胡 莉，伍炳華，袁 媛

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】茉莉Jasminum sambac (L).Ait 為木犀科（Oleaceae）素馨屬（Jasminum）常綠灌木，茉莉花香氣馥郁，廣泛應(yīng)用于“茉莉花茶”窨制、香料香精、化妝品藥品、食品和園林應(yīng)用等方面，是著名的芳香植物[1]。香氣是茉莉花價(jià)值的重要體現(xiàn)方式。研究表明茉莉于夜間開放，主要香氣成分包括芳樟醇、法尼烯、乙酸芐酯[2]等，芳樟醇和法尼烯分別占單萜和倍半萜成分的92%和96%。前人通過對(duì)茉莉花中一些香氣相關(guān)酶活性的測定表明，其香氣釋放是有一定節(jié)律的，且其釋放是受嚴(yán)格調(diào)控的[3]，但相應(yīng)的調(diào)控因子及調(diào)控機(jī)理還少有探究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】MYB 類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物香氣合成在多種植物中均有報(bào)道，如矮牽牛的ODO1（ODORANT1）、EOBI（EMISSION OF BENZENOIDS I）、 EOBII（EMISSION OF BENZENOIDS II）交錯(cuò)調(diào)控苯丙烷類香氣物質(zhì)代謝[4?6]；草莓FaEOBII 調(diào)控花瓣中丁香酚生物合成[7]；番茄SlMYB75 通過激活脂氧合酶途徑和萜類代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子，從而調(diào)控果實(shí)中的香氣物質(zhì)合成[8]。茉莉香氣合成途徑中的一些重要的結(jié)構(gòu)基因或相關(guān)啟動(dòng)子序列已經(jīng)得到克隆和分離[9?16]，啟動(dòng)子區(qū)域存在激素響應(yīng)、光響應(yīng)、MYB結(jié)合位點(diǎn)等多種順式作用元件，表明有些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可能受MYB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】茉莉JsMYB305 與矮牽牛、擬南芥中調(diào)控香氣合成的轉(zhuǎn)錄因子ODO1 及AtMYB21 高度同源，表達(dá)量與花朵香氣釋放同步，且與4 個(gè)茉莉花萜類合成酶基因 JsTPS（Terpene synthase）表達(dá)特征一致，前期研究中發(fā)現(xiàn)JsMYB305 可顯著提高茉莉愈傷組織中4 個(gè) JsTPS 基因的表達(dá)[17]，并激活其啟動(dòng)子的活性，推測JsMYB305 可能通過調(diào)控JsTPS 的表達(dá)從而調(diào)控香氣合成。但JsMYB305 是如何調(diào)控JsTPS 基因表達(dá)的機(jī)制卻并不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步研究JsMYB305 調(diào)控茉莉香氣合成的機(jī)理，本研究通過原核表達(dá)的方式，在體外獲得JsMYB305 重組蛋白，研究結(jié)果可為將來研究JsMYB305 與JsTPSs 基因啟動(dòng)子的體外結(jié)合及篩選JsMYB305 互作蛋白提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以雙瓣茉莉（Jasminum sambac）三年生植物花瓣為材料。取當(dāng)天21：00 開放的茉莉花朵，用剪刀剪 下后迅速用鋁薄紙包好投入液氮中備用。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以茉莉花瓣為材料，參照EasyPure?Plant RNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）的方法提取花瓣RNA。按 照One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行第一鏈cDNA 的合成。以cDNA 為模板，設(shè)計(jì) 含 有Bam H I 和Sal I 酶 切 位 點(diǎn) 的 特 異 性 引 物JsMYB305-F 和JsMYB305-R（表1）擴(kuò) 增JsMYB305的編碼序列。擴(kuò)增體系為：上游引物1 μL，下游引物1 μL， FastPfu PCR Super Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）12.5 μL , H2O 8.5 μL, cDNA 2 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；以下程序35 個(gè)循環(huán) ：95 ℃30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；接著72 ℃ 10 min。

表 1 構(gòu)建原核表達(dá)載體時(shí)擴(kuò)增JsMYB305 編碼序列的引物序列Table 1 Primer sequences for amplifying JsMYB305 coding sequence in prokaryotic expression vector construction

使用Bam H I 和Sal I 同時(shí)酶切pGEX-4T-1 載體和JsMYB305 擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切體系為：Bam H I 0.5 μL，Sal I 0.5 μL，PCR 產(chǎn) 物200 ng/載 體1 μg，快 切 酶Buffer 2 μL，無菌水補(bǔ)足至10 μL ，37 ℃酶切2 h。分別回收目的基因片段和酶切后的原核表達(dá)載體，使用T4 連接酶16 ℃連接過夜。連接體系為：T4 連接酶1 μL，連接酶Buffer 1 μL，載體酶切回收產(chǎn)物1.5 μL，目的基因酶切回收產(chǎn)物3.5 μL，無菌水3 μL。將連接產(chǎn)物取10 μL 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，涂布于含50 mg·L?1氨芐的LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆使用載體上的測序引物（F: 5′-GGGCTG GCAAGCCACGTTTGGT-3′，R: 5′-CCGGGAGCT GCATGTGTCAGAGG-3′）進(jìn)行PCR 鑒定，將陽性菌 液送福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，涂布于含50 mg·L?1的氨芐LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。從平板上挑取一個(gè)單克隆至5 mL 含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min?1，過夜培養(yǎng)。

取1 mL 過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，加入到10 mL含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min?1培養(yǎng)至OD600 nm約0.5 時(shí)，加入0.2 mmol·L?1異丙基-?-D-硫代半乳糖苷（IPTG），不加IPTG 的菌液為對(duì)照，在37 ℃進(jìn) 行誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。

1.4 SDS-PAGE 檢測

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液10 000 r·min?1離心1 min 收集菌體，用200 μL PBS（NaCl 8 g·L?1，KCl 0.2 g·L?1，KH2PO40.24 g·L?1, Na2HPO41.44 g·L?1）緩沖液重懸菌體。取50 μL 懸菌液加入10 μL 6×Protein loading buffer（北京全式金生物技術(shù)有限公司）混勻，沸水浴10 min，12000 r·min?1離心5 min。取10 μL 上清點(diǎn)樣至10% SDS-PAGE 膠，參照SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）制備，InstaBlue protein stain solution（APE BIO，美國）染色，凝膠成像 分析儀（BIO RAD，美國）觀察結(jié)果。

1.5 重組蛋白的可溶性檢測

確定JsMYB305 可成功誘導(dǎo)表達(dá)后，摸索誘導(dǎo)表達(dá)可溶性蛋白的條件。設(shè)置37 、28 ℃兩個(gè)誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后用2 mL PBS緩沖液重懸菌體，取50 μL 懸菌液加入10 μL 6×Protein loading buffer，剩余菌液使用冰浴超聲破碎2 min，12 000 r·min?1離心5 min，收集上清，沉淀用1.95 mL PBS 重懸，分別取50 μL 上清和沉淀加入10μL 6×Protein loading buffer。將以上樣品沸水浴10 min，12 000r·min?１離心5 min，取10 μL 上清點(diǎn)樣至10%SDS-PAGE膠，染色，觀察結(jié)果。

1.6 JsMYB305 重組蛋白的大量誘導(dǎo)及純化

取5 mL 過夜培養(yǎng)的菌液加入到500 mL 含有氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)至OD600 nm值約為0.5 后，加入IPTG 至終濃度為0.2 mmol·L?1，28 ℃誘導(dǎo)4 h 后收集全部菌體。使用15 mL Binding buffer（1×PBS，1% Triton x-100）重懸菌體，加入100 mmol·L?1PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟）至終濃度為1 mmol·L?1，冰浴超聲破碎10 min，功率50%，工作10 s，休息10 s。超聲結(jié)束后在4 ℃，12 000 r·min?1離心20 min。

JsMYB305 重 組 蛋 白 純 化：取5 mL proteinIso GST Resin（北京全式金生物技術(shù)有限公司）加入到層析柱，靜置；用5 mL Binding buffer（1×PBS，1% Triton x-100）平衡層析柱；加入離心后的上清，收集流出液；用5 mL Binding buffer（1×PBS，1% Triton x-100）洗滌層析柱，收集流出液；用Elute buffer（50 mmol·L?1Tris，5 mmol·L?1GSH）配 制 濃 度 分 別 為10、20、30 mmol·L?1的還原型谷胱甘肽（GSH）溶液用于洗脫目的蛋白。每個(gè)GSH 濃度洗脫體積為5 mL，收集洗脫液，用于SDS-PAGE 檢測。

1.7 Western Blot 檢測重組蛋白

將 純 化 后 的 重 組 蛋 白 取50 μL 加 入10 μL 6×Protein loading buffer，沸水浴10 min，12 000 r min?1

離心5 min，取10 μL 上清點(diǎn)樣至10%SDS-PAGE 膠，電泳結(jié)束將凝膠于Trans blot SD 半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO RAD，美國）轉(zhuǎn)移至NC 膜（Ge.Healthcare）上，5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，GST 單克隆抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）4 ℃孵育過夜，PBST（1×PBS，1‰ tween 20）洗膜30 min，HRP 標(biāo)記GST 抗體室溫孵育1 h，PBST（1×PBS，1‰ tween 20）洗膜30 min，于膜上滴加2 mL eECL 顯色液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），凝膠成像分析儀（BIOR AD，美國）觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T-1-JsMYB305 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以茉莉花cDNA 為模板，JsMYB305-F 和 JsMYB305-R 為引物，擴(kuò)增獲得約600 bp 的特異性條帶（圖1-A），經(jīng)測序顯示長度為588 bp，與JsMYB305 編碼序列相符?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行回收，結(jié)果顯示回收成功（圖1-B）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)載體上的測序引物鑒定，PCR 擴(kuò)增獲得約750 bp 的片段（圖1-C），測序結(jié)果顯示為746 bp，表 明pGEX-4T-1-JsMYB305 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 茉莉JsMYB305 基因編碼序列的擴(kuò)增、酶切回收及菌液PCR 鑒定Fig. 1 Amplification of JsMYB305 coding sequence, recovery of PCR product after enzyme digestion, and PCR identification of bacteria注：M 為DL2000 Marker ；A 為茉莉JsMYB305 基因編碼序列的擴(kuò)增，其中2 為JsMYB305 基因；B 為JsMYB305 基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切回收后的產(chǎn)物，其中5 為目的基因，1、3、4 為其他基因條帶；C 為重組載體pGEX-4T-1-JsMYB305 的菌液PCR 鑒定，1～5 為陽性條帶。Note: M: DL 2000 marker; A: amplification of JsMYB305 encoding sequence, 2: JsMYB305; B: amplification product of JsMYB305 after enzyme digestion and recovery; 5: JsMYB305; 1, 3, and 4: bands of other genes; C: identification of recombinant vector pGEX-4T-1-JsMYB305; 1-5: positive bands.

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測

將轉(zhuǎn)化了pGEX-4T-1-JsMYB305 的大腸桿菌于 37 ℃誘導(dǎo)4 h。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，誘導(dǎo)后的菌液在55 kDa 附近出現(xiàn)一條差異條帶，大小約為49 kDa（圖2-A），與預(yù)期的重組蛋白大小相符，表明JsMYB 305 能在大腸桿菌中成功表達(dá)。

分別于37 ℃和28 ℃誘導(dǎo)pGEX-4T-1-JsMYB305的表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)后所得的菌液超聲破碎后分別取上清和沉淀部分進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測，發(fā)現(xiàn)37 ℃誘導(dǎo)的重組蛋白主要存在于沉淀中（圖2-B），28 ℃誘導(dǎo)下，重組蛋白在上清中的含量比37 ℃更高（圖2-C），因此28 ℃誘導(dǎo)重組蛋白適合后續(xù)大量誘導(dǎo)和純化。

圖2 JsMYB305 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測Fig. 2 Inducible expression and soluble detection of JsMYB305 recombinant protein注：M：Protein ladder。A：JsMYB305 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白，2：0.2 mmol·L?1IPTG 誘導(dǎo)后的菌體蛋白。B：37 ℃誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2、3、4 分別為37 ℃ 0.2 mmol·L?1IPTG 誘導(dǎo)的菌體蛋白、上清、沉淀。C：28 ℃誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，5：未誘導(dǎo)的菌體蛋白，6、7、8 分別為28 ℃ 0.2 mmol·L?1IPTG 誘導(dǎo)的菌體蛋白、上清、沉淀。Note: M: protein ladder; A: induced expression of recombinant protein of JsMYB305; 1: uninduced bacterial protein; 2: bacterial protein induced by 0.2 mmol·L?1IPTG; B: recombinant protein expression induced at 37 ℃; 1: uninduced bacterial protein; 2, 3 and 4: bacterial protein, supernatant, and precipitate, respectively, induced by 0.2 mmol·L?1IPTG at 37 ℃; C: recombinant protein expression induced at 28 ℃; 5: uninduced bacterial protein; 6, 7,and 8: bacterial protein, supernatant, and precipitate, respectively, induced by 0.2 mmol·L?1IPTG at 28 ℃.

2.3 重組蛋白的純化及檢測

基于以上誘導(dǎo)溫度的選擇，在28 ℃對(duì)重組蛋白進(jìn)行大量的誘導(dǎo)，取上清進(jìn)行蛋白純化。上清中的蛋白經(jīng)過層析柱吸附后，依次使用10、20、30 mmol·L?1的GSH 進(jìn)行洗脫。不同濃度GSH 洗脫后的洗脫液SDS-PAGE 電泳分析顯示，蛋白上清的流出液和洗滌液中不含目的蛋白（圖3-A），表明目的蛋白與GST樹脂的結(jié)合性較好。在20 mmol·L?1的GSH 洗脫下，重組蛋白能被成功洗脫，條帶較為單一，表明重組蛋白成功純化。

圖3 重組蛋白的純化及Western Blot 檢測Fig. 3 Purification and western blot identification of recombinant protein注：M：protein ladder 。A：重組蛋白的純化 ，1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2：0.2 mmol·L?1IPTG 誘導(dǎo)后的菌體蛋白；3：超聲破碎后的菌體蛋白上清；4：流出液；5：洗滌液；6：10 mmol·L?1GSH 洗脫液；7：20 mmol·L?1GSH 洗脫液；8：30 mmol·L?1GSH 洗脫液；箭頭標(biāo)注的是純化的重組蛋白。B：純化蛋白的Western Blot 檢測，箭頭標(biāo)注的是JsMYB305 重組蛋白與GST 單克隆抗體雜交后的條帶。Note: M: 15-180 kDa protein ladder; A: purification of recombinant protein; 1: uninduced bacterial protein; 2: bacterial protein induced by 0.2 mmol·L?1IPTG; 3: supernatant of bacterial protein after ultrasonic crushing; 4: effluent; 5: washing liquid; 6: eluent of 10 mmol·L?1GSH; 7: eluent of 20 mmol·L?1GSH; 8: eluent of 30 mmol·L?1GSH; arrow points at purified recombinant protein; B: detection of purified protein by western blot; arrow points at band after hybridization of JsMYB305 recombinant protein with GST monoclonal antibody.

將純化后的JsMYB305 重組蛋白，采用GST 單克隆抗體進(jìn)行Western blotting 檢測，結(jié)果表明，純化后的重組JsMYB305 蛋白，與GST 單克隆抗體有雜交條帶，且條帶大小與實(shí)際相符合（圖3-B）。結(jié)果 說明純化后的重組蛋白為JsMYB305 重組蛋白。

3 討論

外源基因能否在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)受到多種因素影響，如目的基因本身特性、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間等[18?19]。溫度會(huì)顯著影響原核蛋白的表達(dá)，在高溫誘導(dǎo)時(shí)，大腸桿菌的生長速度較快，蛋白表達(dá)的速度會(huì)隨之增快，導(dǎo)致表達(dá)的蛋白不能正確折疊，易形成包涵體[20?21]。本研究中，相比37 ℃誘導(dǎo)溫度，28 ℃能誘導(dǎo)JsMYB305 蛋白更多地在上清中存在，與前人的研究結(jié)論一致。表達(dá)載體和表達(dá)菌株的選擇同樣對(duì)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)起十分重要的作用，如AtSTK 基因利用大腸桿菌Rosetta 菌和pET-32a 載體可以更好地表達(dá)出目的蛋白[22]。孫偉等[23]利用大腸桿菌Transetta（DE3）菌株表達(dá)ZmAGO18b 時(shí)發(fā)現(xiàn)，pET-28a 能夠誘導(dǎo)出目的蛋白的表達(dá)，而pGEX-6p 基本沒有檢測到目的蛋白。本研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，將JsMYB305 編碼序列構(gòu)建到pQE30 載體并在BL21 株系誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)基因無法成功誘導(dǎo)表達(dá)，換用pGEX-4T-1 表達(dá)載體后能成功誘導(dǎo)JsMYB305重組蛋白的表達(dá)和純化。這可能是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）與目的蛋白融合后，能提高目的蛋白的可溶性[24]，從而成功表達(dá)目的蛋白。

在研究蛋白質(zhì)的相互作用及篩選已知蛋白的未知互作蛋白方面，GST 標(biāo)簽有著廣泛的應(yīng)用。為驗(yàn)證兩個(gè)蛋白間是否具有相互作用，朱炳森[25]和王意程[26]將目的蛋白分別構(gòu)建到帶HIS 和GST 標(biāo)簽的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，利用pull down 試驗(yàn)驗(yàn)證兩個(gè)蛋白間的相互作用。趙杰等[27]和竇萬福等[28]分別利用 GST-pull down 技術(shù)聯(lián)合LC-MS/MS，鑒定出128 個(gè)與毛白楊天冬氨酸蛋白酶PtoAED3 和53個(gè)與柑橘抗?jié)儾∞D(zhuǎn)錄因子CsBZIP40 特異結(jié)合的互作蛋白。本研究中也選擇了GST 標(biāo)簽，為后續(xù)利用pull down 技術(shù)篩選JsMYB305 的互作蛋白提供基礎(chǔ)。

本研究首次將茉莉花中調(diào)控香氣的轉(zhuǎn)錄因子JsMYB305 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并能通過GST 柱層析純化獲得，可為后續(xù)利用凝膠阻滯（EMSA）試驗(yàn)分析JsMYB305 對(duì)TPS 基因啟動(dòng)子的作用，以及利用GST-pull down 聯(lián)合LC-MS/MS 及免疫共沉淀（coip）篩選JsMYB305 的互作蛋白奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為深入分析JsMYB305 蛋白功能，并基于此基因功能探索茉莉花香氣分子育種提供借鑒。