表面活性劑對陜北富油煤微生物降解的影響

蔡昕原，申文盛，馬 麗，劉向榮，吳 燕，趙順省，楊再文

(1.西安科技大學 化學與化工學院，陜西 西安 710054；2.自然資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點實驗室，陜西 西安 710021)

0 引 言

富油煤的焦油產(chǎn)率大于7%，主要賦存于中低階煤類中，是一種寶貴的煤基油氣資源[1-2]。目前主要采用傳統(tǒng)的熱轉化方式提取焦油和其他高附加值化學品，但熱轉化技術因設備復雜、能耗高、污染大等原因，未能在工業(yè)上大規(guī)模利用[3-5]。

FAKOUSSA和COHEN認為微生物能在煤上生長，并產(chǎn)生黑色液體，這意味著微生物可將煤由固相轉化為液相，分離并加工成精細化學品和液體燃料等[6-7]。煤的微生物轉化過程通常在常溫、常壓下進行，條件溫和、能耗低、設備簡單，被認為是煤炭綠色轉化的途徑之一[8-13]。但是，微生物對煤的降解率低限制了其在工業(yè)上的推廣[14-16]。影響煤降解率的因素有煤種、菌種、煤的預處理方法、降解方式、添加表面活性劑等，其中添加適合的表面活性劑是一種較為有效的方法[17]。YIN等利用表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)改善了菌種對煤的吸附，提高了撫順褐煤的微生物溶解度[18]。袁紅莉等發(fā)現(xiàn)斜臥青霉P6分泌的生物表面活性劑可以促進褐煤的液化[19]。POLMAN和STRANDBERG等研究表明，煤、表面活性劑與菌種的相互作用是微生物增溶的主要原因，表面活性劑不直接溶解煤[20-21]。筆者也進行了相關探索實驗，發(fā)現(xiàn)表面活性劑直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)均能提高神木褐煤的微生物降解率，其中Triton X-100的作用效果最好，使降解率提高到61.9%[22]。因此，深入研究表面活性劑在微生物降解煤過程中的促進作用，將會推動煤生物降解的工業(yè)化進程。

筆者利用金雀兒根瘤蒼白桿菌降解陜北富油煤，通過單因素試驗、正交試驗探究了加煤量、接種量、降解時間對微生物降解煤樣的影響，得到最佳降解工藝條件。選擇三種表面活性劑SDS，LAS和Triton X-100，研究添加表面活性劑后，金雀兒根瘤蒼白桿菌對陜北富油煤降解能力的變化規(guī)律和降解液相產(chǎn)物的組成。

1 實驗

1.1 煤樣

實驗所選的煤樣是陜北李家畔富油煤。將煤樣進行破碎、研磨、篩分，選取0.25～0.5 mm煤樣(原煤)。用硝酸對煤樣進行氧化預處理(氧化煤)[23]。煤樣經(jīng)硝酸預處理后，灰分含量較原煤減少，揮發(fā)分較原煤增加，氧含量明顯增加，硫含量減少(表1)，與文獻報道一致[24]，這有利于微生物對煤的降解。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of coal samples %

1.2 菌株與培養(yǎng)基

所用菌種為金雀兒根瘤蒼白桿菌對低階煤有較好的降解性[23]。菌種購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，編號為：23890，采用營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基進行菌種培育[15]。

1.3 工藝條件優(yōu)化實驗

1.3.1 微生物降解實驗

將20 mL液體培養(yǎng)基接入150 mL錐形瓶，加入煤樣，滅菌冷卻后接入菌種，于30 ℃，160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，中間不斷取樣將菌絲與煤樣分離，測定煤樣降解效果?？偱囵B(yǎng)時間為20 d，每個實驗做3組平行實驗。

1.3.2 降解效果評價和降解率計算

1)降解效果評價[25]。培養(yǎng)結束后，對黑色降解液離心，過濾，以去離子水為參比，利用紫外可見分光光度計測定黑色降解液在450 nm處的吸光度(A450)，通過A450的值來對微生物降解煤的效果進行評價，A450值越大，表明降解效果越好。

2)降解率計算。降解結束將煤樣與培養(yǎng)液和菌絲分離，80 ℃烘干測定未降解煤樣(剩煤)質量，然后計算降解率η，即

式中η為降解率，%；m1為起始加入的煤樣質量，g；m2為細菌作用后剩煤質量，g。

1.3.3 單因素試驗

在1.3.1實驗條件下，分別研究加煤量(0.3,0.5,0.7,0.9 g/50 mL)、接種量(5,10,15,20,25,30 mL)、降解時間(3,6,9,12,15,18 d)對煤樣降解效果的影響。

1.3.4 正交試驗

利用L9(3×3)正交設計表，對金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣的工藝條件進行正交設計。取加煤量、接種量和降解時間3個因素，各因素分為3個水平，各因素間的交互作用不作考慮(表2)。

表2 因素水平表Table 2 Factor levels

1.4 表面活性劑對微生物降解煤過程的影響

在單因素、正交試驗基礎上獲得微生物降解煤樣的最佳工藝，在同等實驗條件下，滅菌前加入50 mL濃度為0，100，200，300，400，500，600，700，800，900 mg/L的SDS液體，研究不同濃度SDS對降解率的影響。測定經(jīng)離心處理后的液相降解產(chǎn)物的A450值。采用同樣實驗方法研究LAS，Triton X-100對微生物降解煤樣的影響。

1.5 降解液相產(chǎn)物分析

依據(jù)1.4的實驗結果，確定出對金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤起最大促進作用的表面活性劑，通過離心分離得到在最優(yōu)表面活性劑添加下的降解液相產(chǎn)物，再利用3種不同極性的有機溶劑甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，最后采用安捷倫7890A/5975C型氣象色譜-質譜聯(lián)用儀進行液相產(chǎn)物的組成分析。

2 結果與討論

2.1 工藝條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗結果

加煤量、接種量和降解時間對降解液吸光度的影響分別如圖1、圖2和圖3所示。隨著加煤量增加，降解液的A450值先增加后降低，加煤量為0.5 g/50 mL時，A450值達到最大(圖1)。原因可能是加煤量小于0.5 g/50 mL，菌體生存環(huán)境好，能有效降解煤樣；而加煤量大于0.5 g/50 mL，細菌生長環(huán)境變差，生長繁殖受限，不能很好地以煤為碳源生長。

圖1 加煤量對降解液吸光度的影響Fig.1 Effects of coal amount on A450 of degradation liquids

隨著接種量的增大，A450值先增大后趨于穩(wěn)定(圖2)，接種量為15 mL/ 50 mL時，A450值達到最大，再增加接種量時，A450值變化甚微。這是因為煤樣表面是固定的，當接種量達到15 mL/ 50 mL時，煤樣與菌種接觸面達到飽和，新增加菌種不能與煤接觸，降解效果變化甚微。

圖2 接種量對降解液吸光度的影響Fig.2 Effects of inoculation size on A450 of degradation liquids

培養(yǎng)時間為15 d時，降解液A450值達到最大，15 d后波動較小(圖3)。原因可能是菌種生存依賴于培養(yǎng)基，降解時間超過15 d時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分耗盡，菌種停止代謝，煤樣不能繼續(xù)降解。

圖3 降解時間對降解液吸光度的影響Fig.3 Effects of degradation time on A450 of degradation liquids

2.1.2 正交試驗結果分析

金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣的3個影響因素A,B,C對應極差R分別為0.272,0.034,0.056，即A>C>B，可以得出加煤量(因素A)對降解效果影響最大，降解時間(因素C)次之，接種量(因素B)相對較小。此外，因素A所對應A450值的3個均值K1，K2，K3最大值為0.436，因素B為0.309，因素C為0.319，得出最佳工藝為A3B3C3。即加煤量為0.7 g/50 mL，接種量為20 mL/50 mL，降解時間為18 d(表3)，此時降解效果最好，降解率為17.1%。

表3 試驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of test results

2.2 表面活性劑對微生物降解煤的影響

隨著3種表面活性劑濃度的增大，SDS作用下降解液A450值變小，LAS作用下降解液A450值先增加后趨平，Triton X-100作用下降解液A450值與LAS作用趨勢類似(圖4)。表明SDS對金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣具有抑制作用，而LAS和Triton X-100具有促進作用。

圖4 3種表面活性劑濃度對降解液A450的影響Fig.4 Effects of concentrations of three surfactants on A450 of degradation liquids

在Triton X-100作用下降解液A450值大于同濃度LAS試驗組，Triton X-100加入濃度為800 mg/L時，降解液A450值達到最大值，微生物降解煤樣效果最好。Triton X-100加入后降解率為34.1%，比空白組增加了將近一倍(表4)。

表4 Triton X-100對降解率的影響Table 4 Effect of Triton X-100 on degradation rate

康紅麗等研究SDS，LAS和Triton X-100對金雀兒根瘤蒼白桿菌生長過程的影響(圖5)所示[22]。在不加表面活性劑時，金雀兒根瘤蒼白桿菌在第1天的生長速率最快，2 d時就達到了生長的最高峰，這意味者該細菌在2 d內的降解能力較強，尤其是第1天，細菌的活性和降解能力更強。當添加LAS和Triton X-100后，細菌的生長趨勢基本沒變，也就是說LAS和Triton X-100基本不影響細菌的生長。但是，添加SDS后，金雀兒根瘤蒼白桿菌在起始期的生長基本被抑制，2 d后才快速生長，錯過了其降解煤的最佳時間。這個實驗結果在一定程度上佐證了圖4的結論。

圖5 3種表面活性劑對金雀兒根瘤蒼白桿菌生長過程的影響Fig.5 Effects of three surfactants on the growth processes of ochrobactrum cytisi

2.3 表面活性劑作用下微生物降解煤樣液相產(chǎn)物分析

相對其他2種表面活性劑，TritonX-100對于對金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤的促進作用最大，并且當Triton X-100加入濃度為800 mg/L時，降解率最大(圖4、表4)，因此，選取此時的降解液相產(chǎn)物，分別用甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯進行萃取，萃取物主要組成見表5～表7。甲苯萃取液相產(chǎn)物檢測到24種化合物，相對分子量在134～422之間，組成為烷烴類物質(72.57%)，芳香化合物(14.99%)，羧酸類、酯類(12.44%)(表5)。二氯甲烷萃取液相產(chǎn)物共檢測出22種化合物，相對分子量在142～437之間，萃取物中主要含有烷烴類(93.10%)和酯類(5.76%)，其中8號(二十五烷)含量為18.34%，14號(正二十七烷)含量為11.29%，16號(二十二烷)含量為16.41%(表6)。由表7可知乙酸乙酯萃取液相產(chǎn)物共檢測到11種化合物，相對分子量在142～390之間，鄰苯二甲酸二丁酯的含量高達71.03%?？傊?，金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣的液相產(chǎn)物種類比較豐富，含有烷烴、羧酸類、酯類、芳香化合物，相對分子量在134～437之間。烷烴類物質是常用的工業(yè)燃料，二十二烷、二十五烷可制作潤滑劑和防腐劑，鄰苯二甲酸二丁酯可用于硝化纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯等的增塑劑。

表5 甲苯萃取物中液體產(chǎn)物的主要化合物Table 5 Main compounds of liquid products in the toluene extract

表6 二氯甲烷萃取物中液體產(chǎn)物的主要化合物Table 6 Main compounds of liquid products in the dichloromethane extract

表7 乙酸乙酯萃取物中液體產(chǎn)物的主要化合物Table 7 Main compounds of liquid products in the ethyl acetate extract

目前文獻報道表明SDS，LAS和Triton X-100都能降低微生物菌種和煤接觸時的界面張力，有利于菌種降解煤[18-22]。然而文中SDS對于金雀兒根瘤蒼白桿菌的起始生長期抑制作用較大，降解率表現(xiàn)出降低的現(xiàn)象。因此，表面活性劑對于煤的微生物降解的影響取決于表面活性劑對于煤和微生物界面張力的影響以及對于微生物生長的影響，是這兩方面綜合的結果。另外，表面活性劑雖然能夠促進煤和微生物的相互吸附，影響微生物的生長和分泌物的數(shù)量，對于煤的降解速率和產(chǎn)率影響較大，但不能改變煤的結構和微生物分泌物的組成，對于煤微生物降解產(chǎn)物的組成影響不大。

3 結 論

1)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣過程中加煤量對降解效果影響最大，降解時間次之，菌液用量影響最小。加煤量為0.7 g/50 mL，接種量20 mL/50 mL，降解時間為18 d，降解效果最好，降解率為17.1%。

2)SDS對金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣有抑制作用，LAS和Triton X-100有促進作用，Triton X-100增加效果最為明顯，降解率為34.1%。

3)金雀兒根瘤蒼白桿菌對煤樣的降解液相產(chǎn)物種類比較豐富，含有烷烴、羧酸類、酯類、芳香化合物，相對分子量在134～437之間。利用微生物降解富油煤制備精細化學品，是富油煤清潔高效利用的有效途徑之一。