四環(huán)素的生物降解研究

蘇敏，張悅

四環(huán)素的生物降解研究

蘇敏，張悅

（寧夏工業(yè)職業(yè)學(xué)院化學(xué)工程系，寧夏 銀川 750021）

目前，我國是四環(huán)素類抗生素的原產(chǎn)大國，也是使用、出口大國，但四環(huán)素類抗生素具有明顯的免疫毒性、致突變和胚胎毒性等巨大毒理效應(yīng)，對公共健康和社會環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅，四環(huán)素的降解是人們亟待解決的問題。以四環(huán)素為研究對象，枯草芽孢桿菌、無丙二酸檸檬桿菌為微生物菌種，在特定條件下對微生物進行了培養(yǎng)，同時利用微生物對四環(huán)素進行了生物降解，利用高效液相色譜法檢測其殘留量，得到四環(huán)素降解率。結(jié)果表明：無丙二酸檸檬桿菌對四環(huán)素類抗生素具有明顯降解效果，而枯草芽孢桿菌對其沒有降解效果，但微生物降解速度慢、時間長，不適合大規(guī)模的降解，不能滿足現(xiàn)代工藝的要求。

四環(huán)素；抗生素；生物降解；降解率

四環(huán)素類是抗生素中較為便宜的一類，低廉的價格使得四環(huán)素在發(fā)展中國家大受歡迎，不僅作為藥物廣泛用于人類和動物疾病的治療，同時也作為添加劑大量使用，用于提高飼料利用率，促進動物生長。在美國，四環(huán)素類抗生素在整個抗生素市場占據(jù)了15.8 %的市場份額。我國是四環(huán)素類抗生素的原產(chǎn)大國，同時也是其使用及出口大國，隨著四環(huán)素類抗生素的大量使用，因其較難被動物、植物吸收而排放到環(huán)境中造成蓄積，會導(dǎo)致較明顯的免疫毒性、致突變和胚胎毒性等巨大毒理效應(yīng)，對公共健康和社會環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅。目前，四環(huán)素類抗生素殘留的無害化處理成為人們亟待解決的問題。本研究主要以四環(huán)素為研究對象，對其進行了微生物降解，同時利用高效液相色譜法檢測其殘留量，旨在此類抗生素的無害化處理，減少環(huán)境污染以及對人類的危害，為生態(tài)環(huán)境中抗生素殘留的治理提供可借鑒的方法。

1 四環(huán)素的概述

四環(huán)素為一種有機化合物，廣譜抗菌素，分子式為C22H26N2O7，摩爾質(zhì)量430.45 g·mol-1，為黃色晶體或粉末，微溶于水和低級醇，溶于稀酸、稀堿和丙酮，在空氣中穩(wěn)定，但易吸收水分，受強日光照射變色。化學(xué)結(jié)構(gòu)含二甲氨基，故顯堿性；含酚羥基或烯醇基，故顯酸性，故為酸堿兩性化合物，在酸性或堿性均不穩(wěn)定，易失活。四環(huán)素分子上的酚羥基或烯醇基可與鈣離子、鋁離子生成黃色絡(luò)合物，與鐵離子形成紅色絡(luò)合物。四環(huán)素類抗生素主要包括金霉素、土霉素、四環(huán)素。四環(huán)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 四環(huán)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.1 四環(huán)素類抗生素的殘留

1.1.1 糞肥中四環(huán)素類抗生素殘留

在畜禽養(yǎng)殖中，四環(huán)素類抗生素是使用最多的抗生素，但使用后不能被完全吸收代謝，約有 30%～90%以母體化合物的形式隨尿或糞便排出殘留于有機糞肥中，并且在施用糞肥的土壤中長期保留，給環(huán)境帶來了潛在的風(fēng)險。

1.1.2 土壤中四環(huán)素類抗生素

畜禽糞便作為有機肥運用于土壤為土壤提供養(yǎng)肥是世界上通用做法，糞便中殘留的抗生素類物質(zhì)也隨畜禽糞便的利用進入土壤，四環(huán)素能被土壤吸附并在長期使用糞便的土壤中積累，四環(huán)素在土壤的降解隨時間的延長而變緩。

1.1.3 水體中四環(huán)素類抗生素殘留

20多年前，WATTES第一個報道了地表水中存在抗生素殘留物。劉虹[1]研究了貴陽市城市污水、河流及養(yǎng)魚水域中四環(huán)素的殘留特征，在研究水體中均可檢測到四環(huán)素的存在，其中排污口水中的質(zhì)量濃度達到10 μg·L-1。每年至少有50% 的抗生素是用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[2]，它們不能被動物吸收，有部分以原物或代謝物的形式隨糞便和尿液排入環(huán)境中，對人類的健康和生存造成不利的影響。

1.2 抗生素的降解途徑

抗生素的降解是指抗生素通過生物或非生物的方法使其從大分子化合物轉(zhuǎn)化成小分子化合物并最終轉(zhuǎn)化成水和二氧化碳。進入環(huán)境中的抗生素會產(chǎn)生一系列代謝及代謝產(chǎn)物，而產(chǎn)物往往具有更大的毒性[3]。

1.2.1 抗生素的非生物降解

1）光降解。光降解原理是分子吸收光能變成激發(fā)態(tài)從而引起反應(yīng)[4]，抗生素分子可直接吸收光子進行化學(xué)反應(yīng)，或光敏劑吸收光能后把能量傳遞給抗生素分子進行光化學(xué)反應(yīng)，光敏劑可加速抗生素在環(huán)境中的降解。研究發(fā)現(xiàn)，在可見光照射下，四環(huán)素類抗生素通過基態(tài)電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生陰離子自由基，并且進一步產(chǎn)生超氧陰離子自由基[5]。

2）水解。四環(huán)素類抗生素的水解受到pH、離子強度、溫度等條件的影響。LOFTIN等研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素在不同溫度和pH條件下降解速率差異顯著，離子強度對其降解無影響。

3）氧化降解。研究人員對四環(huán)素水溶液進行臭氧處理，得到15種產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，20 mg·L-1的四環(huán)素經(jīng)5 min臭氧處理可完全降解[6]。

1.2.2 抗生素的生物降解

四環(huán)素的生物降解是在微生物的作用下，四環(huán)素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，從大分子化合物降解為小分子化合物，最終變?yōu)镠2O和CO2。光合菌、酵母菌、芽孢桿菌、枯草桿菌、硝化細菌等都具有降解功能。

四環(huán)素在不同的環(huán)境中因條件不同而發(fā)生一系列非生物或生物降解反應(yīng)，研究其在不同介質(zhì)中的降解方式、機理、影響因素，對于探究四環(huán)素環(huán)境污染、減少殘留具有重要的意義。

1.3 四環(huán)素類抗生素的毒性

1.3.1 四環(huán)素類抗生素對植物生長的影響

四環(huán)素的殘留物對植物種子的萌發(fā)和根、莖生長的影響是直觀的生態(tài)毒理效應(yīng)指標(biāo)。四環(huán)素對小麥根伸長有抑制效應(yīng)，對芽伸長有促進作用[7]。

1.3.2 四環(huán)素類抗生素對生物體的影響

長時間食用四環(huán)素類抗生素會引起動物消化機能失常，同時損壞肝臟。含四環(huán)素殘留物的污水進入土壤和水中，會通過食物鏈污染肉品，造成對人體危害。

2 實驗方法和步驟

2.1 四環(huán)素生物降解

2.1.1 降解菌

枯草芽胞桿菌是一種嗜溫性、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，對真菌、細菌、病菌等具有較強抑制作用[8]，對纖維素、半纖維素具有較高的降解能力[9]。同時，其具有對低相對分子質(zhì)量木質(zhì)素酚型、非酚型類物質(zhì)的降解能力。它能消耗水體中的有機質(zhì)，將其分解為小分子有機酸、氨基酸及氨，改善水質(zhì)。

無丙二酸檸檬桿菌為革蘭陰性無芽孢短小桿菌，主要生化特性為西蒙氏檸檬酸鹽、精氨酸、鳥氨酸、纖維二糖、醋酸鈉。其可以產(chǎn)生的胞內(nèi)酶，對泰樂菌素具有較強的降解作用。

2.1.2 培養(yǎng)基

枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)基（CM）：牛肉膏0.3 g、蛋白胨0.5 g、氯化鈉0.5 g、水合硫酸錳微量。

無丙二酸檸檬桿菌的培養(yǎng)基（YPD）：酵母浸膏1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖1 g。

2.2 實驗方法

2.2.1 培養(yǎng)基的配制

在錐形瓶中配制兩種菌類的培養(yǎng)液，并對培養(yǎng)液進行滅菌35 min。

2.2.2 菌株的培養(yǎng)

種子液的制備：將活化的菌種接于液體培養(yǎng)基，置搖床中，35 ℃振蕩培養(yǎng)75 h，轉(zhuǎn)速125 r·min-1。

搖床培養(yǎng)：分別取10%種子液接于液體培養(yǎng)基CM、YPD中，振蕩培養(yǎng)72 h。

2.2.3 涂板

1）制備兩種菌類的固體培養(yǎng)液；

2）將固體培養(yǎng)液到入玻璃培養(yǎng)皿中，冷卻使其凝固，取100 μL菌液進行涂板；

3）分別將50 mg·L-1的四環(huán)素、土霉素加入到培養(yǎng)基CM、YPD中，振蕩培養(yǎng)。

2.3 儀器設(shè)備

實驗所用儀器設(shè)備如表1所示。

表1 儀器設(shè)備

2.4 菌類培養(yǎng)物質(zhì)

2.4.1 碳源

牛肉膏是用牛肉制成的一種棕黃色或棕褐色的膏狀物，具有牛肉氣味，易溶于水，水溶液呈淡黃色，廣泛用于細菌培養(yǎng)基中，為微生物提供碳源、磷酸鹽和維生素。

葡萄糖，無色晶體，微甜，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，化學(xué)式C6H12O6，是一種單糖、多羥基醛。其為微生物提供碳源，是生物的主要供能物質(zhì)。

2.4.2 氮源

蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的，外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香氣味。蛋白胨富含有機氮化合物，是微生物培養(yǎng)基的主要原料，能為微生物提供碳源、氮源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)。

酵母浸膏從面包酵母浸膏、啤酒酵母和假絲酵母乳液精制而成的一種棕黃色的膏狀物，酵母浸膏富含蛋白質(zhì)、氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元等，是生物培養(yǎng)基和發(fā)酵中的主要原料。

2.4.3 無機鹽

氯化鈉呈白色晶體狀，主要來源于海水，易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨，不溶于濃鹽酸。其具有潮解性，穩(wěn)定性比較好，為微生物培養(yǎng)提供無機鹽。

3 結(jié)果與討論

3.1 降解色譜測定結(jié)果

對180 mg·L-1四環(huán)素進行降解色譜測定，結(jié)果如表2所示。

表2 對四環(huán)素降解色譜測定

3.2 生物降解率

生物降解率計算公式（1）如下：

=（0-t）/0。 （1）

式中：—四環(huán)素的降解率；

0—四環(huán)素的初始濃度；

t—降解后四環(huán)素的殘留量。

無丙二酸檸檬桿菌和枯草芽孢桿菌對土霉素降解率如表3所示。

表3 對土霉素降解率表

3.3 實驗討論

通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，無丙二酸檸檬桿菌對四環(huán)素的降解效果不是很顯著，主要原因在于菌株的培養(yǎng)，不僅與菌體種類有密切關(guān)系，還與之后對菌株進行的復(fù)壯培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)有關(guān)，菌類生長對培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，操作不當(dāng)可能會引入雜菌。同時，菌類對抗生素的降解與培養(yǎng)基中營養(yǎng)條件的配比有密切關(guān)系，營養(yǎng)過盛，菌類便減少對抗生素的降解；營養(yǎng)不足，菌類無法維持自身的生長代謝，便培養(yǎng)不出菌株。本次實驗是初步探究枯草芽孢桿菌、無丙二酸檸檬桿菌是否能對四環(huán)素類抗生素進行降解，僅對其降解效果進行初步檢測分析并進行探討，發(fā)現(xiàn)無丙二酸檸檬桿菌對四環(huán)素類抗生素具有降解效果，而枯草芽孢桿菌對其沒有降解效果。

4 結(jié) 論

抗生素對環(huán)境的耐藥性的選擇和誘導(dǎo)可能是造成人類、環(huán)境危害的最重要部分，因此對抗生素降解研究是人們研究的重點，微生物既是主要的分解者，又是一些物質(zhì)的生產(chǎn)者。菌類微生物通過吸附或氧化代謝來降解抗生素，來維持自身的生長。菌類微生物能對抗生素進行相應(yīng)的降解[10]，具有運行成本低、易管理的特點，但菌類微生物降解速度慢、時間長，相比較而言，不適合大規(guī)模的降解，不能夠滿足現(xiàn)代工藝的要求，因此應(yīng)對這方面的研究給予足夠的重視。

[1] 劉虹．貴州城市污水、河流及養(yǎng)魚水域抗生素的地球化學(xué)行為[D]．廣州：中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，2008．

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[6] 俞道進，曾振靈，陳杖榴.四環(huán)素類抗生素殘留對水生態(tài)環(huán)境影響的研究進展[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2004，24（5）：515-517．

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Study on Bio-degradation of Tetracycline

（Department of Chemical Engineering, Ningxia Vocational and Technical College, Yingchuan Ningxia 750021, China）

At present, China produces, uses and exports large amount of tetracycline antibiotics. But they threaten public health and social environment seriously because of their severe toxicological effects, such as immunotoxicity, mutagenesisi, embryo-toxicity and so on. Therefore, the bio-degradation of tetracycline should be solved immediately. Tetracycline is a kind of organic compounds, and has the quality of stability. In this paper, taking tetracycline as research target, some experiments to culture microbe with bacillus subtilis and citrobacter amalonaticus under certain conditions were carried out. Meanwhile the microorganism was used to biodegrade tetracycline. At last, the degradation rate of tetracycline was got through HPLC. The results showed that citrobacter amalonaticus had obvious degradation effect, while bacillus subtilis had no degradation effect; The microbial degradation process can’t meet the requirements of modern technology due to its slow degradation rate.

Tetracycline; Antibiotic; Bio-degradation; Degradation rate

X172

A

1004-0935（2022）04-0453-04

2019寧夏回族自治區(qū)高職教育教學(xué)質(zhì)量工程項目資助。

2021-09-28

蘇敏(1983-)，女，寧夏回族自治區(qū)銀川市人，講師，碩士， 2007年畢業(yè)于寧夏大學(xué)化學(xué)教育專業(yè)，研究方向：基礎(chǔ)化學(xué)。