Circ_0000502 靶向調(diào)節(jié)miR-1231 促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌HSC-3 細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的體外研究

馬素偉， 張 娟， 楊 晉， 靳 昊， 王 焱， 高 杰

（保定市第二中心醫(yī)院，河北 保定 072750）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占頭頸部惡性腫瘤的20%。 近年來(lái)，手術(shù)、放療、化療等治療策略取得一定進(jìn)展，但OSCC的高侵襲性、轉(zhuǎn)移性、復(fù)發(fā)性影響了治療效果[1]。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，OSCC 患者5 年生存率僅為50%，其中腫瘤細(xì)胞的異常增殖和凋亡是OSCC 患者預(yù)后不良的主要原因[2]。然而，OSCC 進(jìn)展的潛在機(jī)制并不十分清楚。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一大類內(nèi)源性以共價(jià)閉合環(huán)為特征的RNA，在包括人類在內(nèi)的多個(gè)物種中普遍表達(dá)。研究顯示，circRNA 作為分子海綿與微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用，或者作為RNA 結(jié)合蛋白等多種機(jī)制參與調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、翻譯，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用[3]。 研究表明，骨肉瘤中circ_0000502 表達(dá)增加具有顯著的促增殖、遷移侵襲和抗凋亡作用[4]。 在肝癌中，抑制circ_0000502 表達(dá)能顯著降低肝癌細(xì)胞的惡性增殖、遷移和侵襲能力，具有癌癥治療靶點(diǎn)的潛力[5]。miR-1231 是一種膠質(zhì)瘤、前列腺癌抑癌基因，其表達(dá)減少或缺失在膠質(zhì)瘤、前列腺癌的惡性進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[6-7]。 序列分析發(fā)現(xiàn)，circ_0000502 與miR-1231 存 在 潛 在 相 互 作 用。 但circ_0000502、miR-1231 在OSCC 進(jìn)展中的作用，circ_0000502 是否靶向miR-1231 參與OSCC 進(jìn)展尚未有研究。本研究重點(diǎn)分析了circ_0000502、miR-1231 表達(dá)對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖、凋亡以及增殖相關(guān)蛋白Ki67、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax 表達(dá)的影響， 明確了circ_0000502對(duì)miR-1231 的調(diào)控作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織樣本 選取2016 年2 月—2018 年2 月于我院進(jìn)行手術(shù)的43 對(duì)OSCC 組織和配對(duì)癌旁組織 （鄰近正常組織）。 所有患者術(shù)前均未接受放化療。 該研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：201600032），并獲得所有患者的書面知情同意。

1.1.2 細(xì)胞和主要試劑 人OSCC 細(xì)胞HSC-3（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 中國(guó)）；Bulge-Loop miRNA RT-qPCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶（廣州銳博生物公司，中國(guó)）；Prime Script RT Reagent 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ（大連TaKaRa 公司，中國(guó)）；小干擾RNA（si-RNA）、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-RNA）、miRNA 模擬物（mimics）、miRNA 抑制物（anti-miRNA）、雙熒光素酶報(bào)告載體（上海生工公司，中國(guó)）；膜聯(lián)蛋白（Annexin V）-異 硫 氰 酸 熒 光 素 （fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物，中國(guó)）； MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、兔抗Ki-67 抗體、兔抗B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcl）-2 抗體、兔抗Bcl 相關(guān)X 蛋白（Bcl associated X protein，Bax）抗體、GAPDH 抗體、羊抗兔IgG 二抗（上海艾博抗生物公司，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) (RT-qPCR) 分析circ_0000502 和miR-1231 的表達(dá) 使用TRIzol 試劑從OSCC 組織和配對(duì)的癌旁組織中分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA 后， 利用Bulge-Loop miRNA RT-qPCR 試劑盒分析 miR-1231 表達(dá)水平。circ_0000502 檢 測(cè) 采 用Prime Script RT Reagent 試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ進(jìn)行。 2-ΔΔCt法分析circ_0000502 和 miR-1231 的相對(duì)表達(dá)量。circ_0000502 上游引物5′-ACAAUAUCAAAAGAGGAAAG-3′， 下游引物5′-AAAGGAAGUGGGUAGGAGGAAAG-3′ ； 內(nèi) 參GAPDH 上 游 引 物 5′ -CGCTCTCTGCTC CTCCTGTTC-3′， 下 游 引 物5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′；miR-1231 上 游引物5′-G CCAGTGTCTGGGCGGAC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′； 內(nèi)參U6 上游引物5′-ATGGCTATAAATAGATACACGC-3′， 下游引物5′-GGTACAAACAGGGAGGGA-3′。

1.2.2 轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 HSC-3 細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)， 細(xì)胞80%融合時(shí)胰酶消化后按照1∶3 的比例接種新的培養(yǎng)瓶， 換液頻率為每周3 次。 將第3 代對(duì)數(shù)期HSC-3 細(xì)胞接種到6 孔板中，利用Lipofectamine 2000 將si-NC、si-circ_0000502、miR-NC、miR-1231 mimics、si-circ_0000502+anti-miR-NC、si-circ_0000502+anti-miR-1231 mimics 分別轉(zhuǎn)染50%融合的HSC-3 細(xì)胞，依次命名為si-NC 組、si-circ_0000502 組、miR-NC 組、miR-1231 組、si-circ_0000502+anti-miR-NC 組、sicirc_0000502+anti-miR-1231 組。 無(wú)血清培養(yǎng)液孵育6 h 后更換為新鮮完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)染48 h 時(shí)收獲細(xì)胞測(cè)定轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT 實(shí) 驗(yàn) 檢 測(cè) 增 殖 將 各 組HSC-3 細(xì) 胞（1×104個(gè)/孔） 接種于96 孔板中， 培養(yǎng)48 h 后取20 μL 的MTT 試劑添加到每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在振蕩器上短暫振蕩后， 用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處各孔吸光度值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組HSC-3細(xì)胞，按照1×107個(gè)/mL 的濃度重懸于Annexin V 結(jié)合緩沖液中。 向100 μL 細(xì)胞懸液中加入5 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的PI 染色。 室溫避光孵育15 min 后，將細(xì)胞懸液與400 μL Annexin V 結(jié)合緩沖液混合。 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)分析Ki-67、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá) 用RIPA 緩沖液從各組細(xì)胞中提取總蛋白， 并用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測(cè)定試劑盒濃度。 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離30 μg 蛋白樣品， 然后進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜。1%牛血清白蛋白緩沖液封閉膜后，用一抗4 ℃下孵育過(guò)夜，再與二抗偶聯(lián)物溫室溫下孵育1 h。 顯影定影后， 用Quantum One 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH 灰度值比值表示對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 利用Lipofectamine 2000 將含有miR-31 靶向位點(diǎn)的野生型（wild type，WT）circ_0000502 報(bào)告載體 （WT-circ_0000502）或miR-31 靶向位點(diǎn)突變的突變型（mutant type，MUT）circ_0000502 報(bào) 告 載 體（MUT-circ_0000502），分 別與miR-1231 mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染HSC-3 細(xì)胞。收獲轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞，采用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告試劑盒檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，每次設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 采用t 檢驗(yàn)比較2 組間差異， 采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Circ_0000502 和miR-1231 在OSCC 組織中的表達(dá)

Circ_0000502 在OSCC 組織中的相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織高（P<0.05），而miR-1231 在OSCC 組織中的相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織低（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。癌旁組織和OSCC 組織病理圖片見(jiàn)圖1。

表1 Circ_0000502 和miR-1231 在OSCC 組織中的相對(duì)表達(dá)量Table 1 The relative expression levels of circ_0000502 and miR-1231 in OSCC tissues

圖1 癌旁組織和OSCC 組織病理圖片(×100)Figure 1 Histopathological features of OSCC and OSCC adjacent tissues (×100)

2.2 抑制circ_0000502 表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖的影響

與si-NC 組 比 較，si-circ_0000502 組HSC-3 細(xì)胞circ_0000502 表達(dá)量降低， 細(xì)胞活力和Ki-67 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）。 見(jiàn)表2 和圖2。

表2 抑制circ_0000502 表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of inhibiting circ_0000502 on the proliferation of HSC-3 cells

圖2 Ki-67 蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of Ki-67 protein

2.3 抑制circ_0000502 表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞凋亡的影響

與si-NC 組 比 較，si-circ_0000502 組HSC-3 細(xì)胞Bax 蛋白表達(dá)量、凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）。 詳見(jiàn)表3 和圖3。

圖3 抑制circ_0000502 表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of circ_0000502 inhibition on the apoptosis of HSC-3 cells

表3 抑制circ_0000502 表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞凋亡的影響Table 3 Effect of inhibiting circ_0000502 on the apoptosis of HSC-3 cells

2.4 Circ_0000502 靶向調(diào)控miR-1231 的表達(dá)

Circular RNA interactome 在線分析顯示，circ_0000502 與miR-1231 之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。 miR-1231 mimics 和WT-circ_0000502 共轉(zhuǎn)染與miR-NC 和WT-circ_0000502 共轉(zhuǎn)染比較，細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性降低 （P<0.05）； 而miR-1231 mimics 和MUT-circ_0000502 共轉(zhuǎn)染與miR-NC 和MUT-circ_0000502 共轉(zhuǎn)染比較，細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著變化， 見(jiàn)表4。 pcDNA-circ_0000502 組HSC-3 細(xì)胞中miR-1231 的表達(dá)較pcDNA 組顯著降低（P<0.05），而si-circ_0000502 組HSC-3 細(xì) 胞 中miR-1231 的表達(dá)較si-NC 組升高（P<0.05），見(jiàn)表5。

圖4 Circ_0000502 的序列中含有與miR-1231 互補(bǔ)的核苷酸序列Figure 4 The sequence of circ_0000502 contains a nucleotide sequence complementary to miR-1231

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Table 4 Double luciferase reporter assay

表5 Circ_0000502 調(diào)控miR-1231 的表達(dá)Table 5 Circ_0000502 regulates the expression of miR-1231

2.5 miR-1231 過(guò)表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-NC 組比較，miR-1231 組HSC-3 細(xì)胞miR-1231 表達(dá)量、Bax 蛋白表達(dá)量、 細(xì)胞凋亡率升高， 細(xì)胞活力、Ki-67 蛋白表達(dá)量和Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）。 詳見(jiàn)表6 和圖5。

圖5 miR-1231 過(guò)表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Figure 5 Effects of overexpressing miR-1231 on proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

表6 miR-1231 過(guò)表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Table 6 Effects of overexpressing miR-1231 on proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

2.6 抑制miR-1231 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0000502表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖和凋亡的作用

與si-circ_0000502+anti-miR-NC 組 比 較，sicirc_0000502+anti-miR-1231 組HSC-3 細(xì) 胞miR-1231 表達(dá)量、Bax 蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞活力、Ki-67 蛋白表達(dá)量和Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（P<0.05）。 詳見(jiàn)表7 和圖6。

圖6 抑制miR-1231 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0000502 表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖和凋亡的作用Figure 6 Inhibiting the expression of miR-1231 reversed the effect of inhibiting circ_0000502 on the proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

表7 抑制miR-1231 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0000502 表達(dá)對(duì)HSC-3 細(xì)胞增殖和凋亡的作用Table 7 Inhibiting the expression of miR-1231 reversed the effect of inhibiting circ_0000502 on the proliferation and apoptosis of HSC-3 cells

3 討論

OSCC 發(fā)生、 發(fā)展是由遺傳和表觀遺傳變化累積驅(qū)動(dòng)的多步驟過(guò)程。 在這些風(fēng)險(xiǎn)因素中，多種circRNA 已被廣泛研究且被確定為OSCC 的致癌或抑癌基因。 例如，Ouyang 等[8]報(bào)道，circ_0109291高表達(dá)促進(jìn)了OSCC 細(xì)胞增殖和遷移，circ_0109291表達(dá)水平越高，OSCC 患者預(yù)后越差。 Peng 等[9]證實(shí)circRNA_0000140 通過(guò)靶向miR-31 抑制Hippo信號(hào)通路和OSCC 的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。 因此，闡明circRNA 在OSCC 進(jìn)展中的作用可為OSCC 患者提供有價(jià)值的治療靶標(biāo)。 本研究結(jié)果顯示，circ_0000502在OSCC 組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。 為進(jìn)一步闡明circ_0000502 在OSCC 組織中的生物學(xué)功能，我們發(fā)現(xiàn)，抑制circ_0000502 表達(dá)顯著抑制了OSCC 細(xì)胞HSC-3 的活力， 而增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡。Ki-67 作為核蛋白，與腫瘤增殖呈正相關(guān)關(guān)系，研究指出，OSCC 組織中Ki-67 的表達(dá)高于其在肺腫瘤組織中， 且隨著口腔黏膜組織的異常增生而增加，與OSCC 患者總生存期、無(wú)轉(zhuǎn)移生存期、無(wú)復(fù)發(fā)生存期呈負(fù)相關(guān)，是OSCC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素[10-11]。 Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)的線粒體途徑是誘導(dǎo)凋亡的重要信號(hào)通路，Bcl-2 是強(qiáng)抗凋亡蛋白，Bax 是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑，Bax 存在線粒體外膜，其通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放觸發(fā)一系列caspase 活化來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。 本研究中，抑制circ_0000502 表達(dá)顯著降低了Ki-67 和Bcl-2 水 平， 升 高 了Bax 水 平， 與 抑 制circ_0000502 表達(dá)的抗增殖、促凋亡作用一致。以上研究表明，circ_0000502 在OSCC 中具有致癌作用。

miRNA 海綿作用是circRNA 最廣泛研究的功能之一。研究顯示，circ_100290 通過(guò)與miR-378a 結(jié)合降低了miR-378a 對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）的抑制作用，從而促進(jìn)了OSCC細(xì)胞中的糖酵解和增殖[13]。Circ_0001971 通過(guò)靶向miR-194/miR-204 在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)OSCC 的進(jìn)展和化療敏感性[14]。 本研究發(fā)現(xiàn)，circ_0000502 存在miR-1231 的結(jié)合位點(diǎn)。miR-1231 是癌癥中變化最頻繁的miRNA 之一，在膠質(zhì)瘤[15]、甲狀腺乳頭狀癌[16]等一系列腫瘤類型中檢測(cè)到miR-1231 表達(dá)降低。Circ_0025033 通過(guò)抑制miR-1231 增強(qiáng)了甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制細(xì)胞的凋亡[16]。此外，circ-DCAF6 通過(guò)降低miR-1231 水平促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[17]。 本研究顯示，OSCC 組織中miR-1231 表達(dá)降低， 體外實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-1231 能顯著降低HSC-3 細(xì)胞活力，提高細(xì)胞凋亡率，抑制Ki-67 和Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，circ_0000502 與miR-1231直接結(jié)合，且負(fù)向調(diào)控miR-1231 表達(dá)。 此外，抑制miR-1231 表達(dá)還可抵消circ_0000502 抑制對(duì)HSC-3 細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，并相應(yīng)改變Ki-67、Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)水平。 以上研究證實(shí)，circ_0000502/miR-1231 分子軸參與調(diào)控OSCC 細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而在OSCC 進(jìn)展中具有重要作用。 然而，本研究仍存在不足之處，如circ_0000502下游是否存在其他miRNA、miR-1231 的下游靶基因，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，circ_0000502 在OSCC 中呈高表達(dá)，miR-1231 呈低表達(dá)。抑制circ_0000502 通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-1231 可抑制OSCC 細(xì)胞HSC-3 增殖并誘導(dǎo)其凋亡。這基本揭示了circ_0000502/miR-1231 分子軸在OSCC 進(jìn)展中的作用， 提示circ_0000502 和miR-1231 是OSCC 的潛在靶點(diǎn)， 靶向抑制circ_0000502/miR-1231 分子軸可能是遏制OSCC 進(jìn)展的重要策略。