CD4+T 細(xì)胞糖酵解在舍格倫綜合征中的表達(dá)及作用

傅稼耀， 朱晗懿， 李 輝， 石 歡， 王保利， 鄭凌艷

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，口腔醫(yī)學(xué)院口腔外科，國家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，口腔醫(yī)學(xué)院，上海 200125）

舍格倫綜合征（Sj?gren’s syndrome, SS）又稱干燥綜合征，是一種口腔頜面部常見的慢性自身免疫性疾病，其特征為外分泌腺和其他組織免疫系統(tǒng)的自動激活，導(dǎo)致外分泌腺腺體受損，表現(xiàn)為口干和眼干[1-2]。 該疾病可能僅在外分泌腺中發(fā)生，或與其他自身免疫疾病一起發(fā)生， 例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）等。SS 的發(fā)病率為一般人群的0.5%~1.0%，在所有自身免疫性疾病中發(fā)病率相對較高[3]。 SS 患者中，有1/3 患有多種全身性并發(fā)癥，包括腎、肺或神經(jīng)功能障礙。 此外，在SS 的晚期，長期異常的免疫激活可能會導(dǎo)致非霍奇金淋巴瘤，這是SS 最嚴(yán)重的并發(fā)癥[4]。

與其他經(jīng)典自身免疫性疾病類似，CD4+T 細(xì)胞長期以來，一直被認(rèn)為是主要的淋巴細(xì)胞群，其促進(jìn)了在SS 中能觀察到的早期的免疫病理病變[1-2,5]。除了在病變的唾液腺中浸潤外，SS 患者的外周血樣本還顯示出CD4+T 細(xì)胞的比例增加。 與正常的外周血淋巴淋巴細(xì)胞相比，病變唾液腺組織和外周血中的CD4+T 細(xì)胞表現(xiàn)出過度活化的表型[5]。這些活化的CD4+T 細(xì)胞具有重要作用，例如調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能、幫助B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體及協(xié)調(diào)針對病原微生物的免疫反應(yīng)[6-7]。 一般情況下，當(dāng)CD4+T 細(xì)胞受到外界刺激激活后，會根據(jù)周圍不同細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素-2 （interlukin-2, IL-2） 和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β（TGF-β）等]的濃度，選擇性地進(jìn)入Th1、Th2、Th17、Treg 和Tfh 等細(xì)胞亞型， 這些亞型分別起著免疫促進(jìn)（如Th1、Th17 等細(xì)胞亞型）和免疫抑制（如Treg 細(xì)胞亞型）的作用[4,6]。 顯然，當(dāng)自身免疫疾病發(fā)生時，這些亞型的比例和功能均出現(xiàn)了顯著改變。 在SS 患者和SS 樣小鼠受損的唾液腺組織中顯示Th1/Th2 平衡被破壞，出現(xiàn)大量Th17和Tfh。這些CD4+T 細(xì)胞亞群分泌的主要細(xì)胞因子，特別是干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）及其他與T 細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子，包括IL-2，與疾病中淋巴細(xì)胞浸潤的發(fā)展有關(guān)[8]。 主導(dǎo)或參與CD4+T細(xì)胞過度活化并導(dǎo)致SS 發(fā)病的分子機制， 一直是一個有爭議的話題。

CD4+T 細(xì)胞的增殖與活化需要糖酵解參與其中， 糖酵解是后續(xù)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘眨╝denosine triphosphate, ATP）的重要步驟。 異常的糖酵解會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，在例如SLE 和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）等經(jīng)典自身免疫性疾病中，已觀察到CD4+T 細(xì)胞中糖酵解水平的上調(diào)。 目前也已有一期臨床前研究證明，糖酵解抑制劑二甲雙胍（metformin）和2-脫氧葡萄糖（2-DG）可以治療自身免疫性紅斑狼瘡[9]。 目前沒有關(guān)于糖酵解是否影響SS 的報道。 本研究探討了糖代謝與SS 疾病發(fā)展的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 動物和組織學(xué)測量

本研究挑選了會自發(fā)性產(chǎn)生SS 樣病變浸潤的NOD/ShiLtj（以下稱為NOD/Ltj）小鼠作為體內(nèi)SS 模型， 這類模型鼠在下頜下腺中會產(chǎn)生淋巴細(xì)胞浸潤，并在8 周齡時出現(xiàn)唾液分泌SS 癥狀。 對照組小鼠選用同源的野生型ICR 小鼠。 雌性NOD/Lti 小鼠和野生型ICR 小鼠購自南京大學(xué)模型動物研究中心，小鼠飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境。 研究選用糖酵解抑制劑2-DG（Sigma-Aldrich 公司，美國），以飲水喂養(yǎng)（5 mg/mL 2-DG）的方式對各組小鼠進(jìn)行治療。 在小鼠8 周齡時對其進(jìn)行治療，在治療2 周和6 周后分別進(jìn)行觀察，并實施安樂死后提取其唾液腺組織。

組織被固定、包埋在石蠟中，用于HE 染色。 使用1968 年Chisholm 和Mason 提出的唾液腺浸潤評分系統(tǒng)來評估腺體組織病變的嚴(yán)重程度[10-11]，即一個淋巴病灶被定義為隨機4 mm2含50 個淋巴細(xì)胞。 簡單來說，評分系統(tǒng)：0 為無淋巴細(xì)胞浸潤，1 為單個視野下少于10 個淋巴細(xì)胞的輕度淋巴細(xì)胞浸潤，2 為中度淋巴細(xì)胞浸潤但淋巴細(xì)胞少于50 個，3 為一個淋巴細(xì)胞灶，4 為2 個及以上淋巴細(xì)胞灶。 在實驗和常規(guī)喂養(yǎng)過程中，動物按照美國國立衛(wèi)生研究院出版的 《實驗室動物護理和使用指南》中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行人道關(guān)懷[12]。 本動物學(xué)研究已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：SH9H-2021-TK69-1）。

1.2 刺激性唾液流率檢測

各組小鼠腹腔注射2.4%戊巴比妥鈉（5 mL/kg,Sigma-Aldrich 公司，美國）進(jìn)行麻醉。 麻醉后根據(jù)小鼠體質(zhì)量注射相應(yīng)劑量的普魯卡品 （0.125 mg/kg,Sigma-Aldrich 公司，美國）。 5 min 后，用干棉球收集小鼠唾液10 min，以含唾液棉球的整體質(zhì)量減去干棉球質(zhì)量進(jìn)行換算，收集的唾液根據(jù)每只小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（25 g）。

1.3 多重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)染色

將包埋的腺體組織進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。首先用分抗CD3（CST 公司，美國）進(jìn)行一抗孵育，隨后用辣根過氧化氫酶偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光二抗進(jìn)行二抗孵育。 采用熒光團共軛的酪酰胺信號放大（tyramide signal amplification, TSA） 分子及擴增試劑（PerkinElmer 公司，美國）進(jìn)行染色和抗體覆蓋。 用抗CD4（CST 公司，美國）再次進(jìn)行一抗孵育，隨后的步驟同前。 染色后的結(jié)果在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 外周血CD4+T 細(xì)胞分選

按照2002 年歐美SS 診斷共識的標(biāo)準(zhǔn)選擇30~60 歲的女性SS 患者17 例，在告知實驗內(nèi)容、簽署知情同意書的情況下，在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔外科對患者進(jìn)行唇腺活檢和血樣本的采集。 所有患者在采樣前均未使用免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)藥物。 另外，在知情同意的情況下，隨機選取同樣年齡區(qū)間女性的外周血作為健康人群對照外周血樣本。 相關(guān)外周血用Ficoll-Paque 淋巴細(xì)胞分離液（GE Healthcare 公司，美國）進(jìn)行密度梯度離心來分離血液樣本中的外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），隨后用人源性CD4 磁珠（美天旎公司，美國）進(jìn)行分選。 相關(guān)研究方案已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：SH9H-2019-T159-2）。 在提取完外周血CD4+T 細(xì)胞后，立刻提取總RNA，隨后進(jìn)行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測。

1.5 唾液腺CD4+T 細(xì)胞分選

將活檢獲取的SS 患者唇腺組織浸泡于4 ℃0.9%氯化鈉溶液內(nèi)，30 min 內(nèi)用無菌剪將其剪成小碎塊，并浸泡在Ⅱ型膠原酶中，用gentleMACS 全自動組織處理器（美天旎公司，美國）進(jìn)行機械消化，消化后的單細(xì)胞懸液用Percoll 密度梯度離心法進(jìn)行初步分層， 純化淋巴細(xì)胞。 隨后用人CD4 磁珠（Stemcell 公司，美國）進(jìn)行陽性分選，在分選后，初步進(jìn)行計數(shù)， 確保細(xì)胞數(shù)大于1×105個。 一般情況下，1 個患者對應(yīng)1 個樣本， 當(dāng)存在患者腺體內(nèi)CD4+T 細(xì)胞數(shù)量不足時，采用數(shù)個患者CD4+T 細(xì)胞合并的方式予以補齊。 隨后用微量RNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，美國）進(jìn)行提取。

1.6 RT-qPCR 檢測

在提取各樣本總RNA 后， 用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后采用SYBR Green 熒光染液（Roche 公司，瑞士）及引物定制（表1）進(jìn)行RT-qPCR 檢測。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 代謝通量分析

各組小鼠淋巴結(jié)和脾組織CD4+T 細(xì)胞經(jīng)研磨后，用鼠源性CD4 磁珠（Stemcell 公司，美國）進(jìn)行分選。 使用XF96 細(xì)胞外代謝分析儀(安捷倫公司，美國) 分析CD4+T 細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR），即糖酵解速率。 將分選后的CD4+T 細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)， 隨后以每孔2×105個的密度接種在涂有Cell-Tak 細(xì)胞黏附劑（Corning 公司，美國） 的Seahorse 96 孔培養(yǎng)板上。 在基礎(chǔ)條件下測定含2 nmmol/L 谷氨酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)液的ECAR 值， 同時在實時條件下測定25 mmol/L葡萄糖、1 μmol/L 寡霉素和50 mmol/L 2-DG 對各組細(xì)細(xì)胞ECAR 值的實時調(diào)控。 本研究選用了7 只10 周齡NOD/Ltj 小鼠和7 只ICR 小鼠進(jìn)行觀察。

對于小鼠的糖酵解速率分析，以添加葡萄糖后的ECAR 值減去添加葡萄糖前的ECAR 值作為該小鼠的糖酵解水平；以添加寡霉素后，尚未添加2-DG 的ECAR 值減去添加2-DG 后的ECAR 值作為該小鼠的糖酵解潛力值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行制圖及統(tǒng)計學(xué)分析。 2 組之前的數(shù)值以t 檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SS 患者浸潤CD4+T 細(xì)胞中存在糖酵解水平亢進(jìn)

本研究摘取SS 患者的部分唇腺樣本后， 經(jīng)過HE 染色確認(rèn)該患者唇腺存在顯著的免疫細(xì)胞浸潤（圖1A、B）。 同期，將新鮮樣本通過組織研磨和Ⅱ型膠原酶消化的方法獲得組織勻漿后，利用MACS 法提取CD4+T 細(xì)胞。RT-qPCR 法檢測了多個糖酵解節(jié)點因子的轉(zhuǎn)錄情況， 并將其與健康人群外周血的CD4+T 細(xì)胞進(jìn)行比對。 結(jié)果顯示，SS 浸潤唾液腺組織中糖酵解節(jié)點分子己糖激酶2（hexokinase 2,HK2）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase M1/2, PKM）的表達(dá)（圖1C、D）出現(xiàn)顯著上升，同時，SS 浸潤唾液腺組織和外周血中，CD4+T 細(xì)胞糖酵解驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子MYC 的表達(dá)也顯著提高（圖1E）。 為此，我們初步判定，CD4+T 細(xì)胞糖酵解在SS 患者唾液腺浸潤組織中，部分糖酵解因子存在轉(zhuǎn)錄水平的亢進(jìn)。

圖1 SS 患者CD4+T 細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因表達(dá)Figure 1 The expression of CD4+T cell glycolysis-related genes in SS patients

2.2 SS 模型小鼠CD4+T 細(xì)胞中糖酵解水平增強

我們隨后檢測了NOD/Ltj 小鼠和對照組ICR小鼠CD4+T 細(xì)胞的ECAR 指標(biāo)，即2 組細(xì)胞的糖酵解水平。 如圖2 所示，與ICR 小鼠相比，NOD/Ltj 小鼠的CD4+T 細(xì)胞相對表現(xiàn)出的糖酵解能力更高。 該結(jié)果進(jìn)一步證實，SS 發(fā)生時，CD4+T 細(xì)胞存在異常的糖酵解亢進(jìn)。

圖2 SS 模型鼠的CD4+T 細(xì)胞呈現(xiàn)出更高水平的糖酵解Figure 2 Higher level of glycolysis in CD4+T cells of SS mice model

2.3 抑制糖酵解減輕了S S 小鼠的疾病進(jìn)程

為了明確抑制糖酵解能否有效治療SS，我們使用糖酵解抑制劑2-DG 處理8 周齡的小鼠。 2-DG 給藥后2 周（10 周齡）和6 周（14 周齡）時，對小鼠進(jìn)行唾液流量檢查， 發(fā)現(xiàn)2-DG 能有效減緩NOD/Ltj小鼠唾液流率的下降（圖3A）。 隨后對小鼠下頜下腺最大橫截面積切片進(jìn)行HE 染色， 根據(jù)淋巴細(xì)胞浸潤灶數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2-DG 處理后，嚴(yán)重淋巴細(xì)胞灶（一個灶內(nèi)有50 個以上的淋巴細(xì)胞）的浸潤數(shù)量明顯下調(diào)（圖3B）。 同時，單個淋巴細(xì)胞浸潤灶中的淋巴細(xì)胞數(shù)量同樣明顯下調(diào)（圖3C）。 以上結(jié)果表明，抑制糖酵解減弱了SS 的疾病進(jìn)程。

圖3 糖酵解抑制劑2-DG 治療能有效緩解SS 疾病癥狀Figure 3 Treatment of 2-DG can effectively attenuate the symptoms of SS

2.4 2-DG 抑制糖酵解可緩解CD4+T 細(xì)胞浸潤及因子分泌

為了進(jìn)一步觀察CD4+T 細(xì)胞的浸潤情況，我們用了mIHC 法對總T 細(xì)胞（CD3+）進(jìn)行紅色熒光標(biāo)記， 而對CD4+T 細(xì)胞用綠色熒光標(biāo)記。 如圖4A 所示，在NOD/Ltj 小鼠中，CD4+T 細(xì)胞是總T 細(xì)胞數(shù)量的主要成分， 這與先前研究對CD4+T 細(xì)胞在SS 疾病中的認(rèn)知相一致。 而經(jīng)2-DG 處理后， 我們發(fā)現(xiàn)CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。 進(jìn)一步對小鼠唾液腺進(jìn)行消化，獲取單細(xì)胞勻漿，觀察CD4+T 細(xì)胞效應(yīng)分化（尤其是Th1 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞）相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情 況。 RT-qPCR 示，Th1 細(xì) 胞 相 關(guān) 指 標(biāo)IFN-γ 和Th17 細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)IL-17 的基因水平在NOD/Ltj 小鼠唾液腺內(nèi)的表達(dá)顯著上調(diào)，而采用2-DG 處理后，IFN-γ 與IL-17 的表達(dá)均有所下調(diào)，其中以IL-17 下調(diào)幅度更為明顯（圖4B）。 因此，我們確定抑制糖酵解可以通過降低浸潤CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量和效應(yīng)分化來減緩疾病的進(jìn)展。

圖4 糖酵解抑制劑2-DG 能有效抑制CD4+T 細(xì)胞浸潤Figure 4 Treatment of 2-DG can effectively inhibit the infiltration of CD4+T cell

3 討論

CD4+T 細(xì)胞的過度激活是SLE、SS 等自身免疫性疾病的共同標(biāo)志。 在激活后， 周期靜止的初始T細(xì)胞迅速進(jìn)行大量克隆擴增，以支持其分化為T 細(xì)胞亞群和分泌細(xì)胞因子。 活化的CD4+T 細(xì)胞可協(xié)調(diào)自身免疫反應(yīng)，如調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，促進(jìn)B 細(xì)胞成熟、定位和抗體的產(chǎn)生[6-7]。 因此，在SS 等自身免疫性疾病的病理過程中， 活化的T 細(xì)胞與靜止的T細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖增加，代謝需求也有所不同。 活化的T 細(xì)胞需在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量ATP，這一過程主要由代謝途徑的改變所支持。 Sharabi 等[13]對免疫細(xì)胞代謝的重要性進(jìn)行排序， 他們認(rèn)為糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝是T 細(xì)胞的主要代謝方式，且在CD4+T 細(xì)胞不同亞型中， 細(xì)胞的主要代謝手段也有所差異。 在介導(dǎo)自身免疫疾病的Th1 和Th17 細(xì)胞亞型中，多數(shù)研究者認(rèn)為，糖代謝（尤其是糖酵解）是支持其效應(yīng)分化和因子分泌的主要代謝手段。在CD4+T 細(xì)胞激活后，存在糖代謝方式從氧化磷酸化向有氧糖酵解轉(zhuǎn)變，這一改變也被稱為“Warburg效應(yīng)”[14-15]。 增強的糖酵解支持對葡萄糖攝取和使用的依賴性增加[16]。許多研究表明，抑制葡萄糖攝取可以顯著抑制T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17-18]。同樣，也有人提出抑制CD4+T 細(xì)胞的葡萄糖代謝可以延緩SLE[9,19-20]，RA[21-22]和自身免疫性腦脊髓炎[19]的進(jìn)展。本研究中，我們初步證明了采用2-DG 抑制糖酵解可以減少浸潤CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量， 減緩SS的進(jìn)展。 這一結(jié)果提示靶向CD4+T 細(xì)胞糖酵解可能為防止SS 和其他自身免疫性疾病的全新手段。

目前， 靶向糖酵解的關(guān)鍵蛋白有PKM2、HK2、GLUT1、PDHK 等，這些蛋白也在許多研究中被證實可以緩解自身免疫疾病。 其中，Koga 等[23]發(fā)現(xiàn)靶向與GLUT1 可有效抑制糖攝取和鈣離子內(nèi)流， 緩解SLE。 Damasecno 等[24]利用PKM2 的小干擾RNA 和抑制劑， 發(fā)現(xiàn)該分子能同時緩解糖酵解和炎癥反饋。 而目前最常用、最公認(rèn)的糖酵解抑制劑依然是本研究中所采用的2-DG。 該抑制劑是一種葡萄糖類似物，同樣被細(xì)胞膜表面葡萄糖轉(zhuǎn)運受體蛋白所識別，并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中，競爭性地被己糖激酶磷酸化，但不能被代謝并積累在細(xì)胞中，從而阻斷糖酵解途徑，導(dǎo)致ATP 耗竭[25]。 目前，該藥物已經(jīng)初步應(yīng)用于抗病毒、抗免疫、抗腫瘤治療的臨床前期研究中[26]。 本研究采用2-DG 對SS 模型鼠進(jìn)行治療，確認(rèn)其能抑制CD4+T 細(xì)胞的異常糖代謝亢進(jìn)，從而減弱CD4+T 細(xì)胞異常浸潤及功能發(fā)揮。 但在后續(xù)的研究中，我們依舊需要明確其潛在的副作用，以進(jìn)一步支持該藥物的后續(xù)臨床靶向研發(fā)。

綜上所述，我們的研究表明， SS 患者及相關(guān)模型動物的CD4+T 細(xì)胞中存在一定水平的糖酵解亢進(jìn)。采用糖酵解抑制劑2-DG 對SS 模式動物進(jìn)行治療可以減弱CD4+T 細(xì)胞的異常浸潤和因子表達(dá)，緩解SS 樣自身免疫反應(yīng)。