毛竹基因組中熱激蛋白HSP90基因家族的鑒定與分析

Andrea Chen(陳思睿)

(St.Aidan′s Anglican Girls′ School，Brisbane，Queensland 4075)

毛竹(Phyllostachysedulis)屬禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠單子葉植物，廣泛分布于北緯25°—30°之間400～800 m的丘陵、低山山麓地帶，耐貧瘠、高溫干旱，但不耐寒。與同科農(nóng)作物相比，毛竹具有比較強的抗非生物脅迫能力。一般來講，植物抗逆強弱由自身攜帶的基因來決定。

植物熱激蛋白(heat shock protein，HSP)是在植物遭遇非生物脅迫時，激活并能大量產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)；是廣泛存在于各種生物體內(nèi)、進化上高度保守的蛋白質(zhì)[1]。根據(jù)分子量大小，熱激蛋白可分為 5 個家族：即sHSP(小分子熱激蛋白)、HSP60、HSP70、HSP90、HSP100[2-4]。HSP90蛋白是一類正常細(xì)胞中不可缺少的蛋白質(zhì)，包含3個區(qū)域：含有ATP結(jié)合和水解位點的N末端，中部區(qū)域和包含二聚化作用區(qū)域的C末端結(jié)構(gòu)域，其中ATP酶活性是HSP90蛋白發(fā)揮生物功能所必需的[5]。HSP90蛋白參與調(diào)控多種蛋白的調(diào)控和維持蛋白正常構(gòu)型，并參與細(xì)胞的抗逆活動[6-7]。真核生物中的HSP90s屬于持家蛋白，含量較高，約占總蛋白的1%～2%[8]，在高溫脅迫時，比例迅速升至4%～6%[9]。

本研究利用多種生物信息學(xué)工具鑒定毛竹HSP90基因家族成員，分析家族各成員的特征、進化關(guān)系及表達特征，以期為更深入研究HSP90基因的生物學(xué)功能及挖掘毛竹的優(yōu)良基因資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從毛竹基因組、蛋白數(shù)據(jù)庫(http：//202.127.18.221/bamboo/down.php)中下載毛竹全基因組序列、cDNA序列及氨基酸序列，構(gòu)建本地blast數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 毛竹HSP90基因家族序列的獲得 從Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫中(http：//pfam.xfam.org/)下載與PF00183.18和PF02518.26 結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的HMM圖譜，e-value≤1e-10。以單子葉植物水稻(Oryzasativa)的所有HSP90基因家族氨基酸序列為誘餌，通過blastp和隱藏馬爾科夫模型(HMM)方法對毛竹基因組中的HSP90基因進行篩選。

1.2.2 毛竹HSP90基因家族理化性質(zhì)分析 通過在線網(wǎng)站Expasy的ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)分析毛竹HSP90基因家族成員分子量，理論等電點、親疏水性等理化性質(zhì)，通過ProtComp 9.0在線分析工具(http：//linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group= programs&subgroup=proloc)對HSP90蛋白進行亞細(xì)胞定位預(yù)測，通過SignalP-5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/cgi-bin)預(yù)測蛋白是否具有信號肽。

1.2.3 毛竹HSP90基因家族系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析 從水稻和擬南芥(Arabidopsis)數(shù)據(jù)庫中篩選具有PF00183.18和PF02518.26結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，分別通過ClustalW多重比對，用MEGA 7.0(http：//www.megasoftware.net)軟件鄰位連接(Neighbor-Joining，NJ)法構(gòu)建毛竹和其它物種中HSP90基因家族系統(tǒng)進化樹，自檢值取1000次抽樣。利用毛竹基因組位置注釋文件，使用TBtools繪制毛竹HSP90家族基因結(jié)構(gòu)圖及scaffold定位圖。利用在線網(wǎng)站NCBI Conserved Domain(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和MEME(http：//meme.sdsc.edu/meme/meme-intro.html)預(yù)測HSP90家族基因保守域和基序，并提交到TBtools繪制。

1.2.4 共線性分析 利用TBtools軟件對毛竹基因組所有氨基酸進行序列比對，并將毛竹基因組蛋白序列與水稻基因組氨基酸序列成對比對，利用MCScanX獲得毛竹基因家族共線性關(guān)系，并用Circos對結(jié)果進行可視化。

1.2.5 毛竹HSP90基因家族順式響應(yīng)元件分析 從毛竹數(shù)據(jù)庫中下載全基因組序列，構(gòu)建本地Blast 數(shù)據(jù)庫，以已獲得的完整的毛竹HSP90基因家族cDNA序列進行本地Blast搜索，分析毛竹11個HSP90基因與上游基因之間的間距，對于間距大于2000 bp的HSP90基因，獲取翻譯起始密碼子上游2000 bp序列，剔除長度小于2000 bp的序列，所獲序列用于順式作用元件預(yù)測。利用Plant CARE database(plant cis-acting regulatory element database，http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools /plantcare/ html/)對所獲啟動子序列上的順式調(diào)控元件進行分析。預(yù)測所得的順式作用元件按功能進行分類。

1.2.6 組織特異性表達 從毛竹數(shù)據(jù)庫[10]中下載毛竹不同組織，包括根、葉、鞭、花序1(早期花序)、花序2(花期花序)、莖20(20 cm長的筍芽頂部)、莖50(50 cm長的筍芽頂部)的7個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，繪制各組織中HSP90家族成員的表達熱圖。

同時，采集30 d的毛竹幼苗的根、莖、葉，液氮速凍，5株為1次重復(fù)，共3次重復(fù)。使用天根公司RNAprep Pure 植物總 RNA提取試劑盒提取RNA，用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈，用在線工具Primer 3.0(http：//primer3.ut.ee/)設(shè)計特異性引物(表1)。

表1 特異性引物

熒光定量PCR擴增體系為10 μL，包括2×SYBR Premix ExTaqTMII 5μL，正反向引物(10 μM)各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。熒光定量PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt方法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹HSP90基因家族成員序列分析

以水稻8條完整的HSP90基因序列為種子序列，通過本地Blastp和hmmsearch搜索，共獲得16條毛竹HSP90基因的氨基酸序列，通過在線pfam搜索軟件，確認(rèn)11個成員序列既含有N端的ATP酶結(jié)構(gòu)域，又含有HSP90結(jié)構(gòu)域。需要說明的是：雖然4個成員(PH02Gene07542、PH02Gene09089、PH02Gene17689、PH02Gene45866)的分子量均小于50 kD，但由于均含有ATP酶結(jié)構(gòu)域和HSP90結(jié)構(gòu)域，后續(xù)一并進行分析。11個成員的基本信息見表2，11個成員的多肽鏈長度從356(PH02Gene17689)～806 aa(PH02Gene31917)不等；分子量介于39.63～92.42 kD；脂肪指數(shù)介于78.86(PH02Gene48597)～85.48(PH02Gene17689)之間；等電點范圍為4.56(PH02Gene17689)～5.31(PH02Gene39947)，11個毛竹HSP90蛋白均為酸性蛋白(pI<7.0)。4個HSP90的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，表明毛竹中這4個HSP90屬于穩(wěn)定蛋白，而另外7個屬于不穩(wěn)定蛋白。親水性總平均值均為負(fù)值，表明11個HSP90蛋白均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位顯示，分子量小于50 kD的4個成員定位在細(xì)胞質(zhì)，而其它7個成員定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。另外，11個HSP90蛋白均不含跨膜結(jié)構(gòu)，只有PH02Gene31917包含有典型的信號肽序列。PH02Gene37282和PH02Gene31917包含有駐留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的KDEL短肽。

表2 11個毛竹HSP90成員信息

2.2 毛竹HSP90家族基因的結(jié)構(gòu)

毛竹家族成員的基因結(jié)構(gòu)存在明顯差異，所含外顯子數(shù)5～20個，其中分子量低于50 kD的4個基因含有5個外顯子，結(jié)構(gòu)相對簡單；其它7個大分子量的基因含有15～20個外顯子，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜(圖1)。

圖1 毛竹HSP90基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及結(jié)構(gòu)

2.3 毛竹HSP90基因家族的scaffold定位

從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫獲得HSP90家族成員的位置以及在scaffold上的信息。從圖2可知，11個毛竹HSP90基因分布在9條scaffold上，較為分散。其中scaffold 3和scaffold 22上各分布有2條，且每2條之間的距離非常接近，不過分布在同一scaffold上的2個基因結(jié)構(gòu)不一致，進化上也分屬于不同的group組，表明同一scaffold上的2個HSP90基因不是基因復(fù)制而來的。

圖2 毛竹HSP90基因家族成員在scaffold上的分布

2.4 毛竹HSP90家族成員蛋白保守基序的預(yù)測

毛竹HSP90家族成員中，6個成員的蛋白序列共含5個保守基序(圖3)，每個基序含40～50個氨基酸(表3)。4個成員的蛋白序列含4個保守基序，缺乏Motif 5。另外1個成員也含4個保守基序，但缺乏Motif 2。11個成員均含有Motif 1、Motif 3、Motif 4 3個保守基序，從pfam注釋來看，motif 3、motif 4被注釋為HATPase_c，而motif 1被注釋為HSP90。以上結(jié)果表明毛竹HSP90家族成員的功能可能發(fā)生了分化。

表3 毛竹HSP90家族蛋白的基序組成

圖3 毛竹HSP90家族成員蛋白保守基序的預(yù)測

2.5 毛竹HSP90家族成員及其它植物中該家族成員的聚類分析

以擬南芥、水稻、毛竹的26個HSP90家族成員的氨基酸序列構(gòu)建了無根系統(tǒng)進化樹(圖4)。結(jié)果顯示：26個成員被分為3組：Group A中包含5個毛竹HSP90家族成員，Group B中包含2個含15個外顯子的HSP90家族成員，而4個結(jié)構(gòu)簡單、分子量小的HSP90家族成員均聚在Group C組，表明結(jié)構(gòu)類似的毛竹HSP90基因在進化上更接近，推測功能也更相近。另外，Group A和B組的毛竹HSP90基因具有倍增的現(xiàn)象。從進化樹來看，毛竹HSP90與水稻HSP90更為接近。

圖4 擬南芥、水稻、毛竹中HSP90蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.6 毛竹HSP90家族成員的共線性分析

直系同源基因?qū)梢蕴峁┯嘘P(guān)物種之間進化關(guān)系的有效信息。水稻與毛竹HSP90家族成員間的共線性分析表明：7個水稻HSP90基因與10個毛竹HSP90基因有共線性關(guān)系(圖5)。僅1個毛竹的HSP90基因PH02Gene09089與水稻HSP90基因間無直系同源關(guān)系，表明該基因是毛竹中特有的。

圖5 毛竹與水稻HSP90家族的共線性分析

2.7 毛竹HSP90家族基因的啟動子分析

截取ATG上游2 kb的序列用于分析啟動子中的順式作用元件，結(jié)果顯示，除了基本的啟動子結(jié)構(gòu)元件，如TATA box和CAAT box外，HSP90家族成員的啟動子序列上還存在13個與逆境脅迫相關(guān)的順式元件及其它順式作用元件。每個成員啟動子上的順式作用元件見圖6。每個啟動子上都含有光相關(guān)的順式作用元件，如G-box和MRE等。在所有11個成員的順式作用元件中，與激素(如茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素、生長素和水楊酸)相關(guān)的順式作用元件約占一半(46.1%)；其次是與光相關(guān)的順式作用元件，占到五分之二；與各種逆境脅迫(如無氧脅迫、干旱脅迫及其他防御脅迫)相關(guān)的順式作用元件占8.1%。另外，與各組織(如分生組織及胚乳)相關(guān)的順式作用元件也有被鑒定到。雖然各成員中都包含光相關(guān)及激素相關(guān)的元件，但每個成員的順式作用元件仍存在差別，如晝夜節(jié)律相關(guān)的元件僅存在于2個成員的啟動子中，也說明了毛竹11個HSP90成員的功能發(fā)生了變化。

圖6 毛竹HSP90基因家族成員啟動子上順式作用元件的分布

2.8 毛竹HSP90家族成員的組織特異性表達分析

基于已發(fā)表的毛竹不同組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[10]，繪制了毛竹HSP90基因家族各成員的組織特異性表達圖譜熱圖(圖7A)。結(jié)果表明，在自然條件下，6個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因，包括PH02Gene05953、PH02Gene48597、PH02Gene39947、PH02Gene37282、PH02Gene21535、PH02Gene01254，在各組織中的表達量非常微弱，而4個結(jié)構(gòu)相對簡單的基因在花序中表達強烈，在其它組織中表達較弱，表現(xiàn)出強烈的組織特異性表達模式。RT-PCR的檢測結(jié)果(圖7B)也證實：6個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因在幼苗期的組織中幾乎檢測不到表達(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，而4個結(jié)構(gòu)相對簡單的基因表現(xiàn)出明顯的組織特異性表達模式。值得關(guān)注的是，組織特異性表達模式與聚類分析及基因結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很強的關(guān)聯(lián)性。

圖7 毛竹HSP90基因家族成員在不同組織中的表達量

3 討論

在原核與真核生物中，HSP90是一類高度保守的分子伴侶蛋白，廣泛參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞周期及其它重要的生物學(xué)過程[12]。目前，在動物和真菌中，HSP90的功能已被廣泛報道，而植物中的報道相對落后。隨著多種植物基因組序列的公布，一些模式植物，如擬南芥[13]、水稻[14]，一些重要的蔬菜作物，如番茄(Solanumlycopersicum)[15]、辣椒[16](Capsicumannuum)、黃瓜[17](Cucumissativus)中的HSP90基因家族相繼被報道。

毛竹是一種廣泛分布在南方的亞熱帶經(jīng)濟樹種，其基因組已被測序2次，該數(shù)據(jù)的釋放有利于深入分析在逆境中起重要作用的HSP90基因家族，為進一步深入探索毛竹抗逆特性提供理論依據(jù)。本文從毛竹基因組中共鑒定出11個HSP90家族基因，比模式植物擬南芥[13](7個)、水稻[14](9個)、楊樹(Populus)[18](10個)多，比地中海橄欖樹[19](Oleaeuropaeasubsp.Europaea，12個)少，HSP90成員個數(shù)可能與物種的抗逆性有一定相關(guān)性。多數(shù)二倍體的葫蘆科作物含5～7個HSP90成員，而四倍體的筍瓜(Cucurbitamaxima)含10個HSP90成員[17]，毛竹中HSP90成員的個數(shù)與四倍體筍瓜的個數(shù)最接近。理化特性分析顯示毛竹中HSP90成員均為酸性蛋白，這與擬南芥、水稻、楊樹和番茄中的研究結(jié)果相吻合，表明植物中HSP90的理化特性非常保守。同時，本文中鑒定到的3對HSP90旁系同源基因分別位于不同的scaffold上，表明毛竹中HSP90基因的擴張主要是由于區(qū)域重復(fù)導(dǎo)致的。進化樹和表達量的結(jié)果顯示，毛竹中結(jié)構(gòu)相似的HSP90成員聚在一組，且結(jié)構(gòu)相似的基因表達特性非常相似，表明進化不僅影響了毛竹HSP90成員的功能，也影響了其結(jié)構(gòu)[20-21]。闡明毛竹HSP90家族成員在各種逆境脅迫以及生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能還需要大量的直接證據(jù)佐證。